CN109105264B

CN109105264B - 一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法

Info

Publication number: CN109105264B
Application number: CN201811301934.3A
Authority: CN
Inventors: 王跃华; 陈燕; 黄鹏; 陈芳; 马涛; 曾宇; 刘欢; 吉礼涛; 唐亚铃; 何新友; 张霞; 杜媛; 唐捷; 王宗兵
Original assignee: Tianquan County Tongchuang Heavy Building Planting Farmers Professional Cooperative; Chengdu University
Current assignee: Tianquan County Tongchuang Heavy Building Planting Farmers Professional Cooperative; Chengdu University
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109105264A

Abstract

本发明公开了一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法，包括步骤：(1)杜鹃兰球茎的培养；(2)外植体的选取；(3)不定芽的诱导；(4)无根苗的生根培养；(5)炼苗。本发明以杜鹃兰芽体基部的球茎作为外植体，通过不定芽的诱导、无根苗的生根培养和炼苗，大大缩短了培养杜鹃兰再生植株的时间，为杜鹃兰再生植株的大规模繁殖提供了一种新途径，有效地解决了当前杜鹃兰植物资源和种苗资源短缺的问题。

Description

一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法

技术领域

本发明涉及一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法，具体涉及一种以杜鹃兰球茎为外植体的杜鹃兰再生植株的快速培育方法。

背景技术

杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makion]又名毛慈菇、算盘七，为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用及观赏植物，主要分布于东亚地区，尤以中国的贵州、四川为多。以假鳞茎入药，味辛、甘，性寒，有小毒。有清热解毒、润肺止咳、活血止痛、消肿散结等功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等，外用治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。杜鹃兰不仅是珍稀药用植物，而且是我国三级珍稀濒危野生保护植物。

杜鹃兰自然贮存量极少，加之无计划的人为采挖，野生资源濒临枯竭。杜鹃兰喜冷凉阴湿环境，对生态环境要求较严，目前主要依靠分株繁殖，其繁殖系数极低。另外，因杜鹃兰植物种子非常细小且无胚乳，所以在自然环境下其种子繁殖成功率极低。然而药材市场对杜鹃兰的需求量非常大，致使人们进行地毯式的采挖，野生资源濒临枯竭，导致药材价格节节攀升。为挽救这一珍稀物种，确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，急需提供一种杜鹃兰快速成苗的方法。

近年来，人们已开展了对杜鹃兰植物的种苗培育研究，取得了一些成果。如专利号为200610050919.7的发明专利公开的“杜鹃兰的组织培养与快速繁殖方法”，该方法采用杜鹃兰种子和假球茎上的芽眼作为外植体，通过形成原球茎，以及原球茎进一步增殖分化成苗，获得完整的再生植株，其中以种子为外植体获得再生植株最短需要297d，而以假球茎上的芽眼作为外植体培育获得完整再生植株最短需要145d。专利号为200410065802.7的发明专利公开了“杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法”，该方法涉及杜鹃兰的组织细胞代谢与生长发育，离体培养外植体的选择、培养条件的优化以及离体培养技术，杜鹃兰的共生真菌种类及其相互作用，共生真菌及培养方法等。专利号为201610578050.7的发明专利公开了“一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法”，该方法以杜鹃兰种子无菌萌发最终获得试管苗。上述三种方法都存在杜鹃兰种苗培育周期较长的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在较短时间内培育出大量杜鹃兰种苗的杜鹃兰再生植株的快速培育方法。

本发明提供的杜鹃兰再生植株的快速培育方法包括如下步骤：

(1)杜鹃兰球茎的培养

a.从已成熟的杜鹃兰果实中选取种子，将种子消毒处理后接入White+活性炭0.5～1.0g/L+腺嘌呤5～8mg/L+蔗糖25～30g/L液体培养基中，在温度15～22℃、无光照条件下诱导培养25～40天；

b.将诱导培养30天后的种子转接入1/2MS+6BA1～3mg/L+TDZ0.3～0.6mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+活性炭1.0～2.0g/L培养基中，在温度为22～26℃、每天光照15～24小时、光照强度为2000～3000lx的条件下培养40～60天，获得基部生长有球茎的杜鹃兰芽体；

(2)外植体的选取：选取杜鹃兰芽体基部直径为0.5～1.0cm的球茎作为外植体；

(3)不定芽的诱导

将球茎外植体沿纵向对半切开，以伤口面平放在培养基表面的方式接入MS+6-BA0.1～0.5mg/L+2ip4～8mg/L+2,4-D0.3～2.0mg/L+土豆泥25～50g/L+芋头泥20～50g/L+半胱氨酸2.0～5.0g/L+活性炭1.0～3.0g/L固体培养基中，先在温度为18～22℃和无光照条件下培养10～15天，再置于温度为22～26℃、每天光照15～24小时和光照强度为2000～3000lx的条件下诱导培养不定芽；

(4)无根苗的生根培养

选取步骤(3)中生长2cm以上、且基部膨大并形成有环节的不定芽作为无根苗，将无根苗接入1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+活性炭3.0～5.0g/L生根培养基中，在温度18～20℃、每天光照8～12小时和光照强度为1000～1500lx的条件下进行生根培养；

(5)炼苗

选取在步骤(4)中生长状况良好的杜鹃兰再生植株，先打开培养瓶盖培养1～3d，再从培养瓶中取出，移栽至已消毒的基质中栽培；

上述所有培养基的蔗糖20～40.0g/L、琼脂5.5～7.5g/L，液体培养基除外。

进一步地，步骤(1)a中所述消毒处理是指先将杜鹃兰种子放入浓度为2.0～6.0％的次氯酸钙溶液中浸泡20～40min，再放入浓度为5.0～10.0％的过氧化氢溶液消毒3～6min，最后用无菌水洗涤2～5次。

进一步地，步骤(5)中所述基质由草碳、蛭石、珍珠岩和沙按照2:1:1:1的比例混合制成。

本发明以杜鹃兰芽体基部的球茎作为外植体，通过不定芽的诱导、无根苗的生根培养和炼苗，大大缩短了培养杜鹃兰再生植株的时间，为杜鹃兰再生植株的大规模繁殖提供了一种新途径，有效地解决了当前杜鹃兰植物资源和种苗资源短缺的问题。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的杜鹃兰再生植株的快速培育方法包括如下步骤：

(1)杜鹃兰球茎的培养

a.从已成熟且刚自然开裂的杜鹃兰果实中选取种子，将种子放入浓度为4.0％的次氯酸钙溶液中浸泡30min，再放入浓度为7.0％的过氧化氢溶液消毒5min，然后用无菌水洗涤4次后，接入White+活性炭0.8g/L+腺嘌呤7mg/L+蔗糖28g/L液体培养基中，在温度20℃、无光照条件下诱导培养30天；

b.将诱导培养30天后的种子转接入1/2MS+6BA2.0mg/L+TDZ0.4mg/L+NAA0.3mg/L+活性炭1.5g/L培养基中，在温度为24℃、每天光照20小时、光照强度为2500lx的条件下培养50天，统计有87％的杜鹃兰芽体的基部生长有球茎；

(3)不定芽的诱导

将球茎外植体沿纵向对半切开，以伤口面平放在培养基表面的方式接入MS+6-BA0.3mg/L+2ip6.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+土豆泥38g/L+芋头泥40g/L+半胱氨酸3.5g/L+活性炭2.0g/L固体培养基中，先在温度为20℃的无光照条件下培养12天，再置于温度为24℃、每天光照20小时、光照强度为2500lx的条件下培养；培养30d后统计，其不定芽的分化率为100％，并且接入的每个外植体上平均可产生9.51个不定芽；

(4)无根苗的生根培养

切取步骤(3)中培养的生长2cm以上、且基部膨大并形成有环节的不定芽作为无根苗，将无根苗转接入1/2MS+NAA0.3mg/L+活性炭4.0g/L生根培养基中，在温度为19℃、每天光照10小时、光照强度为1200lx的条件下进行生根培养；培养30d后统计，其生根率达100％，平均每株植物的生根条数为4～7；

(5)炼苗

选取在步骤(4)中生长状况良好的杜鹃兰再生植株，先打开培养瓶盖培养2d，再从培养瓶中取出再生植株，洗去其基部的培养基，稍晾干水分后，移栽至由草碳、蛭石、珍珠岩和沙按照2:1:1:1的比例混合制成的且已消毒的基质中栽种，组培苗的存活率为100％；

上述除液体培养基外，其余培养基的蔗糖为30.0g/L、琼脂为7.0g/L，所有培养基的pH值均为6.0。

实施例2

(1)杜鹃兰球茎的培养

a.从已成熟且刚自然开裂的杜鹃兰果实中选取种子，将种子放入浓度为2.0％的次氯酸钙溶液中浸泡20min，再放入浓度为5.0％的过氧化氢溶液消毒3min，然后用无菌水洗涤2次后，接入White+活性炭0.5g/L+腺嘌呤5mg/L+蔗糖25g/L液体培养基中，在温度15℃、无光照条件下诱导培养25天；

b.将诱导培养30天后的种子转接入1/2MS+6BA1.0mg/L+TDZ0.3mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1.0g/L培养基中，在温度为22℃、每天光照15小时和光照强度为2000lx的条件下培养40天，统计有78.29％的杜鹃兰芽体的基部生长有球茎；

(3)不定芽的诱导

将球茎外植体沿纵向对半切开，以伤口面平放在培养基表面的方式接入MS+6-BA0.1mg/L+2ip4.0mg/L+2,4-D0.3mg/L+土豆泥25g/L+芋头泥20g/L+半胱氨酸2.0g/L+活性炭1.0g/L固体培养基中，先在温度为18℃的无光照条件下培养10天，再置于温度为22℃、每天光照15小时、光照强度为2000lx的条件下进行培养；培养30d后统计，其不定芽的分化率为87.96％，并且接入的每个外植体上平均可产生8.74个不定芽；

(4)无根苗的生根培养

切取步骤(3)中培养的生长2cm以上、且基部膨大并形成有环节的不定芽作为无根苗，将无根苗转接入1/2MS+NAA0.1mg/L+活性炭3.0g/L生根培养基中，在温度为18℃、每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行生根培养；培养30d后统计，其生根率达91.75％，平均每株植物的生根条数为3～4；

(5)炼苗

选取在步骤(4)中生长状况良好的杜鹃兰再生植株，先打开培养瓶盖培养1d，再从培养瓶中取出再生植株，洗去其基部的培养基，稍晾干水分后，移栽至由草碳、蛭石、珍珠岩和沙按照2:1:1:1的比例混合制成且已消毒的基质中栽种，组培苗的存活率为100％；

上述除液体培养基外，其余培养基的蔗糖为20.0g/L、琼脂为5.5g/L，所有培养基的pH值均为5.5。

实施例3

(1)杜鹃兰球茎的培养

a.从已成熟且刚自然开裂的杜鹃兰果实中选取种子，将种子放入浓度为6.0％的次氯酸钙溶液中浸泡40min，再放入浓度为10.0％的过氧化氢溶液消毒6min，然后用无菌水洗涤5次后，接入White+活性炭1.0g/L+腺嘌呤8mg/L+蔗糖30g/L液体培养基中，在温度22℃、无光照条件下诱导培养40天；

b.将诱导培养30天后的种子转接入1/2MS+6BA3.0mg/L+TDZ0.6mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭2.0g/L培养基中，在温度为26℃、每天光照24小时、光照强度为3000lx的条件下培养60天，统计有69.53％的杜鹃兰芽体的基部生长有球茎；

(3)不定芽的诱导

将球茎外植体沿纵向对半切开，以伤口面平放在培养基表面的方式接入MS+6-BA0.5mg/L+2ip8.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+土豆泥50g/L+芋头泥50g/L+半胱氨酸5.0g/L+活性炭3.0g/L固体培养基中，先在温度为22℃的无光照条件下培养15天，再置于温度为26℃、每天光照24小时、光照强度为3000lx的条件下进行培养；培养30d后统计，其不定芽的分化率为95.73％，并且接入的每个外植体上平均可产生9.87个不定芽；

(4)无根苗的生根培养

切取步骤(3)中培养的生长2cm以上、且基部膨大并形成有环节的不定芽作为无根苗，将无根苗转接入1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭5.0g/L生根培养基中，在温度20℃、每天光照12小时、光照强度为1500lx的条件下进行生根培养；培养30d后统计，其生根率达100％，平均每株植物的生根条数为3～6；

(5)炼苗

选取在步骤(4)中生长状况良好的杜鹃兰再生植株，先打开培养瓶盖培养3d，再从培养瓶中取出再生植株，洗去其基部的培养基，稍晾干水分后，移栽至由草碳、蛭石、珍珠岩和沙按照2:1:1:1的比例混合制成且已消毒的基质中栽种，组培苗的存活率为100％；

上述除液体培养基外，其余培养基的蔗糖为40.0g/L、琼脂为7.5g/L，所有培养基的pH值均为6.5。

比较实施例1

在实施例1步骤(1)中，改选为未成熟的杜鹃兰果实中的种子，其他步骤同实施例1；统计结果显示没有基部生长有球茎的杜鹃兰芽体产生。

比较实施例2

在实施例1步骤(1)中，将经过液体培养后的种子，改为转接入1/2MS+6BA2mg·L^-1+NAA0.3mg·L-1的培养基中，其他步骤同实施例1；统计结果显示只有21％基部生长有球茎的杜鹃兰芽体产生。

比较实施例3

在实施例1步骤(1)中，将液体培养的条件改为在温度30℃、每天光照10h、光照强度为2500lx的条件下进行培养，其他步骤同实施例1；统计结果显示只有32.43％基部生长有球茎的杜鹃兰芽体产生。

比较实施例4

在实施例1步骤(2)中，改选直径为0.3cm的球茎作为外植体，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为29％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生2.38个不定芽。

比较实施例5

在实施例1步骤(3)中，将球茎的切割方式改为横向对半切开后接入芽培养基，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为42％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生1.97个不定芽。

比较实施例6

在实施例1步骤(3)中，改为将球茎外植体的伤口面向上接入培养基中，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为16％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生1.24个不定芽。

比较实施例7

在实施例1步骤(3)中，将固体培养基改为MS+6-BA0.3mg/L+2ip6.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+半胱氨酸3.5g/L+活性炭2.0g/L，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为37％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生3.98个不定芽。

比较实施例8

在实施例1步骤(3)中，将固体培养基改为MS+6-BA0.3mg/L+2,4-D1.0mg/L+土豆泥38g/L+芋艿糊40g/L+活性炭2.0g/L，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为41％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生4.71个不定芽。

比较实施例9

在实施例1步骤(3)中，取消在无光照条件下培养的步骤，其他步骤同实施例1；其不定芽的分化率仅为39％，并且接入的每个外植体上平均仅可产生5.01个不定芽。

比较实施例10

在实施例1步骤(4)中，改选基部未膨大且没有环节形成的不定芽作为无根苗，其他步骤同实施例1；其生根率为0％。

比较实施例11

在实施例1步骤(4)中，改选基部膨大但还没有环节形成的不定芽作为无根苗，其他步骤同实施例1；其生根率仅为6.4％，平均每株植物的生根条数为1～2。

Claims

1.一种杜鹃兰再生植株的快速培育方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)杜鹃兰球茎的培养

b.将诱导培养30天后的种子转接入1/2MS+6BA 1.0～3.0mg/L+TDZ 0.3～0.6mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+活性炭1.0～2.0g/L+蔗糖20～40.0g/L+琼脂5.5～7.5g/L培养基中，在温度为22～26℃、每天光照15～24小时和光照强度为2000～3000lx的条件下培养40～60天，获得基部生长有球茎的杜鹃兰芽体；

(3)不定芽的诱导

将球茎外植体沿纵向对半切开，以伤口面平放在培养基表面的方式接入MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+2ip 4～8mg/L+2,4-D 0.3～2.0mg/L+土豆泥25～50g/L+芋头泥20～50g/L+半胱氨酸2.0～5.0g/L+活性炭1.0～3.0g/L+蔗糖20～40.0g/L+琼脂5.5～7.5g/L固体培养基中，先在温度为18～22℃和无光照条件下培养10～15天，再置于温度为22～26℃、每天光照15～24小时、光照强度为2000～3000lx的条件下诱导培养不定芽；

(4)无根苗的生根培养

选取步骤(3)中生长2cm以上、且基部膨大并形成有环节的不定芽作为无根苗，将无根苗接入1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+活性炭3.0～5.0g/L+蔗糖20～40.0g/L+琼脂5.5～7.5g/L生根培养基中，在温度18～20℃、每天光照8～12小时和光照强度为1000～1500lx的条件下进行生根培养；

(5)炼苗

选取在步骤(4)中生长状况良好的杜鹃兰再生植株，先打开培养瓶盖培养1～3d，再从培养瓶中取出，移栽至已消毒的基质中栽培。

2.根据权利要求1所述的杜鹃兰再生植株的快速培育方法，其特征在于：步骤(1)a中所述消毒处理是指先将杜鹃兰种子放入浓度为2.0～6.0％的次氯酸钙溶液中浸泡20～40min，再放入浓度为5.0～10.0％的过氧化氢溶液消毒3～6min，最后用无菌水洗涤2～5次。

3.根据权利要求1所述的杜鹃兰再生植株的快速培育方法，其特征在于：步骤(5)中所述基质由草炭、蛭石、珍珠岩和沙按照2:1:1:1的比例混合制成。