CN100362907C - 杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 - Google Patents
杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100362907C CN100362907C CNB2004100658027A CN200410065802A CN100362907C CN 100362907 C CN100362907 C CN 100362907C CN B2004100658027 A CNB2004100658027 A CN B2004100658027A CN 200410065802 A CN200410065802 A CN 200410065802A CN 100362907 C CN100362907 C CN 100362907C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protocorm
- cremastra appendiculata
- appendiculata
- symbiosis
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000846172 Cremastra appendiculata Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 title 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title 1
- 239000000054 fungal extract Substances 0.000 claims abstract description 38
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 21
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 claims description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000003864 humus Substances 0.000 claims description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 2
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 claims description 2
- 239000006160 differential media Substances 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 abstract 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 5
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000846171 Cremastra Species 0.000 description 1
- 241000732800 Cymbidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 208000004078 Snake Bites Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明属于植物离体快繁技术领域，主要提供了紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体培养与快速繁殖的关键生物技术及其在紧缺难繁中药材野生变家种中种子种苗快速繁殖的方法。具体涉及杜鹃兰离体培养及植株生长过程中必需的共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备，杜鹃兰原球茎的诱导、增殖、根和芽的分化及植株生长调控等方法，解决了杜鹃兰人工繁殖的技术难题，为该药材的GAP种植奠定了基础。
Description
一、技术领域
本发明属于植物离体快繁技术领域。
二、背景技术
杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用植物，主要分布于东亚地区，尤以中国的贵州、四川为多(Acta Phytotaxonomica Sinica.2003，41：263-266)，以假鳞茎入药，药材称毛慈菇，味辛、甘，性寒，有小毒。有清热解毒、润肺止咳、活血止痛、消肿散结等功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等(Journalof Traditional Chinese Medicine.1996，16：243-246；Planta Medica.2004，70：171-173)，外用于治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。杜鹃兰自然储量极为稀少，加之无计划的人为采挖，野生资源濒临枯竭。目前该药材的市场需求量上千吨，可野生药材的最大供给量不足100吨，药材价格高达200元/kg。为挽救这一珍稀物种以确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，及时开展该药用植物野生变家种的工作便是当务之急。
然而，种子种苗的培育是中药材人工种植首先必须解决的关键问题。由于杜鹃兰几乎不能以种子繁殖，假鳞茎是其唯一的繁殖器官。而该植物每个假鳞茎在一年生长期中只能产生1个新的假鳞茎，故繁殖速度极其缓慢，致使人工种植难以规模化进行。加之该植物正常生长需要与特定的真菌共生，更是增加了人工种植的难度。因此，要实现杜鹃兰的人工种植，则必须首先解决其种子种苗的快速高效繁殖技术问题。其次是分离、鉴定其共生真菌的种类并加以培养、利用。
近年来，有关兰科植物的组织培养与快速繁殖研究虽取得了突破性进展，但在兰科部分种属的快繁生物技术上仍存在相当大的困难，杜鹃兰的繁殖便是一例。一些研究者尝试了杜鹃兰的组织培养与快速繁殖研究，但几乎都以失败而告终，原因在于没有弄清该植物与真菌共生的特性。从杜鹃兰植株分离的外植体几乎不能产生愈伤组织，而是在适宜条件下形成原球茎，再由原球茎分化出芽和根，进一步发育成植株。原球茎的形成、芽和根的产生、植株生长发育等过程，均需有特定真菌或真菌提取物作用。
三、发明内容
本发明解决的主要问题是珍稀紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体快速繁殖技术，即采用现代生物技术获得杜鹃兰原球茎、再生植株及其增殖群体，为按照《中药材生产质量管理规范》(GAP)进行该药用植物的人工种植奠定了基础，本发明涉及杜鹃兰的组织细胞代谢与生长发育，离体培养外植体的选择与培养条件的优化及离体培养技术，杜鹃兰的共生真菌种类及其相互作用，共生真菌分离及培养方法，共生真菌提取物制备及成分分析，共生真菌提取物的作用机理等。
在本发明中，术语“原球茎”是指通过离体培养兰科植物顶端分生组织、腋芽或不定芽所形成的可以分化发育成植株的结构。原球茎是兰科植物组织培养的中间结构，在适宜的培养基上，原球茎可以被扩繁。
(一)本发明中的材料
杜鹃兰[Cremastra appediculata(D.Don.)Makino]采自其地道产区黔东南，其共生真菌从杜鹃兰植株分离获得。
(二)本发明的技术方案
1.杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备
采集野生杜鹃兰假鳞茎经消毒后，切成小块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养、鉴定。
将分离、纯化的杜鹃兰共生真菌采用麦麸培养基进行液体振荡培养，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体。菌丝体经干燥、粉碎后，用甲醇回流法提取以获得浸膏(真菌提取物)。
2.杜鹃兰原球茎的诱导培养
将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎消毒后，切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，接种于含有共生真菌提取物的诱导培养基上，其培养基组成为：MS+BA(1.0～3.0)mg·l-1+2，4-D(0.3～1.0)mg·l-1+蔗糖(25.0～35.0)g·l-1+共生真菌提取物(5.0～15.0)mg·l-1+PVP(0.3～0.6)g·l-1+琼脂(6.0～10.0)g·l-1，pH5.8～6.0，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。待原球茎长出后，将其用作增殖培养的材料。
3.杜鹃兰原球茎增殖培养基的筛选、原球茎增殖培养与植株再生
采用正交试验法筛选原球茎增殖的适宜培养基，将诱导所得的杜鹃兰原球茎接种于适宜增殖培养基上，待形成足够的原球茎增殖群体后，再将其转入适于芽和根分化的培养基上以获得再生植株(试管苗)。带根的杜鹃兰试管苗经炼苗后即可移栽。
四、具体实施方式
为直观起见，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。特别申明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备
(1)共生真菌的分离与鉴定
分离：将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，切成0.5cm3左右的小块。用75％乙醇表面消毒3～5s，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将切块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养。
鉴定：已鉴定出2个属的共生真菌。
①简梗孢霉属Chromosporium sp.。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝初白色、污白色，后黄白色、浅土黄色，短绒毛状。
②柱孢霉属Cyindrocarpon sp.l。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝白色、污白色至淡黄褐色，短绒毛状。菌丝分泌色素使培养基呈红褐色至黑褐色。
(2)共生真菌液体培养及菌丝体收集
液体培养采用麦麸培养基：麦麸30g，葡萄糖20g，KH2PO4 0.75g，MgSO4 1.5g，加水至1000mL。挑取纯化菌丝接种，25℃振荡培养，转速120r/min。培养10～15d后，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体，蒸馏水冲洗菌丝体3次，用滤纸吸干水分，干燥后低温保存。
(3)共生真菌提取物的制备
将干菌丝体粉碎后，甲醇回流提取7次，得浸膏(真菌提取物)，置4℃保存备用。
实施例2：杜鹃兰离体培养外植体的选择与原球茎的诱导
将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，用70％乙醇表面消毒1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将假鳞茎切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，无菌条件下接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中。培养基预先在121℃下高压灭菌15min，培养基成分为MS+BA2.0mg·l-1+2，4-D 0.5mg·l-1+蔗糖30 g·l-1+共生真菌提取物10mg·l-1+PVP 0.5g·l-1+琼脂8.0g·l-1，pH5.8，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1。约6周左右获得原球茎，将其用作增殖培养的材料。从原球茎的诱导结果发现，在诱导假鳞茎不定芽产生原球茎的培养基中不加共生真菌提取物时，所诱导产生的原球茎数目只有加共生真菌提取物的19.2％(见表1)，其生长状况也较差，说明共生真菌或其提取物为杜鹃兰原球茎形成与生长所必需。
表1：共生真菌提取物对诱导杜鹃兰假鳞茎不定芽产生原球茎的效果
| 诱导培养基 | 6周后各培养瓶中诱导产生的原球茎数目 | 原球茎总和 | |||||||||
| 基本培养基+共生真菌提取物10mg·l<sup>-1</sup>基本培养基 | 133 | 175 | 161 | 183 | 154 | 172 | 152 | 153 | 144 | 163 | 15630 |
注：①基本培养基：MS+BA 2.0mg·l-1+2，4-D 0.5mg·l-1+Sucrose 30g·l-1+agar 8.0g·l-1+PVP 0.5g·l-1，
pH5.8；②外植体：含1个不定芽芽眼的假鳞茎切块
实施例3：杜鹃兰原球茎增殖培养基筛选、原球茎增殖培养与植株再生
在预实验基础上，选择培养基组分中对原球茎增殖影响较大的3个因素(蔗糖、BA、2，4-D)并各设3个浓度水平(见表2)按L9(34)进行正交试验。原球茎增殖培养基基本组成为：MS+BA+2，4-D+蔗糖+PVP 0.5g·l-1+琼脂8.0g·l-1，pH5.8。试验分处理组和对照组，处理组各培养基中均按10mg·l-1加入共生真菌提取物，对照组各培养基中均不加共生真菌提取物。将所获得的杜鹃兰原球茎按1粒/瓶接种于相应的增殖培养基上，25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1。处理和对照的正交试验均重复3次(见表3、4)，6周后对原球茎增殖结果进行极差和方差分析(见表5～8)。结果表明，对照和处理的培养基中均以蔗糖对原球茎增殖影响最大(p＜0.01)；培养基中加入共生真菌提取物(处理)时，BA和2，4-D对原球茎增殖均有极显著影响(p＜0.01)；若培养基中不加入共生真菌提取物(对照)，则BA和2，4-D对原球茎增殖影响不大，增殖培养基中不含共生真菌提取物时的原球茎增殖率只有加入共生真菌提取物(10mg·l-1)的10.3％(见表3、4)，且增殖的原球茎生长状况不良。因此，对杜鹃兰原球茎增殖的最佳培养基组成为MS+BA 2.0mg·l-1+2，4-D 0.5mg·l-1+蔗糖30g·l-1+共生真菌提取物10mg·l-1+PVP 0.5g·l-1+琼脂8.0g·l-1，pH5.8。
表2正交试验L9(34)因素水平表
| 处理水平 | 试验因素 | ||
| ABA(mg·l<sup>-1</sup>) | B2.4-D(mg·l<sup>-1</sup>) | C蔗糖(g·l<sup>-1</sup>) | |
| 123 | 1.02.03.0 | 080.30.5 | 303525 |
表3原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对杜鹃兰原球茎的诱导增殖结果
[L9(34)正交试验。下同]
| 试验组合 | 试验因素 | 每粒原球茎的增殖个数 | 原球茎总数 | |||||||||||
| A | B | C | ||||||||||||
| 1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-35-15-25-36-16-26-37-17-27-38-18-28-39-19-29-3 | 1.01.01.01.01.01.01.01.01.02.02.02.02.02.02.02.02.02.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0 | 0.80.80.80.30.3030.50.50.50.80.80.80.30.30.30.50.50.50.80.80.80.30.30.30.50.50.5 | 303030353535252525353535252525303030252525303030353535 | 5118121334233775111014523787334 | 98502354514254497133448912543 | 44623274331354512146452969422 | 6592045663236571511102358117114 | 567120475032464141216454586235 | 71083423663234568141554371312323 | 1165021557244776913915512811455 | 7872035444546431412125241097335 | 6712422655331556131517246775642 | 53421163242254715911433898453 | 656871171819494747252927545153120117123353739818884353236 |
| 总和 1467 | ||||||||||||||
表4原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对杜鹃兰原球茎的诱导增殖结果
| 试验组合 | 试验因素 | 每粒原球茎的增殖个数 | 原球茎总数 | |||||||||||
| A | B | C | ||||||||||||
| 1-11-21-32-12-22-33-13-23-34-14-24-35-15-25-36-16-26-37-17-27-38-18-28-39-19-29-3 | 1.01.01.01.010101.01.01.02.02.02.02.02.02.02.02.02.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0 | 0.80.80.80.30.30.30.50.50.50.80.80.80.30.30.30 50.50.50.80 80.80 30.30.30 50.50.5 | 303030353535252525353535252525303030252525303030353535 | 110100101001011202101210011 | 211000011100110131010111200 | 102000110000101210011020000 | 100000001001100111001100101 | 021010120100120000100011000 | 111000001000010311011102100 | 100000010110201114001010001 | 110000000000101021010111010 | 011000110001010101100002101 | 010010101010111010011121010 | 886120565323875111011356798534 |
| 总和 151 | ||||||||||||||
表5原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的极差分析
| 试验结果累加 | 原球茎增殖数 | ||
| BA | 2，4-D | 蔗糖 | |
| K<sub>1</sub>K<sub>2</sub>K<sub>3</sub>R | 40159946766.00 | 39646560670.00 | 817238412193.00 |
注：R为极差。下同
表6原球茎增殖培养基中加入共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的方差分析
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 方差 | F值 | F0.01 |
| ABCe | 225.87254.601961.277l0.55 | 222261 | 112.93127.30980.632.72 | 41.48<sup>**</sup>46.76<sup>**</sup>360.21<sup>**</sup> | 4.684.684.68 |
注：e为试验误差平方和：“**”表示差异极显著(p＜0.01)。下同
表7 原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的极差分析
| 试验结果累加 | 原球茎增殖数 | ||
| BA | 2，4-D | 蔗糖 | |
| K<sub>1</sub>K<sub>2</sub>K<sub>3</sub>R | 4160506.33 | 4447605.33 | 78235018.33 |
表8 原球茎增殖培养基中不加共生真菌提取物时对原球茎增殖结果的方差分析
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 方差 | F值 | F0.01 | F0.05 |
| ABCe | 2.011.6116.8197.13 | 222261 | 1.000.808.400.37 | 2.702.1622.58<sup>**</sup> | 4.684.684 68 | 3.033.033.03 |
在1/2 MS+NAA 0.5mg·l-1+IBA 0.5mg·l-1+蔗糖30g·l-1+共生真菌提取物10mg·l-1+琼脂8.0g·l-1培养基上，杜鹃兰原球茎生长良好，出芽、生根快速。在不含共生真菌提取物的生根生芽培养基中，原球茎几乎不能分化出根和芽，偶尔有根、芽分化的植株，其生长也及其缓慢，且因不能有效地摄取养分而中途死亡。
带根的杜鹃兰试管苗经假植(基质为腐殖质∶蛭石∶沙＝2∶1∶1)炼苗成活后，即可移栽于大田，成活率达91％以上。
本发明在最佳增殖培养基(A2B3C1)上，理论上平均每6周(42d)增殖12倍(见表3)，则1年(365d，约9×6周)的增殖倍数约为129。
按每个假鳞茎有5个不定芽芽眼计算，每个芽眼6周产生约15个原球茎(见表1)。若按上述的原球茎增殖倍数，则每个假鳞茎在1年内能繁殖出5×15×129株试管苗。若以在适宜炼苗与栽培基质中幼苗移栽成活率为91％计算，理论上每个假鳞茎在1年内能培育出5×15×129×91％＝68.25×129株再生种苗。而用假鳞茎直接种植，1年内每个假鳞茎只能产生1株新苗，长出1个新的假鳞茎。故采用在最佳培养基中加入共生真菌提取物的方法离体培养繁殖杜鹃兰，繁殖系数比传统繁殖(假鳞茎直接播种)提高了68.25×129倍。
本发明不仅弥补了杜鹃兰自然繁殖的不足，更重要的是它解决了该物种人工繁殖的技术难题。这项发明成果为挽救杜鹃兰这一宝贵资源提供了技术保障，为该药材的GAP种植奠定了基础，同时也为其它濒危难繁物种的保存提供了参考依据。
Claims (1)
1.一种杜鹃兰离体快繁方法，其特征在于：选用杜鹃兰假鳞茎切块作外植体，在培养基中加入粉碎后的杜鹃兰共生真菌的干菌丝体经甲醇回流提取7次所得的杜鹃兰共生真菌提取物，具体方法包括杜鹃兰原球茎的诱导、增殖及植株再生：
(1)原球茎的诱导：将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，用70％乙醇表面消毒1min无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将假鳞茎切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，无菌条件下接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中，培养基预先在121℃下高压灭菌15min；原球茎诱导培养基组成为：MS+1.0～3.0mg·l-1BA+0.3～1.0mg·l-12，4-D+25.0～35.0g·l-1蔗糖+5.0～15.0mg·l-1共生真菌提取物+0.3～0.6g·l-1PVP+6.0～10.0g·l-1琼脂，pH 5.8～6.0；25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1；
(2)原球茎的增殖：将从杜鹃兰假鳞茎诱导出的原球茎按1粒/瓶接种于原球茎增殖培养基上，增殖培养基组成为：MS+1.0～3.0mg·l-1BA+0.3～0.8mg·l-12，4-D+25～35g·l-1蔗糖+10mg·l-1共生真菌提取物+0.5g·l-1PVP+8.0g·l-1琼脂，pH5.8；25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1；
(3)原球茎的分化及植株再生：将生长健壮的杜鹃兰原球茎接种于分化培养基上，分化培养基组成为：1/2 MS+NAA 0.5mg·l-1+IBA 0.5mg·l-1+蔗糖30g·l-1+共生真菌提取物10mg·l-1+琼脂8.0g·l-1；待原球茎分化成苗后，将带根的杜鹃兰试管苗假植入基质中进行炼苗，炼苗基质为腐殖质∶蛭石∶沙＝2∶1∶1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100658027A CN100362907C (zh) | 2004-12-20 | 2004-12-20 | 杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100658027A CN100362907C (zh) | 2004-12-20 | 2004-12-20 | 杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1623373A CN1623373A (zh) | 2005-06-08 |
| CN100362907C true CN100362907C (zh) | 2008-01-23 |
Family
ID=34764802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100658027A Expired - Fee Related CN100362907C (zh) | 2004-12-20 | 2004-12-20 | 杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100362907C (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100444722C (zh) * | 2006-01-18 | 2008-12-24 | 贵州省农业科学院生物技术研究所 | 杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法 |
| CN100407905C (zh) * | 2006-05-11 | 2008-08-06 | 南京大学 | 杜鹃兰人工种子制作方法 |
| CN100463960C (zh) * | 2006-08-25 | 2009-02-25 | 贵州省生物技术研究所 | 兰科植物菌根真菌单菌丝团分离技术 |
| CN102612965B (zh) * | 2012-04-05 | 2013-04-10 | 中国科学院西双版纳热带植物园 | 一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法 |
| CN106171998B (zh) * | 2016-07-21 | 2018-10-19 | 贵州大学 | 一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法 |
| CN108029553A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-05-15 | 徐小毛 | 米斛的人工育种方法 |
| CN108633681A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-10-12 | 四川省农业科学院园艺研究所 | 杜鹃盆景工厂化快速生产的方法 |
| CN109105264B (zh) * | 2018-11-02 | 2022-01-11 | 成都大学 | 一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法 |
| CN110100733B (zh) * | 2019-05-29 | 2022-03-01 | 成都大学 | 一种以杜鹃兰组培根为外植体快速诱导杜鹃兰再生植株的方法 |
| CN114651723B (zh) * | 2022-04-06 | 2023-03-17 | 西南林业大学 | 用于诱导杜鹃兰假鳞茎植株一步成苗的培养基及方法 |
-
2004
- 2004-12-20 CN CNB2004100658027A patent/CN100362907C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杜鹃兰引种栽培观察. 陈德媛等.中国林副物产，第2期. 1998 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1623373A (zh) | 2005-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103651121B (zh) | 一种白及分化、壮苗培养基 | |
| CN100998311B (zh) | 山慈姑独蒜兰人工繁殖方法 | |
| CN100496223C (zh) | 菌根真菌在金线莲大面积栽培中的应用 | |
| CN103651122B (zh) | 一种白及原球茎诱导培养基 | |
| CN101215527A (zh) | 一种蚕蛹虫草的培育方法 | |
| CN109479616A (zh) | 松茸的制种与栽培方法 | |
| CN101491214B (zh) | 半夏人工种茎的生产方法 | |
| CN102150615A (zh) | 一种铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法 | |
| CN113080061B (zh) | 一种香露兜栽培方法 | |
| CN103004454A (zh) | 白蚁系列鸡枞菌的纯人工栽培方法 | |
| CN100362907C (zh) | 杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法 | |
| CN105850728B (zh) | 一种荆半夏种茎快速繁殖方法 | |
| CN101983557B (zh) | 檀香种胚苗茎段的离体快速繁殖方法 | |
| CN100407905C (zh) | 杜鹃兰人工种子制作方法 | |
| CN102907318A (zh) | 一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法 | |
| CN107629967A (zh) | 用于天麻种植的萌发菌的液体培养基和天麻种植方法 | |
| CN102342246A (zh) | 一种大白杜鹃组培快速繁殖方法 | |
| CN106069195A (zh) | 一种富硒蝉花孢子粉的培养方法 | |
| CN106962201B (zh) | 一种吉祥草试管苗种质保存方法 | |
| CN109294930A (zh) | 一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法 | |
| CN103416302B (zh) | 桂花体细胞胚再生植株的方法 | |
| CN101766123A (zh) | 一种葱兰快速繁殖的方法 | |
| CN110278871A (zh) | 利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法 | |
| CN109348952A (zh) | 一种提高旱柳耐盐性能的方法 | |
| CN105766641B (zh) | 一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080123 Termination date: 20101220 |