CN106305415B - 一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法 - Google Patents

一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法，包括步骤如下：利用双氧水消毒处理棉花种子半小时，在超净台用灭菌水洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，取所得无菌幼苗的下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染后用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，黑暗条件下共培养48小时后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，置于单色红光下，16小时红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1‑2个月；待愈伤生长约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，直至形成胚型愈伤.本发明可有效加快棉花愈伤生长，同时降低了愈伤硬化和变绿。

Description

一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法
技术领域
本发明涉及棉花组织培育领域，具体涉及一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法。
背景技术
在棉花组织培育技术中，棉花愈伤培育是实现农杆菌侵染或基因枪转基因后体细胞培育第一个关键步骤，该技术决定着棉花愈伤形成的效率的高低，直接影响后续幼苗诱导形成、植株发育等试验阶段。
因此，在组织培育中，提高棉花愈伤诱导增殖有利于缩短棉花再生植株培育时间。在试验过程中，棉花通过组织培育技术多用于利用转基因棉花的植株再生，目的是将外源目的基因转入常规棉花中，从而培育具有目的基因的棉花新种质资源，其常规组织培养方法为：培育棉花无菌苗，下胚轴切成1厘米的小段，利用携带外源目的基因的农杆菌侵染受体棉花下胚轴，或者非侵染的下胚轴。共培养后放入愈伤诱导培养基，愈伤分化成胚状体即胚性愈伤，胚性愈伤分化生成再生株，再生株移植等环节。其中，在整个愈伤培养过程中，愈伤生长增殖是组织培养的重要环节，该环节直接决定试验过程中愈伤继代时间和次数，以及后续分化诱导等试验进程。
其常规愈伤继代方法为：下胚轴放入愈伤诱导培养基后，在16小时白光光照，8小时黑暗条件下，恒温28度，诱导下胚轴愈伤生长，期间根据培养基中养分的消耗，每2-3月换一次愈伤诱导培养基，增殖期间则培养基换2次/月，直至愈伤生长到一定大小后，取下愈伤继续培养直至有胚性愈伤出现后诱导分化，该时间一般为8个月以上，甚至1年以上，因此愈伤诱导在棉花组织培养中是时间花费最长的一个阶段。期间愈伤由于长时间光照容易变绿色，并造成愈伤硬化和生长较慢。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法，其可有效加快棉花愈伤生长，同时降低了愈伤硬化和变绿。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法，包括步骤如下：
S1、利用质量百分比为15％的双氧水(过氧化氢)消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；
S2、取所得无菌幼苗的下胚轴，切段1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时；
S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L，2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为660nm，光照强度为200-400勒克斯的单色红光下，16小时红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜愈伤诱导培养基；
S4、待愈伤生长黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，直至形成胚性愈伤。在整个愈伤诱导期间进行统计愈伤诱导的生长效率及观测愈伤颜色变化并比较。
本发明具有以下有益效果：
加快棉花愈伤生长，同时降低了愈伤硬化和变绿。
表1 不同光条件下不同时间内愈伤诱导生长效率及变绿初步统计
注：期间淘汰抗性筛选条件下无愈伤生长的茎段。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法，包括步骤如下：
S1、利用质量百分比为15％的双氧水(过氧化氢)消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；
S2、取所得无菌幼苗的下胚轴，切段1厘米，利用含有基因载体的农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS 4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时；
S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为660nm，光照强度为200-400勒克斯的单色红光下，16小时红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜愈伤诱导培养基；
S4、待愈伤生长黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，直至形成胚性愈伤。在整个愈伤诱导期间进行统计愈伤诱导的生长效率及观测愈伤颜色变化并比较。
实施例1
已转phyB-RNAi基因为例：
S1、利用15％双氧水过氧化氢消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；
S2、取所得无菌幼苗的下胚轴，切段1厘米，利用含有phyB-RNAi基因载体的农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时；
S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为660nm，光照强度为200-400勒克斯的单色红光下，16小时单色红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜愈伤诱导培养基；
S4、待愈伤生长黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，直至形成胚性愈伤。在整个愈伤诱导期间进行统计愈伤诱导的生长效率及观测愈伤颜色变化并比较。
实施例2
已转P105载体基因为例：
S1、利用质量百分比为15％的双氧水过氧化氢消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；
S2、取所得无菌幼苗的下胚轴，切段1厘米，利用含有P105基因载体的农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时；
S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为660nm，光照强度为200-400勒克斯的单色红光下，16小时单色红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜愈伤诱导培养基；
S4、待愈伤生长黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，直至形成胚性愈伤。在整个愈伤诱导期间进行统计愈伤诱导的生长效率及观测愈伤颜色变化并比较。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法，其特征在于，包括步骤如下：
S1、利用质量百分比为15％双氧水消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，室温条件下，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；
S2、取所得无菌幼苗的下胚轴，切段1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，该培养基为常规培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时；
S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为660nm，光照强度为200-400勒克斯的单色红光下，16小时红光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜愈伤诱导培养基；
S4、待愈伤生长黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，直至形成胚性愈伤。
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