CN100407905C - 杜鹃兰人工种子制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物人工种子生产技术领域，主要提供了紧缺难繁药用植物杜鹃兰的人工种子制作关键技术。具体涉及杜鹃兰原球茎的诱导增殖及原球茎悬浮系的建立，杜鹃兰人工种子的人工种皮包埋基质、人工胚乳及人工种子萌发基质的制备，杜鹃兰人工种子的贮藏及播种技术，为杜鹃兰规模化人工栽培提供了新的途径。
Description
一、技术领域
本发明属于植物人工种子生产技术领域.
二、背景技术
杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用及观赏植物，主要分布于东亚地区，尤以中国的贵州、四川为多(ActaPhytotaxonomica Sinica.2003，41：263-266).以假鳞茎入药，药材称毛慈菇，味辛、甘，性寒，有小毒.有清热解毒、润肺止咳、活血止痛、消肿散结等功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等(Journal of Traditional Chinese Medicine.1996，16：243-246；Planta Medica.2004，70：171-173)，外用于治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等.杜鹃兰自然储量极为稀少，加之无计划的人为采挖，野生资源濒临枯竭.为挽救这一珍稀物种以确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，必须及时开展该药用植物野生变家种的工作.
然而，种子种苗的培育是中药材人工种植首先必须解决的关键问题.由于杜鹃兰几乎不能以种子繁殖，假鳞茎是其唯一的繁殖器官.而该植物每个假鳞茎在一年生长期中只能产生1个新的假鳞茎，故繁殖速度极其缓慢，致使人工种植难以规模化进行.加之该植物正常生长需要与特定的真菌共生，更是增加了人工种植的难度.因此，要实现杜鹃兰的人工种植，则必须首先解决其种子种苗的快速高效繁殖技术问题.其次是分离、鉴定其共生真菌的种类并加以培养、利用.
有关兰科植物的组织培养与快速繁殖研究虽取得了突破性进展，但在兰科部分种属的快繁生物技术上仍存在相当大的困难，杜鹃兰的繁殖便是一例.近年来，虽然我们在杜鹃兰的组织培养与离体快繁研究方面取得较大突破，但因其试管苗生产周期较长，成本较高，炼苗移栽工作量大，且不便贮藏和运输，从而限制了规模化生产.而人工种子与试管苗相比，所用培养基量少、体积小、繁殖及发芽成苗快、运输与保存方便，是解决杜鹃兰药材规模化生产所需种子种苗的一条有效途径.
三、发明内容
本发明解决的主要问题是珍稀紧缺难繁药用植物杜鹃兰的人工种子生产技术，即采用现代生物技术方法获得杜鹃兰原球茎，以原球茎作为人工种子的繁殖体，将其包埋在含有营养物质、生长发育控制剂、促进生长的内生真菌提取物、防腐剂、杀虫剂和杀菌剂等复合成分的胶囊内制成杜鹃兰人工种子，为该药用植物的GAP种植奠定基础.本发明涉及杜鹃兰原球茎的诱导与增殖，内生真菌分离、培养及内生真菌提取物制备，人工种皮的制备、人工胚乳的配制、人工种子的包埋与贮藏等.
在本发明中，术语“原球茎”是指通过离体培养兰科植物顶端分生组织、腋芽或不定芽所形成的可以分化发育成植株的结构.
(一)本发明中的材料
杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]采自其地道产区黔东南，其内生真菌从杜鹃兰植株分离获得.
(二)本发明的技术方案
1.杜鹃兰内生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备
采集野生杜鹃兰假鳞茎经消毒后，切成小块接种于PDA平皿内，25±0.5℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养、鉴定.
将分离、纯化的杜鹃兰内生真菌采用麦麸培养基进行液体振荡培养，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体.菌丝体经干燥、粉碎后，用甲醇回流法提取以获得浸膏(真菌提取物).
2.杜鹃兰原球茎的诱导与增殖培养
以幼嫩、健壮的野生杜鹃兰假鳞茎为外植体，经充分消毒后用无菌刀片将其切成带1～2个不定芽眼的小块，接种于高压灭菌后的原球茎诱导培养基上，原球茎诱导培养基组成为：MS+1.0～3.0mg·l-1BA+0.3～0.8mg·l-12，4-D+25.0～35.0g·l-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物+0.3～0.6g·l-1PVP+6.0～10.0g·l-1琼脂，pH 5.8～6.0.25±1℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1.待原球茎长出后，将其用作增殖培养材料.
将从杜鹃兰假鳞茎诱导出的原球茎接种于原球茎增殖培养基上，增殖培养基的组成及培养条件均与原球茎诱导相同.待形成足够的原球茎增殖群体后，将其用作建立原球茎悬浮系的材料.
3.原球茎悬浮系的建立及人工种子繁殖体的获得
将增殖的原球茎接种于液体培养基中，培养基组成为1/2MS+1.0～3.0mg·l-1BA+0.5～0.8mg·l-12，4-D+25.0～30.0g·1-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物，pH5.8～6.0.在25±1℃，漫射光下，摇床转速为60r·min-1的条件下培养约35d后，筛选适宜大小的原球茎用作杜鹃兰人工种子的繁殖体.
4.杜鹃兰人工种子的制作过程
用杜鹃兰原球茎作为人工种子的繁殖体，以3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖+1.5～3.0％CaCl2为人工种皮基质，0.2～0.4mg·l-1NAA+0.1～0.2mg·l-1GA3+0.4～0.6mg·l-1BA+0.3～0.5mg·l-1青霉素+0.3～0.5％多菌灵粉剂+0.2～0.3％苯甲酸钠+1.0～1.5％的蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物为人工胚乳成分.将原球茎均匀悬浮于人工胚乳溶液后，一同注入用于包埋人工种子的双重管的内管中；再将用1/2MS液体培养基配制的3.0～5.0％海藻酸钠和1.0～3.0％壳聚糖溶液注入双重管的外管；从内管滴出的浸没在人工胚乳中的单个繁殖体，被外管流出的人工种皮凝胶包裹形成球状体后滴入1.5～3.0％CaCl2溶液中固化25～30min，即得杜鹃兰人工种子.
5.杜鹃兰人工种子的贮藏
将制成的杜鹃兰人工种子用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存.
本发明的有益效果既克服了杜鹃兰自然繁殖率低的困难，也弥补了从离体培养产生试管苗再生植株生产周期较长、成本高、炼苗移栽工作量大且不便贮藏和运输的不足.这项发明成果不仅为挽救杜鹃兰这一宝贵资源提供了技术保障，为其它濒危难繁物种的保存提供了参考依据，也为该药材规模化人工种植所需种子种苗的生产提供了新的途径.
四、附图说明
图1人工种子制作流程
A外管，B繁殖体，C内管，D人工胚乳，E 1.5％～3.0％CaCl2溶液，F人工种子
五、具体实施方式
1.杜鹃兰内生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备
(1)内生真菌的分离与鉴定
分离：将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗6～12h并用无菌水冲洗干净后，切成0.4～0.6cm3左右的小块.用75％乙醇表面消毒5～10s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％HgCl2表面消毒10～15min，无菌水冲洗3～5次后，将切块接种于PDA平皿内，25±0.5℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养.
鉴定：已鉴定出2个属的内生真菌.
①简梗孢霉属Chromosporium sp..在麦麸糖培养基上，菌落菌丝初白色、污白色，后黄白色、浅土黄色，短绒毛状.
②柱孢霉属Cylindrocarpon sp.I.在麦麸糖培养基上，菌落菌丝白色、污白色至淡黄褐色，短绒毛状.菌丝分泌色素使培养基呈红褐色至黑褐色.
(2)内生真菌液体培养及菌丝体收集
液体培养采用麦麸培养基：麦麸30g，葡萄糖20g，KH2PO40.75g，MgSO41.5g，加水至1000mL，121℃高压灭菌15～20min.挑取纯化菌丝接种，25±0.5℃振荡培养，转速120r·min-1.培养10～15d后，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体，蒸馏水冲洗菌丝体3～5次，用滤纸吸干水分，置60℃烘箱中烘干后4℃低温保存.
(3)内生真菌提取物的制备
将干燥菌丝体粉碎后，用甲醇回流提取6～8次，得浸膏(真菌提取物)，置4℃保存.内生真菌提取物加入培养基前，按所需浓度用双蒸水稀释.
2.杜鹃兰原球茎的诱导与增殖培养
(1)杜鹃兰原球茎的诱导
将幼嫩、健壮的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗去泥土后，放入烧杯，加几滴洗洁净用水震荡15～20min，此间用毛笔刷洗假鳞茎表面，再经流水冲洗6～12h.在超净台上，先用75％(V/V)乙醇对假鳞茎表面消毒0.5～1.0min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％(W/V)HgCl2溶液浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次，置无菌滤纸上用无菌刀片将其切成带1～2个不定芽眼的小块，接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中，培养基预先在121℃下高压灭菌15～20min.原球茎诱导培养基组成为：MS+1.0～3.0mg·l-1BA+0.3～0.8mg·l-12，4-D+25.0～35.0g·l-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物+0.3～0.6g·l-1PVP+6.0～10.0g·l-1琼脂，pH 5.8～6.0.25±1℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1.
(2)杜鹃兰原球茎的增殖培养
带不定芽眼的假鳞茎切块在原球茎诱导培养基上培养约40d后，不定芽眼处产生带有白毛的淡绿色原球茎，此时将原球茎从基部切下，转移到原球茎增殖培养基上，增殖培养基的组成及培养条件均与原球茎诱导相同.待形成足够的原球茎增殖群体后，将其用于建立原球茎悬浮系.
3.建立原球茎悬浮系以获得人工种子繁殖体
将增殖后的原球茎按5.0～7.0g/瓶鲜重的接种量接种于盛有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为1/2MS+1.0～3.0mg·l-1 BA+0.5～0.8mg·l-12，4-D+25.0～30.0g·l-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1生真菌提取物，pH 5.8～6.0.25±1℃，漫射光下，摇床转速为60r·min-1的条件下培养，每10d更换培养基1次，培养35d后，用尼龙网从原球茎悬浮系中筛选适宜大小的原球茎供作杜鹃兰人工种子制作的繁殖体.
4.杜鹃兰人工种子的制作与贮藏
(1)杜鹃兰人工种子的制作
以杜鹃兰原球茎为繁殖体，4.0％海藻酸钠+2.0％壳聚糖+2.0％CaCl2为人工种皮基质，0.2mg·l-1NAA+0.1mg·l-1GA3+0.5mg·l-1BA+0.4mg·l-1青霉素+0.3％多菌灵粉剂+0.2％苯甲酸钠+1.0％的蔗糖+10.0mg·l-1内生真菌提取物为人工胚乳成分，制作杜鹃兰人工种子.其具体操作方法为：将杜鹃兰的原球茎均匀悬浮于人工胚乳溶液后，一同注入用于包埋人工种子的双重管的内管中，再将用1/2MS液体培养基配制的4.0％海藻酸钠和2.0％壳聚糖溶液注入双重管的外管；从内管滴出的浸没在人工胚乳中的单个繁殖体(原球茎)，被外管流出的人工种皮凝胶包裹形成球状体后，滴入2.0％CaCl2溶液中固化30min，即得杜鹃兰人工种子(图1).将杜鹃兰人工种子播种于MS固体培养基上，(25±1)℃、每日1000lx光照12h，25d后统计其萌发率，40d后考查成苗率，结果见表1和表2.
表1不同人工种皮基质对杜鹃兰人工种子萌发率和成苗率的影响
1)固形基质，即粘土∶蛭石∶MS培养液＝2∶1∶2.
2)新复极差检验，不同字母表示处理平均数之间在α＝005水平差异显著.下同.
表2不同组分人工胚乳对杜鹃兰人工种子萌发和成苗的影响
注：种皮基质为4％海藻酸钠+2％CaCl2+2％壳聚糖；激素、抗生素及内生真菌提取物的单位为mgl1，苯甲酸钠、多菌灵粉剂及蔗糖的加入量为占人工胚乳总量的百分率.
(2)杜鹃兰人工种子的贮藏
将制成的杜鹃兰人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存.不同贮温和贮期对杜鹃兰人工种子萌发和成苗的影响见表3.
表3不同贮温和贮期对杜鹃兰人工种子萌发和成苗的影响
Claims (1)
1. 一种杜鹃兰人工种子制作方法，其特征在于用杜鹃兰假鳞茎诱导产生的原球茎作为繁殖体制作人工种子，具体步骤为：
(1)原球茎的诱导：将幼嫩且健壮的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗去泥土后，放入烧杯，加几滴洗洁净用水震荡15～20min，此间用毛笔刷洗假鳞茎表面，震荡后再用流水冲洗6～12h；在超净台上，先用75％乙醇对假鳞茎表面消毒0.5～1min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％HgCl2溶液浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次，置无菌滤纸上用无菌刀片将其切成带1～2个不定芽眼的小块，接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中，培养基预先在121℃下灭菌15～20min；原球茎诱导培养基组成为：MS+1.0～3.0mg·l-1 BA+0.3～0.8mg·l-1 2,4-D+25.0～35.0g·l-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物+0.3～0.6g·l-1 PVP+6.0～10.0g·l-1琼脂，pH5.8～6.0；25±1℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmol·m-2·s-1；
(2)原球茎的增殖：将从杜鹃兰假鳞茎诱导出的原球茎接种于原球茎增殖培养基上，增殖培养的培养基的组成及培养条件均与原球茎诱导相同；
(3)原球茎悬浮系的建立及人工种子繁殖体的获得：将增殖后的原球茎按鲜重5～7g/瓶的接种量接种于盛有50ml液体培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为1/2MS+1.0～3.0mg·l-1 BA+0.5～0.8mg·l-1 2,4-D+25.0～30.0g·l-1蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物，pH5.8～6.0；25±1℃，漫射光下，摇床转速为60r·min-1的条件下培养，每10d更换培养基1次，培养35d后，悬浮系中的原球茎用作杜鹃兰人工种子的繁殖体；
(4)人工种子的制作与贮藏：
(a)杜鹃兰人工种子的种皮基质为：3.0～5.0％海藻酸钠+1.0～3.0％壳聚糖+1.5～3.0％CaCl2；
(b)杜鹃兰人工种子的胚乳成分为：0.2～0.4mg·l-1 NAA+0.1～0.2mg·l-1GA3+0.4～0.6mg·l-1 BA+0.3～0.5mg·l-1青霉素+0.3～0.5％多菌灵粉剂+0.2～0.3％苯甲酸钠+1.0～1.5％的蔗糖+10.0～15.0mg·l-1内生真菌提取物；
(c)杜鹃兰人工种子制作过程为：将杜鹃兰人工种子的繁殖体，均匀悬浮于人工胚乳溶液后，繁殖体和胚乳溶液一同注入用于包埋人工种子的双重管的内管中，再将用1/2MS液体培养基配制的3.0～5.0％海藻酸钠和1.0～3.0％壳聚糖溶液，注入双重管的外管；从内管滴出的浸没在人工胚乳中的单个繁殖体，被外管流出的人工种皮凝胶包裹形成球状体后，滴入1.5～3.0％CaCl2溶液中固化25～30min，即得人工种子；
(d)杜鹃兰人工种子的贮藏条件为：将杜鹃兰人工种子盛入无菌大培养皿并用Parafilm密封后，于4℃条件下黑暗保存。
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