CN100463960C - 兰科植物菌根真菌单菌丝团分离技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物菌根真菌分离培养技术领域，主要提供了兰科植物菌根真菌分离培养的关键技术方法。具体涉及根的前处理，单菌丝团制备、菌丝团处理及萌发、显微操作挑取萌发单菌丝团并转接小块培养基培养、显微镜检小块培养基上单菌丝团并将存活菌丝团转接平板纯化等方法。解决了兰科植物菌根真菌及与兰科植物菌根相似的其他类菌根真菌的分离培养的技术难题，提高了菌株分离的可靠性，减少了筛选工作量，是兰科植物菌根真菌深入研究和应用开发的一项关键技术。

Description

兰科植物菌根真菌单菌丝团分离技术

一、技术领域

本发明属于植物菌根真菌分离培养技术领域

二、背景技术

兰科植物全世界约有700属20000种，中国达173属1240种，贵州兰科植物260余种。很多兰科植物具有观赏或药用价值。如天麻、石斛、白及、春兰、兜兰等。近年来，由于市场需求增加，采伐严重，很多兰科植物濒临灭绝。为更好利用和保护兰科植物资源，目前对兰科植物的仿野生栽培、组培快繁进行了大量的研究工作。但兰科植物种子很小，在自然条件下很难萌发成苗，尽管种子在实验室成功实现了快繁，但组培苗移栽存活率很低，这成了兰科植物利用和保护的瓶颈。

大量的研究工作表明兰科植物与其菌根真菌存在着密切关系。自然状态下兰科植物种子由于没有胚乳，必需依靠菌根真菌提供营养物质才能成功实现萌发；种子萌发形成的原球茎或根状茎没有叶绿素，不能进行光合作用，必需依靠菌根真菌；有些兰科植物终生不形成叶绿素，成年植株也需要菌根真菌提供营养。紫萁小菇和蜜环菌在天麻种子萌发和生长中的成功应用，已充分表明解决兰科植物利用和保护的关键在于其菌根真菌的成功应用。

天麻外的其他兰科植物菌根真菌的应用目前都还没有获得成功，这主要是因为兰科植物菌根真菌的分离方法不成熟。目前采用的方法多数都是兰科植物根组织块消毒分离法，这种方法有几个致命的缺点，首先是组织块中菌丝团很多，这样不可避免地导致生长慢的菌株无法分离；另外组织块过大，也导致组织细胞间杂菌的分离数增多，这使得兰科植物菌根真菌无法完全弄清楚，同时增加了有效菌株筛选的工作量。兰科植物菌根真菌以菌丝团的形式存在于兰科植物根皮层细胞中，将单个菌丝团分离并培养成功，将直接证明分离的菌株就是其菌根真菌，可有效避免分离出大量的杂菌，从而提高兰科植物有效菌根真菌筛选效率。国外有报道兰科植物菌根真菌单菌丝团分离方法，但是菌丝团的制备、处理技术不成熟，操作过程复杂，菌丝团分离培养成功率极低，很多人采用此技术都以失败告终，目前已经很少有人采用这种方法。如何改进分离技术，是兰科植物菌根真菌研究人员急待解决的关键技术问题。

三、发明内容

本发明解决的主要问题是兰科植物菌根真菌分离培养技术，即将根中的单菌丝团分离出来并培养成功。本发明涉及根的前处理、单菌丝团制备、菌丝团处理及萌发、显微操作挑取萌发单菌丝团并转接小块培养基培养、显微镜检小块培养基上单菌丝团并将存活菌丝团转接平板纯化等。整个技术操作简便，需要培养基量小，一次操作分离菌丝团数量多，不需要特殊的仪器，一般试验人员都可胜利完成。

本发明中，术语“菌丝团”是兰科植物菌根真菌在兰科植物根皮层细胞中由菌丝缠结形成的团状和圈状结构。在细胞中菌丝团经历了形成、消化和再形成过程，通过此过程为植物提供营养物质。

(一)本发明适用范围

本发明采用了附生兰美花石斛、云南独蒜兰、独蒜兰和地生兰杜鹃兰等，该技术适用于所有形成菌丝团且能纯培养的植物根中菌根真菌的分离培养。

(二)本发明的技术方案

1、根的前处理

选取距根尖1cm，长3cm左右的根样，对根进行自来水清洗，去除根表面的杂质，对于粘贴很紧的杂质利用解剖针轻轻刮除，对于有根毛的根也要用解剖针清除根毛，然后用大量无菌水冲洗，去除表面的杂菌即可备用。也可采用75％酒精进行表面消毒，然后大量无菌水冲洗干净备用。

2、菌丝团制备

在平皿中倒入适量无菌水，将根放入无菌水中，利用解剖针轻轻刮根的表面，即可将皮层细胞中的菌丝团刮出获得大量菌丝团，一般一段根可刮制4～5皿。对于有根被或表皮很硬的根要先纵切开根，然后利用解剖针轻刮皮层制备单菌丝团溶液。

3、菌丝团处理

对菌丝团进行不同浸泡时间处理，获得开始萌发生长的高活力菌丝团。此过程一方面要获得高萌发活力的菌丝团，另一方面要避免细菌污染。菌丝团处理可采用以下几种方法：菌丝团制备完成不进行特殊处理法；菌丝团溶液直接室温静置处理4～24h至菌丝开始萌发；菌丝团溶液中加入双抗(青霉素和链霉素)静置4～24h至菌丝开始萌发(此方法对菌丝团萌发生长有一定的抑制，分离菌株较少，但无细菌污染现象)。此过程注意要点：处理时间要根据菌丝团实际情况确定，根中开始形成的菌丝团活力强，不需静置处理；菌丝团越老静置时间越长，具体时间以菌丝团开始萌发即可，静置时间过长，细菌污染会加重，此时可以适当加入双抗。此过程可以确定菌丝团死活与否。

4、萌发菌丝团转接小块培养基培养

经过处理开始萌发的高活力菌丝团利用无菌水稀释至适当浓度，以便于挑取单个菌丝团。具体操作方法是：在普通显微镜下找到开始萌发的单个菌丝团，利用移液枪吸取单个菌丝团，然后将单个菌丝团移入小块培养基(每块培养基0.5cm²左右，每块培养基上可放置3～5个菌丝团，每个直径6cm的培养皿可放20～25块培养基，这样每个平皿可培养60～125个菌丝团)。此过程操作关键：利用移液枪移取菌丝团时，溶液不宜过多，过多则细菌污染度增大，一般取液量为50μl为好。此过程可以高效确定菌丝团纯培养的可能性

5、存活菌丝团纯化

小块培养基上培养的菌丝团1天后开始显微观察，利用手术刀切取开始生长的单菌丝团，连培养基一起转接到培养基平板，每6cm的平皿可放置4～6个菌丝团。每天观察平板中菌丝团生长情况，当菌丝从接种点向外生长至0.3～0.5cm时，利用手术刀切取尖端菌丝和培养基转接至新平板进一步纯化，直至菌落生长均匀，无杂菌污染，即可切取菌落尖端菌丝转接试管培养保存。

四、附图说明

图1 根横切面皮层细胞中的菌丝团

图2 根皮层细胞中放大的菌丝团

图3 根的无菌水冲洗方法

图4 根的前处理及菌丝团制备方法

图5 制备的单菌丝团溶液(显微镜下)

图6 单菌丝团溶液中静置过夜萌发生长(显微镜下)

图7 菌丝团吸取方法(显微镜下)

图8 萌发生长的单菌丝团在小块培养基上生长(显微镜下)

图9 小块培养基上生长的菌丝团在平板培养基上纯化形成的菌落

五、具体实施方式

1、根的前处理

选取距根尖1cm，长3cm左右的幼嫩根样，对根进行自来水清洗，去除根表面的泥沙及其他杂质，对于粘贴很紧的杂质利用解剖针在无菌水中轻轻刮除洗去，对于有根毛的根也要用解剖针在无菌水中刮除根毛，然后用大量无菌水冲洗干净，即可备用。也可采用75％酒精进行表面消毒，然后大量无菌水冲洗干净备用，具体方法是自来水冲洗干净的根样浸入75％酒精溶液中5S，然后无菌水冲洗5次，然后利用解剖针刮除根表面粘着很紧的杂质，再用大量无菌水冲洗干净备用。结果表明不消毒根制备的菌丝团存活率高于酒精消毒根分离的菌丝团，但细菌污染率后者比前者低。两种方法各有优缺点，可以相互配合使用。

本步及以下各步都是在无菌操作台上进行的。

2、菌丝团制备

在平皿中倒入适量无菌水，将根放入无菌水中，左手持镊子，右手持解剖针。对于没有根被的根，利用解剖针轻轻刮根的表面，注意刮下的根组织块越小越好，即可将皮层细胞中的菌丝团刮出并扩散于水中，获得含有大量菌丝团的溶液，一般一段根由外向内可刮制4～5皿。

对于有根被或表皮很硬的根要先纵切开根，然后利用解剖针轻刮皮层制备单菌丝团溶液。如果直接刮根被，很难将根被刮碎，只能刮制得大块组织，不易获得大量菌丝团。

制备菌丝团的过程中要注意围绕根均匀轻刮，以确保由根外向根内均匀刮制得菌丝团，避免出现不均而较大块组织刮下，不能得到分散的菌丝团，此外解刮针不宜光滑，表面稍有粗糙更有助于刮制菌丝团。

3、菌丝团处理

对菌丝团进行不同时间无菌水浸泡处理，获得开始萌发生长的高活力菌丝团。此过程一方面要获得高萌发活力的菌丝团，另一方面要避免细菌污染。菌丝团处理可采用以下几种方法：

3.1平皿中菌丝团制备完成后不进行特殊处理法：此方法分离成功率较低，但细菌污染少，易纯化，但只适用于幼嫩根中活力强的菌丝团的分离。

3.2菌丝团溶液直接室温静置处理4～24h至菌丝开始萌发：此方法分离成功率较高，但细菌污染较多，增加纯化困难，适用于老根中活力较弱的菌丝团的分离。

3.3菌丝团溶液中加入双抗(青霉素和链霉素)静置4～24h至菌丝开始萌发：此方法分离成功率很低，主要在于双抗对菌丝团萌发生长有一定的抑制，无细菌污染，易纯化，适用于很老的根。

此过程注意要点：处理时间要根据菌丝团实际活力情况确定，活力越强处理时间越短，幼嫩新根中开始形成的菌丝团活力强，不需静置处理就可以萌发生长；根越老，其中菌丝团活力就越弱，静置时间就越长，具体处理时间以菌丝团开始萌发即可，静置时间过长，细菌污染会加重，此时可以适当加入双抗，随着时间的沿长至10h要适当加入双抗，以各0.6万单位/ml加入青霉素和链霉素。

此过程可以确定菌丝团死活与否。可以提高挑取的单菌丝团分离成功率。

4、萌发菌丝团转接小块培养基培养

经过处理开始萌发的高活力菌丝团利用无菌水稀释至适当浓度，以便于挑取单个菌丝团。具体操作方法是：在普通显微镜下找到开始萌发的单个菌丝团，调整聚光镜增加亮度，在肉眼状态下找到菌丝团，利用移液枪吸取单个菌丝团，然后将单个菌丝团移入双抗小块培养基(每块培养基0.5cm2左右，每块培养基上可放置3～5个菌丝团，每个直径6cm的培养皿可放20～25块培养基，这样每个平皿可培养60～125个菌丝团，培养基青霉素和链霉素浓度分别为0.6万单位/ml，以下双抗培养基双抗浓度相同)，于24℃培养。

此过程操作关键：利用移液枪移取菌丝团时，移液量不宜过多，过多则细菌污染度增大，而且不易获得单个菌丝团，一般取液量为50μl为好。

此过程可以利用少量培养基，确定大量菌丝团是否可纯培养，同时也可获得大量单菌丝团的小菌落，有助于下一步纯化。

5、存活菌丝团纯化

小块培养基上培养的菌丝团1天后开始显微观察，找到开始生长的单菌丝团，利用手术刀切取开始生长的单菌丝团，连培养基一起转接到双抗培养基平板进行纯化，培养温度为24℃。每6cm的平皿可放置4～6个菌丝团。此方法比较节省培养基，少量培养基可纯化多个菌株。但值得注意的是兰科植物菌根真菌种类不同，生长速度不一样，对于生长快的菌株和生长慢的菌株要及时分开纯化，以免生长快的菌株将生长慢的菌株遮盖。

每天观察平板中菌丝团生长情况，当菌丝从接种点向外生长至0.3～0.5cm时，利用手术刀切取尖端菌丝和培养基转接至新平板进一步纯化，直至菌落生长均匀，无杂菌污染，即可切取菌落尖端菌丝转接试管斜面培养保存。值得注意的是兰科植物菌根真菌多数生长慢，在培养的过程中易污染，这类菌根真菌的分离纯化要注意细菌污染，往往要经历多次纯化。

Claims (3)

1.兰科植物菌根真菌单菌丝团分离技术方法，包括以下步骤：

1)根的前处理除去表面杂菌及根毛附属物；

2)采用解剖针刮制法制备单菌丝团：采用解剖针轻轻刮根表面，有根被或表皮硬的根要先纵切开根，再轻刮皮层获得大量菌丝团；

3)单菌丝团溶液静置诱使菌丝团萌发生长：根幼嫩及其中菌丝团活力强，直接备用转接；较老的根要根据实际情况延长静置时间，诱导菌丝团萌发生长，不同年龄的老根菌丝团静置时间在4～24h之间，随着时间的延长至10h要适当加入双抗，以各0.6万单位/ml加入青霉素和链霉素；

4)萌发生长菌丝团转接小块双抗PDA培养基培养：在普通光学显微镜下找到菌丝团，调节光圈大小肉眼找到菌丝团，利用移液枪移取单菌丝团转接小块双抗PDA培养基培养，移液枪取单菌丝团移液量不超过50μl，小块双抗PDA培养基青霉素和链霉素浓度分别为0.6万单位/ml，大小为0.5cm²；

5)小块双抗PDA培养基培养成活菌株转接双抗PDA平板纯化，双抗PDA平板中青霉素和链霉素浓度分别为0.6万单位/ml。

2.根据权利1要求所述的方法，其特征在于：步骤1)采用解剖针刮除法或75％酒精消毒5s，然后无菌水冲洗去除根表面的附属杂物及杂菌。

3.根据权利1要求所述的方法，其特征在于：步骤5)菌落从接种点长出0.3～0.5cm时，利用手术刀切取尖端菌丝转接试管斜面培养保存。

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