CN101766123A - 一种葱兰快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明选用葱兰鳞茎的顶芽为外植体，快速诱导产生大量不定芽，通过不定芽的产生及生根得到再生植株，再生植株成活率达到100％；具有繁殖速度快、不受季节限制，随时取顶芽离体器官进行组织培养、再生植株变异小、遗传稳定性高、再生植株健康和缩短育苗周期的优点。

Description

一种葱兰快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的组织培养方法，具体是葱兰的顶芽离体培养快速繁殖方法。

背景技术

葱兰(Zephyranthes candida herb.)，石蒜科葱兰属植物，别名葱莲、玉帘、白花菖蒲莲；原产南美。为多年生鳞茎草本植物，鳞茎圆锥形，具细长颈部；株高15～20cm。叶基生，线形，稍肉质，丛生，暗绿色。花葶中空，自叶丛中抽出，花单生，白色，花被六片；蕊嫩黄或金黄色，椭圆状披针形，无筒部。花径3～4cm。花期6月下旬至11月上旬。葱兰的植株丛低矮整齐，易成活，花朵繁多，花期长，花素洁高雅，清香馥郁，恬淡宜人，花型优美，近年来被广泛用于城市园林绿化中用作花坛、花镜及路边的镶边材料，或用于林下、坡地等处作为地被植物，亦可做切花材料，是优良的园林花卉观赏植物之一。目前，园林环境美化对葱兰种苗的市场需求越来越大，但葱兰的供应却极度的不足。造成这种市场缺口主要有两方面的原因：其一是葱兰的繁殖方法，目前葱兰的主要繁殖方式是种子繁殖(实生繁殖)和分株繁殖(韩梅珍，卢钰，葱兰的繁殖与园林应用，山东林业科技，2004年第4期39页)。石蒜属大多数植物的种子难以正常成熟，自然结实率很低，种子收集亦受季节限制，从收集种子到播种成苗一般要经历几个月甚至一年时间，且实生苗发育到开花大多需要4～5年或更长时间；分株繁殖也有季节要求，一般要在春季进行，而且多为2～3年分株一次，产苗量小。因此，繁殖系数低、繁殖周期长自然就成了限制葱兰大量繁殖的一个主要原因；其二是病害，近年来发现几种较为常见的主要危害葱兰叶部的病害，如黑线刺盘孢菌Colletotrichum dematium(Pers.ex F r.)(俞文君，林建新.葱兰叶枯病病原的研究，江苏林业科技，1998年25卷第1期，64～65页)、葱兰炭疽病、赤斑病和黄化病(吴大椿，邹亚飞，葱兰赤斑病病原及防治初步研究，湖北植保，1998年第5期6～7页；陈集双，李德葆，葱兰黄化病病原类菌原体的研究，微生物学报，1994年第34卷第3期，245～247页；李腾，葱兰炭疽病发生及其防治初报，广东园林，2006年第28卷第4期，49～50页)等病害，这些病害可引起葱兰的叶部病害，即使发病较轻，也影响葱兰开花，发病较重时若防治不及时，可造成葱兰成片死亡。这些叶部病害不仅影响了葱兰的观赏价值和经济价值，且有逐年加重的趋势，更为严重的是叶部病害使得葱兰的分株繁殖极大受限。上述两方面的因素造成了葱兰的产量与园林环境绿化对葱兰大量健康种苗的需求极不相符。因此，利用葱兰离体器官培养，进行工厂化育苗，快速获得葱兰大量健康种苗，成为葱兰育种的必然趋势。

目前，鳞茎类植物的组织培养及快速繁殖方法，研究较多的是百合科和石蒜科。百合科组培研究较多，外植体包含鳞片、鳞茎、叶片和花器官。其中研究较成功的是百合鳞片诱导产生小鳞茎，在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+糖3％+琼脂0.35％培养基中，以中部鳞片切割为6块产生的小鳞茎增殖系数最高，可达11.5(王爱琴，何龙飞，温庆兰，林鉴钊，百合组培中鳞片处理及其颜色变化与鳞茎形成的关系，园艺学报，2004年31卷第1期117～119页)；大百合的鳞片100％可诱导产生不定芽，增殖系数为4～7；70％的叶片可诱导分化产生丛生芽，50％的鳞茎诱导分化产生不定芽(虞泓，陆永武，程治英，大百合的离体快繁和鳞茎的诱导，植物生理学通讯，2005年41卷第2期192页)；对于兰州百合，鳞片诱导鳞茎的最适培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L，鳞茎的增殖系数为3.1(王丽艳，梁国鲁，郭启高，兰州百合组培苗试管结鳞茎研究，北方园艺，2004年第3期73页)；百合属的花器官也可作为外植体进行组织培养，以花丝的鳞茎诱导率最高(为89.01％)，其次是花柱，子房的诱导率最低，但子房诱导出鳞茎的增殖系数却最高(为2.9)(周俊辉，周厚高，林丽婵，卢俊图，火百合花器的鳞茎诱导和增殖培养研究，广西植物，2008年28卷第6期，811～815页)；另外百合科的湖北贝母、湘贝母、卷丹、郁金香等的组织培养也有研究，不同的培养基类型及激素组合，具有不同的诱导效果。其中郁金香的鳞片及鳞茎在5种培养基上很难诱导产生愈伤组织或者小鳞茎；而花托的诱导率最高，在MS+2，4-D 0.5mg/L培养基上诱导率为56.7％(杨永刚，代汉萍，胡新颖，雷家军，郁金香器官离体培养再生小鳞茎的研究，园艺学报2006年33卷第5期1133～1136页)。对于石蒜科植物的组织培养，以石蒜属、朱顶红属、君子兰属和水仙属的研究居多，其中以鳞茎作为外植体进行诱导培养直接产生小鳞茎或不定芽最为成功。同样，不同部位的外植体，不同的培养基类型及激素组合也具有不同的诱导效果(赵天荣，施永泰，蔡建岗，倪建刚，石蒜属植物的研究进展，北方园艺，2008年第4期65～69页)。如林田，刘灶长，李天菲等(不同激素配比对红花石蒜小鳞茎及茎尖的分化培养的影响，上海农业学报，2006年22卷第4期45-47页)以红花石蒜鳞茎为外植体，在最适培养基上(MS+BA3.0mg/L+NAA 1.5mg/L)，小鳞茎的诱导率为53％；而刘志高等(乳白石蒜组织培养，浙江林学院学报，2006年23卷第3期347～350页)以乳白石蒜的鳞茎作为外植体，最高诱导率达到100％；通过切割诱导得到的小鳞茎，在MS+BA5.0mg/L+NAA2.0mg/L培养基上得到了最好的增殖效果，最高增殖倍数达到15。这些结果表明，对于鳞茎类植物，通过离体培养可以获得再生植株，同时也说明不同植物所含的特有物质及遗传特性不同，离体培养适用的组织器官部位、培养方法、培养基组分及培养条件等往往具有很大的种间及属间特异性，甚至同种植物不同部位的组织也有很大的差异。

对于具有较大鳞茎的植物，也可采用鳞茎盘的切割法，如十六等分法、八等分法、六等分法、四等分法等切割鳞茎进行快速繁殖，如忽地笑以八分割基盘所获取的子球最多，平均为14个子球，但子球至开花需2～4年；利用双鳞片繁殖法，可使得一个母球的繁殖倍数达到40～70倍，但子球至开花需4～5年；以4鳞片及其相连的部分基盘为繁殖体，所形成的子球较大，一母球的繁殖倍数为38倍，子球至开花需3～4年。虽然底盘切割法是石蒜属植物无性繁殖较为有效的方法，但也存在从小鳞茎至开花周期长的缺点(赵天荣，施永泰，蔡建岗，倪建刚，石蒜属植物的研究进展，北方园艺，2008年第4期65～69页)。

对于葱兰的离体培养及快速繁殖，目前的报道较少。陈扬春(“葱兰和韭兰鳞片离体培养研究”，亚热带植物通讯，1992年第21卷第2期42～46页)以带鳞茎盘和不带鳞茎盘的鳞片为外植体进行组织培养，发现带鳞茎盘的鳞片可诱导产生小鳞茎，但在最适培养基MS+BA 0.1mg/L+NAA 1.0mg/L上，小鳞茎增殖系数最高为1.5，而未带鳞茎盘的鳞茎则全未形成小鳞茎。何龙飞，周嫦(“玉帘的组织和原生体培养”，武汉大学学报(自然科学版)，1995年第41卷第2期213～217页)以玉帘的不同组织为外植体进行培养，诱导的胚性愈伤能产生再生植株，胚性愈伤的诱导率最高仅为20.5％。这些研究结果均达不到快速繁殖的目的。同时由于葱兰的鳞茎盘相对较小，不能采用鳞茎盘的切割方法进行培养，加上前面所述的葱兰病害的原因，使得葱兰快速繁殖的选材和方法更为苛刻和不易，远远不能满足大量的市场需求。

发明内容

本发明的目的在于克服葱兰现有繁殖技术的不足，提供一种葱兰离体培养及快速繁殖的方法。

本发明选用葱兰鳞茎的顶芽为外植体，快速诱导产生大量不定芽，通过不定芽的产生及生根得到再生植株，再生植株成活率达到100％。具有繁殖速度快、可不受季节限制，随时取顶芽离体器官进行组织培养、再生植株变异小、遗传稳定性高、再生植株健康和缩短育苗周期的优点。

本发明通过以下技术方案实施：

取葱兰鳞茎，消毒灭菌后取顶芽，以MS基本培养基加激素组合TDZ和NAA为培养基进行不定芽的诱导，在相同的培养基上进行不定芽继代培养，然后以1/2MS，添加IBA为培养基，进行不定芽生根培养形成再生植株。

具体的步骤如下：

第一步，取栽培葱兰整株，切去根系、鳞茎盘基和叶片，剥掉外面的鳞叶和腋芽进行灭菌；灭菌后继续剥离残留鳞叶，留下顶芽进行诱导；诱导使用的培养基为MS基本培养基加激素组合TDZ和NAA，TDZ和NAA浓度分别为0.1～0.5mg/L和0.05～0.2mg/L；培养条件为：温度24±4℃，光照时间为：10～14小时/天，光照强度为：2000～2500Lux，不定芽的诱导时间为16～20天，每芽可长出1～2片绿色叶片，叶片长约0.5～2cm；不定芽的诱导率为100％；不定芽的增殖系数为7～9；

第二步，将分化的不定芽分成单芽，切去顶部叶片，进行继代培养，培养基与分化培养基相同，培养条件为：温度24±4℃，光照时间为：10～14小时/天，光照强度为：2000～2500Lux，培养时间为15～20天，增殖系数为7～9。

第三步，将第二步的不定芽进行生根培养，生根培养基为1/2MS，添加0.1～0.5mg/L的IBA，培养条件为：温度24±4℃，光照时间为：10～14小时/天，光照强度为：2000～2500Lux，生根培养时间为35～40天，生根率100％，根长约10～12cm，形成葱兰再生植株。

第一步中所述灭菌方法具体为：取栽培的葱兰植株，用自来水冲洗泥土，切去根系和叶片，将余下的鳞茎在用自来水下冲洗3～4小时；剥去鳞茎外面2/3的鳞叶和腋芽，然后用体积分数为75％的酒精浸泡2～3min，用无菌水冲洗3～5次，用质量分数为1‰的升汞溶液浸泡10～15min，再用无菌水冲洗5次，然后用无菌滤纸将鳞茎的水分吸干，切去鳞茎盘基，接种于诱导培养基中。

与现有的葱兰离体组培方法相比，本发明的主要优点有几个方面：

其一，取材于葱兰鳞茎中的顶芽，一般来说，植物病毒的含量随与茎尖相隔距离加大而增加，茎尖部分病毒含量极低或不含病毒，利用葱兰鳞茎最内层的顶芽进行培养避免了带病菌的外植体，可以获得健康植株。

其二，利用顶芽进行离体培养，可诱导产生大量不定芽，在MS+TDZ+NAA培养基中，诱导率为100％，增殖系数可达7～9。而利用叶片和根不能诱导产生愈伤组织和不定芽；利用鳞片作为外植体进行组织培养，只有加MS+6-BA+2，4-D的培养基中鳞片有少许膨大，但也不能产生愈伤组织和不定芽，在MS+TDZ+NAA和MS+6-BA+NAA的培养基中没有任何诱导，最终60～90天时逐渐褐化死亡。本发明的结果表明，葱兰的离体组培顶芽是最佳外植体，根系、叶片和鳞片无法诱导产生愈伤组织或不定芽。

其三，本发明表明，利用葱兰顶芽诱导产生的不定芽，可在相同的诱导培养基上继代培养，培养步骤简单，继代周期较短，仅需15～20天。

其四，利用顶芽离体培养直接形成大量不定芽进行快速繁殖，没有经过脱分化、愈伤组织诱导及其分化过程，使产生的再生植株变异率低，遗传稳定性高。

因此，利用葱兰顶芽的离体培养进行无性繁殖，取材方便，步骤简单，增殖系数高，获得的再生植株变异率低，遗传稳定性高，达到了快速繁殖的目的。

附图说明

附图1为葱兰顶芽在MS+TDZ+NAA培养基上诱导产生出不定芽；

附图2为葱兰不定芽形成根系后的生根苗。

具体实施方式

实施例1

第一步，取栽培的葱兰植株，用自来水冲洗泥土，剪去根系和叶片，将余下的鳞茎在用自来水下冲洗4小时；剥去鳞茎外面2/3的鳞叶和腋芽，然后用体积分数为75％的酒精浸泡2min，用无菌水冲洗5次，再用质量分数为1‰的升汞溶液浸泡12min，再用无菌水冲洗5次，将消毒后的鳞茎盘基切去，将剩余直径约为0.6cm的顶芽接种于诱导培养基中，培养基为MS基本培养基，添加剂为：0.5mg/L的TDZ和0.1mg/L的NAA，加入蔗糖30g/L，琼脂8g/L，培养基PH值5.9，培养条件为：温度25±2℃，光照时间为：12小时/天，光照强度为：2500Lux，不定芽的诱导时间为18天的效果见图1；

第二步，将分化的不定芽切割为单芽，切去叶片进行继代培养，培养基与分化培养基相同，培养条件为：温度25±2℃，光照时间为：12小时/天，光照强度为：2500Lux，培养时间为18天；

第三步，将步骤二得到的不定芽进行生根培养，培养条件为：温度25±2℃，光照时间为：12小时/天，光照强度为：2500Lux，生根培养时间为38天，得到葱兰再生植株，详见图2。

将第三步中经生根培养后得到的再生苗进行练苗，待再生苗长到10cm高时，将其与空气接触，25±2℃下生长5天；然后用流水洗去再生苗根部的培养基，将其移栽到消毒的栽培基质(泥炭土∶蛭石＝2∶1)中培养，得到葱兰再生植株，成活率达100％。

Claims (3)

1.一种葱兰快速繁殖的方法，其特征在于取葱兰鳞茎顶芽，以MS加激素组合TDZ和NAA为培养基进行不定芽的诱导，在相同的培养基上进行不定芽继代培养，然后以1/2MS，添加IBA为生根培养基，进行不定芽生根培养形成再生植株。

2.权利要求1所述的葱兰快速繁殖的方法，所述培养基中MS为基础培养基，激素TDZ浓度为0.1～0.5mg/L、NAA浓度为0.05～0.2mg/L。

3.权利要求1所述的葱兰快速繁殖的方法，所述的生根培养基中的IBA浓度为0.1～0.5mg/L。

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