CN108476981A - 一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法。选取香蕉未成熟雄花愈伤组织为辐射突变材料，采用含有不同浓度镰刀菌FOR4粗毒素培养基进行香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选、分化芽粗毒素筛选、香蕉生根苗粗毒素筛选等，采用三次毒素胁迫筛选技术，增强了筛选压力，提高了抗枯萎病突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗枯萎病种质筛选时间，提高抗病育种的效率。
Description
技术领域
本发明属于香蕉愈伤组织辐射诱变育种领域，具体涉及一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法。
背景技术
香蕉是典型的热带亚热带果树,广泛分布于热带和南亚热带地区。我国是世界香蕉主产国之一，种植区域分布于广东、海南、广西、福建、云南及台湾等省区，栽培面积和产量居全国水果的第四位。然而，香蕉产业迅猛发展的同时，正遭遇有史以来枯萎病最严重的威胁和挑战。
香蕉枯萎病，又称巴拿马病、黄叶病，是由尖镰孢古巴专化型[Fusariumoxysporumf.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hasen，Foc]侵染引起的土传维管束系统性的病害，侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤，一旦发病就会全株死亡，病菌蔓延快，很难根治。本世纪以来，广东、海南、福建等地的香蕉栽培面积却因巴拿马枯萎病的泛滥大幅度减小。据不完全统计，广东、海南等地的主要香蕉产区香蕉枯萎病的影响面积达18万公顷。与2010年相比，2013年海南的香蕉栽培面积几乎减少50％，云南和广西香蕉也开始大面积突发黄叶病。与香蕉产业遭受严重枯萎病危害相对应的，是对香蕉枯萎病发病机制的研究有限，世界范围内还无抗枯萎病的新品种和有效防治措施。因此，培育抗香蕉枯萎病的新品种是遏制枯萎病蔓延，促进香蕉产业健康可持续发展的根本途径。由于目前栽培的香蕉大部分是三倍体，单性结实,具有高度的不育性，无法通过常规杂交选育抗枯萎病新品种，因此利用60Co-γ射线辐射诱变香蕉，培育香蕉突变体，从突变体中筛选具有抗枯萎病突变的新种质，再培育获得新品种是香蕉抗枯萎病育种的重要途径之一。
目前国内外对香蕉辐射诱变进行抗枯萎病育种研究报道文献较少，在辐射诱变材料的选择上主要采用香蕉吸芽、香蕉组培芽或者香蕉幼苗，其方法主要缺点在于需要处理的突变材料多，筛选周期长、效率低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法，选取香蕉未成熟雄花愈伤组织为辐射突变材料，采用愈伤组织镰刀菌粗毒素筛选、分化芽粗毒素筛选、香蕉生根苗粗毒素筛选的三次镰刀菌粗毒素筛选技术，提高了抗枯萎病突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗枯萎病品种的周期。
本发明的第一个方面是提供一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法，包括以下步骤：
(1)粗毒素制备
将Foc4菌种接种至培养基中培养，分离得到香蕉枯萎病菌粗毒素(下文简称“粗毒素”)；
(2)香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理
对香蕉未成熟雄花愈伤组织进行辐射处理，然后置于人工气候箱进行黑暗培养，使辐射后的愈伤组织恢复生长；
(3)香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选
将恢复生长的辐射后的愈伤组织转至光照培养箱中培养12-18天后，转移到含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基中培养28-32天；
选择成活的愈伤组织转移至愈伤组织继代培养基中进行继代培养28-32天，定期更换培养基；
然后将愈伤组织接种于分化固体培养基上，诱导愈伤组织分化出芽；
(4)分化芽粗毒素筛选
分化培养的幼芽长至约0.5cm时，将幼芽转移至含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基上培养；
(5)香蕉生根苗粗毒素筛选
选择步骤(4)后成活的分化幼芽转移至含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基中培养35-45天，然后选择生长健壮、根系发育良好的抗病突变苗转移至营养土种植培养，幼苗长至5片新叶时移栽至种质圃保存。
其中，步骤(1)中的制备粗毒素的培养基可以为任何能够培养Foc4菌种产生粗毒素的培养基。但在本发明中，对香蕉枯萎病菌产毒的培养条件进行优化，发现Czaper液体培养基比较适合香蕉枯萎病病菌产生毒素。
优选地，步骤(1)的具体步骤为：将Foc4菌种接种于Czaper液体培养基中，27℃、120r/min，振荡培养10-20天，除菌处理，得到香蕉枯萎病菌粗毒素。
其中，步骤(2)的辐射处理只要能够使香蕉雄花愈伤组织产生变异即可，本发明对此不作特别的限定。但在本发明的一个优选的实施方式中，辐射处理条件为：香蕉雄花愈伤组织以钴60为辐照源，吸收剂量率为1.5Gy/min，最终吸收剂量为60Gy。
其中，步骤(3)的培养条件(温度、光照强度、光周期等)本领域技术人员可根据经验进行选择，但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(3)的培养条件为：温度25℃，光照强度1000lx，光周期为光照10小时/黑暗14小时。
其中，步骤(3)中生长培养基可以为常用的香蕉愈伤组织生长培养基，只要含有30μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(3)中含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基为：含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+1.5mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/LZeatin+40g/L蔗糖+6.0g/L琼脂固体培养基，且pH＝5.5。
其中，步骤(3)中愈伤组织继代培养基可以为常用的香蕉愈伤组织继代培养基。但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(3)中愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基，且pH＝5.3。
其中，步骤(3)中分化固体培养基可以为常用的香蕉愈伤组织分化固体培养基。但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(3)中分化固体培养基为MMS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
其中，步骤(4)的培养条件(温度、光照强度、光周期等)本领域技术人员可根据经验进行选择，但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(4)中的培养条件为：温度25℃，光照强度1000lx，光周期为光照10小时/黑暗14小时。
其中，步骤(4)中分化培养基可以为常用的香蕉幼芽分化培养基，只要含有30μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(4)中含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基为含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
其中，步骤(5)的培养条件(温度、光照强度、光周期等)本领域技术人员可根据经验进行选择，但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(5)中的培养条件为：温度25℃，光照强度1500lx，光周期为光照12小时/黑暗12小时。
其中，步骤(5)中生根培养基可以为常用的香蕉分化幼芽生根培养基，只要含有100μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，步骤(5)中含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基为含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+2mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
本发明的第二个方面是提供一种用于筛选抗枯萎病香蕉种质的培养基组，包括：含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基，含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基，以及含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基。
其中，所述生长培养基可以为常用的香蕉愈伤组织生长培养基，只要含有30μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，所述含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基为：含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+1.5mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+6.0g/L琼脂固体培养基，且pH＝5.5。
其中，所述分化培养基可以为常用的香蕉幼芽分化培养基，只要含有30μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，所述含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基为含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
其中，所述生根培养基可以为常用的香蕉分化幼芽生根培养基，只要含有100μg/ml粗毒素即可。但在本发明一个优选的实施方式中，所述含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基为含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+2mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
进一步地，所述培养基组还可以包括愈伤组织继代培养基、分化固体培养基等。
其中，所述愈伤组织继代培养基可以为常用的香蕉愈伤组织继代培养基。但在本发明一个优选的实施方式中，所述愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基，且pH＝5.3。
其中，所述分化固体培养基可以为常用的香蕉愈伤组织分化固体培养基。但在本发明一个优选的实施方式中，所述分化固体培养基为MMS+3.5mg/LBA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
本发明选取香蕉未成熟雄花愈伤组织为辐射突变材料，优化筛选条件，采用含有不同浓度镰刀菌FOR4粗毒素培养基进行香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选、分化芽粗毒素筛选、香蕉生根苗粗毒素筛选等，采用三次毒素胁迫筛选技术，增强了筛选压力，提高了抗枯萎病突变种质的筛选效率，缩短了培育香蕉抗枯萎病种质筛选时间，提高抗病育种的效率。
附图说明
图1为香蕉镰刀菌Foc4粗毒素制备结果，其中，A为固体培养基培养Foc4菌，B为Czaper液体培养基培养Foc4菌，C为过滤制备粗毒素，D为粗毒素含量测量定结果图。
图2为不同浓度香蕉镰刀菌Foc4粗毒素愈伤组织筛选结果，其中，A：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为120μg/ml，B：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为90μg/ml，C：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为60μg/ml，D：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为30μg/ml，E：不同浓度胁迫下愈伤组织死亡率。
图3为不同浓度香蕉镰刀菌Foc4粗毒素生根筛选结果，其中，A：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为100μg/ml，B：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为60μg/ml，C：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为40μg/ml，D：香蕉镰刀菌Foc4粗毒素浓度为20μg/ml，E：不同浓度胁迫下幼芽生长结果。
图4为用Foc4菌液处理12天后不同品种与突变株根性即球茎生长情况，其中，A和E分别为巴西蕉根和球茎切面，B和F分别为宝岛蕉根和球茎切面，C和G分别为突变1号根和球茎切面，D和H分别为突变2号根和球茎切面。
图5为Foc4菌液处理后不同品种与突变株酶活性测定结果。
图6为Foc4菌液处理后不同品种与突变株幼苗抗病基因表达分析结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
1.材料
中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉生物技术研究组提供香蕉未成熟雄花愈伤组织。
2.粗毒素的制备
香蕉枯萎病病菌产毒条件的培养优化。使用了PDA，YPD和Czaper液体培养基，证明在PDA培养基中产毒素的产量较低，YPD液体培养基比较适合培养枯萎病病菌孢子的生长，Czaper液体培养基比较适合香蕉枯萎病病菌产生毒素。
将Foc4菌种接种于Czaper液体培养基的三角瓶中,置于控温摇床上。培养条件设定为27℃、120r/min，振荡培养15天，培养基中布满菌丝体，用两层纱布滤去菌丝，取滤液经5000r/min离心20min,取上清液经45℃减压浓缩至原体积的1/10后再用5000r/min离心20min,取上清液无菌过滤,过滤液即为毒素液，4℃保存备用。以美国SIGMA公司生产的质量分数为99.7％镰刀菌酸作为标样，测出分离的香蕉枯萎病菌粗毒素浓缩液达到6845.32μg/ml，用于抗病筛选(图1)。
3.镰刀菌FOR4粗毒素处理浓度筛选
将浓度分别为10、30、60、90、120μg/ml的粗毒素分别加入愈伤组织及分化芽的培养基中，20天后统计愈伤组织的死亡率，以半致死率的毒素浓度作为大量筛选的选择压力。结果证明使用粗制毒素浓度为30μg/ml时，香蕉愈伤组织致死率为48.93％；接近半致死选择标准，确定香蕉雄花愈伤组织诱导的毒素筛选浓度为30μg/ml(图2)，使用粗制毒素浓度为30μg/ml时，香蕉分化芽致死率接近半致死选择标准，确定香蕉雄花分化芽诱导的毒素筛选浓度为30μg/ml。
在香蕉组培苗生根培养阶段向培养基中分别添加浓度为20、40、60、80、100μg/ml剂量的粗制毒素，观察不同浓度下的生根及发病情况。14天左右各浓度均出现发病情况，发病率与粗毒素浓度成正比，培养21天后100μg/ml全部发病，其他浓度发病率增加。培养35天后粗毒素浓度为100μg/ml时，幼苗基本不能生长出根系，假茎和叶片全部发黄枯死。因此，生根粗制毒素筛浓度定为100μg/ml(图3)。
4.蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理
对香蕉未成熟雄花愈伤组织进行辐射处理(香蕉雄花愈伤组织以钴60为辐照源，吸收剂量率为1.5Gy/min，最终吸收剂量为60Gy。)，经过辐射处理的愈伤组织放置在25℃人工气候箱进行黑暗培养，使辐射后愈伤组织恢复生长。
5.香蕉未成熟雄花愈伤组织镰刀菌粗毒素筛选
恢复生长的愈伤组织转至光照培养箱，培养条件为温度25℃、光照强度1000lx，光周期为光照10小时/黑暗14小时(下同)。培养15天后将愈伤组织转移到含有30μg/ml粗毒素的生长培养基(MS+1.5mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+6.0g/L琼脂的固体培养基，且pH＝5.5)中，进行抗枯萎病筛选。在25℃光照培养箱中培养30天，选择成活的愈伤组织进行继代培养。愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂pH＝5.3的固体培养基，每10天更换一次培养基。
经过继代培养30天后，将愈伤组织接种于pH＝5.8，MS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的分化固体培养基上(培养条件同上)，诱导愈伤组织分化出芽。
6.分化芽粗毒素筛选
分化培养的幼芽长至0.5cm长时，将幼芽转至加有30μg/ml粗毒素的pH＝5.8，MS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的分化培养基上培养(培养条件同上)，进行抗枯萎病筛选。
7.香蕉生根苗粗毒素筛选
将粗毒素筛选的分化幼芽转入加有100μg/ml粗毒素的生根培养基中(pH＝5.8，MS+2mg/LNAA++30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂)，进行抗枯萎病筛选。培养条件为培养条件为温度25℃、光照强度1500lx，光周期为光照12小时/黑暗12小时。35-45天选择生长健壮、根系发育良好的抗病突变苗转至营养土种植培养，幼苗长至5片新叶是移栽至种质圃保存，以供进一步综合性状鉴定和评估。
8.香蕉抗枯萎病生根苗移栽
打开经粗毒素筛选的香蕉抗枯萎病生根苗瓶盖，置于常温、自然光下炼苗3天，练苗后洗净根部培养基，移栽于椰糠∶壤土＝1∶2、并添加5％腐熟有机肥的营养袋中，大棚育苗2.5个月。
9.香蕉抗枯萎病幼苗根苗抗病性观察和抗病指标测定
①株高与叶片数测定
株高与叶片数是鉴定香蕉幼苗生长状态的重要指标。香蕉抗枯萎病苗移栽2个月后测量平均株高为9.30厘米，平均叶片数为7.33片。没经历粗毒素筛选的对照香蕉苗移栽2个月后测量平均株高为19.89厘米，平均叶片数为9.01片，说明筛选出的抗枯萎病苗生长速度比对照稍慢。
②抗枯萎病苗镰刀菌侵染后根系形态变化
选取五叶一心的香蕉2个粗毒素筛选的抗病突变株幼苗，以感病品种巴西蕉和抗病品种宝岛蕉同龄苗为对照接种香蕉镰刀菌FOC4，FOC4接种处理12天，观察巴西蕉、宝岛蕉、突变1号和突变2号根系、球茎生长，结果显示巴西蕉根系变黑，球茎心部变褐；而宝岛蕉、突变1号和突变2号植株根系生长正常，没有变黑现象，球茎也未出现褐变(图4)。
③接种FOC4后生理生化指标的测定
活性氧的产生是植物抗病早期的反应之一，在植物受到病原侵害后体内活性氧快速且大量生成，以启动相应的保护机制提高植物的抗病性。测定植物在病原菌侵染后体内各种酶活性的变化，是判断它们是否具有抗病性的重要依据。我们用香蕉镰刀菌Foc4侵染突变1号、突变2号、宝岛蕉和巴西蕉，测定活性氧代谢途径过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。
FOC4病菌接种后，过氧化物酶的活性变化在突变1号、突变2号、宝岛蕉和巴西蕉品种之间差异不显著。过氧化氢酶在突变1号和突变2号株系侵染Foc4后酶活性始终保持着较高活性水平，且显著高于宝岛蕉和巴西蕉。超氧化物歧化酶活性的变化与过氧化氢酶基本一致，在整个侵染过程中突变1号和突变2号均保持一个较高的酶活水平，并显著高于宝岛蕉和巴西蕉(图5)。
抗病1号和抗病2号株系上述结果说明通过辐射诱变选育出的2个抗病株系，它们在镰刀菌Foc4侵染后，激活了体内的活性氧代谢途径，通过体内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的改变，在植物体内过多活性氧的清除和维持活性氧保持正常水平起着重要作用，从而赋予植株具有较强的抗病性。
④抗病相关重要功能基因表达分析
利用Foc4菌液侵染香蕉巴西蕉、宝岛蕉、突变1号和突变2号等4个品种(株系)的幼苗，取侵染后2、4、6天幼苗根系及没有Foc4侵染的巴西蕉幼苗根系提取总RNA，反转录cDNA用于检测相关基因的表达。根据已有文献报道，选取了植物系统获得性抗性相关的基因9个，它们是抗坏血酸氧化酶基因(MaASO)、单脱氢抗坏血酸酶基因(MaMDHA)、谷胱甘肽过氧化物酶基因(MaGPX)、过氧化物酶基因(MaPOD)、过氧化氢酶基因(MaCAT)、苯丙氨酸解氨酶基因(MaPAL)、肉桂酸4-羟基裂解酶基因(MaC4H2)、病程相关蛋白(MaPR)、转录因子TAG(MaTAG)，利用qPCR方法分析了这9个基因的表达特性。结果显示，Foc4侵染后2个抗病突变株与对照巴西蕉相比，这9个基因的表达均呈现出显著地增强(图6)。说明2个抗病株系具有更强的系统获得性抗性产生的能力。而这种能力是由其体内清除活性氧的保护酶活性增强，抗氧化物质的增加如抗坏血酸、水杨酸等赋予的。这个结果与酶活的变化一致。与现有的抗病品种宝岛蕉相比，宝岛蕉主要是由植物体内水杨酸合成关键基因表达增强，产生水杨酸赋予植物的抗病性，而2个抗病株系抗病性的获得则是包括了活性氧途径、水杨酸代谢途径综合作用的结果。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种抗枯萎病香蕉种质的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗毒素制备
将Foc4菌种接种至培养基中培养，分离得到香蕉枯萎病菌粗毒素；
(2)香蕉未成熟雄花愈伤组织的辐射处理
对香蕉未成熟雄花愈伤组织进行辐射处理，然后置于人工气候箱进行黑暗培养，使辐射后的愈伤组织恢复生长；
(3)香蕉未成熟雄花愈伤组织粗毒素筛选
将恢复生长的辐射后的愈伤组织转至光照培养箱中培养12-18天后，转移到含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基中培养28-32天；
选择成活的愈伤组织转移至愈伤组织继代培养基中进行继代培养28-32天，定期更换培养基；
然后将愈伤组织接种于分化固体培养基上，诱导愈伤组织分化出芽；
(4)分化芽粗毒素筛选
分化培养的幼芽长至约0.5cm时，将幼芽转移至含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基上培养；
(5)香蕉生根苗粗毒素筛选
选择步骤(4)后成活的分化幼芽转移至含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基中培养35-45天，然后选择生长健壮、根系发育良好的抗病突变苗转移至营养土种植培养，幼苗长至5片新叶时移栽至种质圃保存。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中的制备粗毒素的培养基为Czaper液体培养基，步骤(1)的具体步骤为：将Foc4菌种接种于Czaper液体培养基中，27℃、120r/min，振荡培养10-20天，除菌处理，得到香蕉枯萎病菌粗毒素。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中的培养条件为：温度25℃，光照强度1000lx，光周期为光照10小时/黑暗14小时。
4.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基为：含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+1.5mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+6.0g/L琼脂固体培养基，且pH＝5.5。
5.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中愈伤组织继代培养基为MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基，且pH＝5.3；步骤(3)中分化固体培养基为MMS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
6.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中辐射处理条件为：香蕉雄花愈伤组织以钴60为辐照源，吸收剂量率为1.5Gy/min，最终吸收剂量为60Gy。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基为含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+3.5mg/L BA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)的培养条件为：温度25℃，光照强度1500lx，光周期为光照12小时/黑暗12小时。
9.根据权利要求1或8所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)中含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基为含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的MS+2mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基，且pH＝5.8。
10.一种用于筛选抗枯萎病香蕉种质的培养基组，其特征在于，其包括：含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生长培养基，含有30μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的分化培养基，以及含有100μg/ml香蕉枯萎病菌粗毒素的生根培养基。
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2018
- 2018-03-27 CN CN201810258980.3A patent/CN108476981B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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