CN106035088A - 一种白芨组培快繁方法及运用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：外植体灭菌方法、白芨种子无菌萌发、种胚形态及种胚突破种皮过程观察、白芨的组培快繁和用TTC法测定白芨种子活力。本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产，应用价值高。

Description

一种白芨组培快繁方法及运用

技术领域

本发明涉及中药材种植技术领域，更具体地说，尤其涉及一种白芨组培快繁方法。同时，本发明还涉及一种白芨抗氧化的运用。

背景技术

白芨，属兰科植物白芨属的一种，为多年生草本植物，具有较高的观赏价值；其干燥假鳞茎为我国民间传统中药材，具有极高的药用价值，其味苦、甘、涩，性凉，归肺、胃、肝经。功能收敛止血、消肿生肌，主治肺胃出血、外伤出血、痈肿疮疡、皮肤毅裂、水火烫伤等。白芨较高的观赏价值和极高的药用价值，导致市场需求量不断增长，据不完全统计，目前白芨市场需求量己达到4000吨以上，其中药厂使用量为2000余吨(其中葵花药业月需求80吨，年需求1000余吨；江中制药需求30吨)；出口韩国、台湾和香港50吨/月，主要用于化妆品生产；全国医院药房等50吨/月。长期以来白芨中药材主要以野生为主，随着需求量的增加，导致野生白芨被过度采挖；同时，由于自然生境的破坏也加剧了野生白芨资源的减少，野生白芨己濒临灭绝，己被中国列为重点保护的野生药用植物之一。白芨的可持续利用己引起人们的关注，但白芨种子自然萌发率低，目前主要以分株方式进行繁殖，繁殖率低、繁殖速度慢；白芨每个葫果具有数万粒种子，采用种子进行组培快繁，可短期内大量繁殖种苗，是解决白芨种苗问题的必由之路，但组培苗炼苗栽培技术还不成熟，组培苗移栽成活率低且周期长，己成为白芨产业化的瓶颈，通过了解白芨的自然萌发生长特性，在此基础上研究制定组培苗及移栽技术是解决这一瓶颈的关键。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种白芨组培快繁方法及运用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：

S1、外植体灭菌方法：首先用流水冲洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸馏水冲洗2-3遍，在超净工作台上先用75％酒精消毒2-3min，再用10％次氯酸钠溶液浸泡8-12min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4-6遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；

S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面；

S3、白芨种子无菌萌发：基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/L；培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；

S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121℃下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌发培养基：(1)MS；(2)MS+NAA 1.0mg/L；原球茎、叶片诱导培养基见表1；白芨生根培养基MS+NAA 1.0mg/L；置于光强2000-2500lx，光周期16h/8h，温度23-27℃的条件下培养；

S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察：接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率表示，结果取平均值，有胚率＝(有胚的种子数/总种子数)×100％；

S6、白芨的组培快繁：将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片切割长度在0.35-0.6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；

S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF)；如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅。

优选的，

在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：

选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管中至0.25ml刻度处，加入1％TTC溶液1ml在30℃黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和种子活力，各样品重复3次；有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。

优选的，在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7.0g/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L)；共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L；处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L；处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L；处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L；处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L；每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。

优选的，本发明采用组培瓶规格为240ml高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加量均为30ml。

本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，

(一)对铁原子还原能力的影响：

以1mg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加甲醇至0.3mL，各加入PH＝6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加1％铁氰化钾0.5mL；混合均匀后，50℃水浴20min；水浴结束后，再每只试管中加入10％三氯乙酸0.5mL，离心(3000转/分钟)10min；离心结束后，取上清液1mL，加入蒸馏水1mL，再加入0.1mL 0.1％三氯化铁；将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的0.1mL 0.1％三氯化铁改成0.1mL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度；平行3份；将上述加入的药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；

(二)对DPPH清除能力的影响：

取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加入适量甲醇至体积为2.425mL(即用移液枪精密吸取2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇)，加入0.075m LDPPH(取DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可)，立即混匀；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC₅₀；同时，以1mg/mL的没食子酸为阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC₅₀；

清除率(％)＝(A_DPPH-A_药物)/A_DPPH×100％。

本发明提供的一种白芨组培快繁方法，与现有技术相比：

第一，本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产，应用价值高；

第二，白芨的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制白芨的质量；

第三使用本发明提供的快繁技术得到白芨幼苗，进行人工栽培，移栽成活率比组培苗要高，更能快速适应自然环境，能缩短白芨种植年限。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：

S1、外植体灭菌方法：首先用流水冲洗蒴果26min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸馏水冲洗2遍，在超净工作台上先用75％酒精消毒2min，再用10％次氯酸钠溶液浸泡8min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；

S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面；

S3、白芨种子无菌萌发：基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/L；培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；

S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121℃下灭菌12min，每处理4次重复；白芨萌发培养基：(1)MS；(2)MS+NAA 1.0mg/L；原球茎、叶片诱导培养基见表1；白芨生根培养基MS+NAA 1.0mg/L；置于光强2000-2500lx，光周期16h/8h，温度23-27℃的条件下培养；

在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7.0g/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L)；共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L；处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L；处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L；处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L；处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L；每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格为240ml高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加量均为30ml。

S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察：接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率表示，结果取平均值，有胚率＝(有胚的种子数/总种子数)×100％；

S6、白芨的组培快繁：将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片切割长度在0.35，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；

S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF)；如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅。

在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：

选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管中至0.25ml刻度处，加入1％TTC溶液1ml在30℃黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和种子活力，各样品重复3次；有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。

本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，

(一)对铁原子还原能力的影响：

以1mg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加甲醇至0.3mL，各加入PH＝6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加1％铁氰化钾0.5mL；混合均匀后，50℃水浴20min；水浴结束后，再每只试管中加入10％三氯乙酸0.5mL，离心(3000转/分钟)10min；离心结束后，取上清液1mL，加入蒸馏水1mL，再加入0.1mL 0.1％三氯化铁；将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的0.1mL 0.1％三氯化铁改成0.1mL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度；平行3份；将上述加入的药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；

(二)对DPPH清除能力的影响：

取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加入适量甲醇至体积为2.425mL(即用移液枪精密吸取2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇)，加入0.075m LDPPH(取DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可)，立即混匀；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC₅₀；同时，以1mg/mL的没食子酸为阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC₅₀；

清除率(％)＝(A_DPPH-A_药物)/A_DPPH×100％。

实施例2

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：

S1、外植体灭菌方法：首先用流水冲洗蒴果28min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸馏水冲洗3遍，在超净工作台上先用75％酒精消毒3min，再用10％次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；

S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面；

S3、白芨种子无菌萌发：基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/L；培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；

S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121℃下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌发培养基：(1)MS；(2)MS+NAA 1.0mg/L；原球茎、叶片诱导培养基见表1；白芨生根培养基MS+NAA 1.0mg/L；置于光强2000-2500lx，光周期16h/8h，温度26℃的条件下培养；

在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7.0g/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L)；共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L；处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L；处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L；处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L；处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L；每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格为240ml高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加量均为30ml。

S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察：接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率表示，结果取平均值，有胚率＝(有胚的种子数/总种子数)×100％；

S6、白芨的组培快繁：将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片切割长度在0.5，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；

S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF)；如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅。

在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：

选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管中至0.25ml刻度处，加入1％TTC溶液1ml在30℃黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和种子活力，各样品重复3次；有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。

本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，

(一)对铁原子还原能力的影响：

以1mg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加甲醇至0.3mL，各加入PH＝6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加1％铁氰化钾0.5mL；混合均匀后，50℃水浴20min；水浴结束后，再每只试管中加入10％三氯乙酸0.5mL，离心(3000转/分钟)10min；离心结束后，取上清液1mL，加入蒸馏水1mL，再加入0.1mL 0.1％三氯化铁；将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的0.1mL 0.1％三氯化铁改成0.1mL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度；平行3份；将上述加入的药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；

(二)对DPPH清除能力的影响：

取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加入适量甲醇至体积为2.425mL(即用移液枪精密吸取2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇)，加入0.075m LDPPH(取DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可)，立即混匀；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC₅₀；同时，以1mg/mL的没食子酸为阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC₅₀；

清除率(％)＝(A_DPPH-A_药物)/A_DPPH×100％。

表1白芨对铁原子还原能力结果

实验研究结果表明，随着加药量的增加，吸光度值逐渐增加，还原能力增加，表明白及块茎和须根以及阳性对照没食子酸均是良好的电子供应者，供应的电子可以使体系中的Fe+还原成Fe}+，还可以与自由基结合成为较为惰性的物质，以中断自氧化链锁反应，结果见下表。从实验结果可以看出，普通方式繁殖的白及与组培方式繁殖的白及对铁原子还原能力没有统计学差异。

表2白芨对DPPH自由基清除能力结果

考察白及对DPPH自由基的清除能力，结果发现白及对DPPH具有较强的清除能力，并呈一定的量效关系。不同繁殖方式得到的白及药材对DPPH自由基的清除能力没有统计学差异。

实施例3

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：

S1、外植体灭菌方法：首先用流水冲洗蒴果32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸馏水冲洗3遍，在超净工作台上先用75％酒精消毒3min，再用10％次氯酸钠溶液浸泡12min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗6遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；

S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面；

S3、白芨种子无菌萌发：基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/L；培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；

S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121℃下灭菌20min，每处理4次重复；白芨萌发培养基：(1)MS；(2)MS+NAA 1.0mg/L；原球茎、叶片诱导培养基见表1；白芨生根培养基MS+NAA 1.0mg/L；置于光强2000-2500lx，光周期16h/8h，温度27℃的条件下培养；

在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7.0g/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L)；共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L；处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L；处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L；处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L；处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L；每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格为240ml高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加量均为30ml。

S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察：接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率表示，结果取平均值，有胚率＝(有胚的种子数/总种子数)×100％；

S6、白芨的组培快繁：将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片切割长度在0.6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；

S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF)；如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅。

在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：

选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管中至0.25ml刻度处，加入1％TTC溶液1ml在30℃黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和种子活力，各样品重复3次；有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。

本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，

(一)对铁原子还原能力的影响：

以1mg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加甲醇至0.3mL，各加入PH＝6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加1％铁氰化钾0.5mL；混合均匀后，50℃水浴20min；水浴结束后，再每只试管中加入10％三氯乙酸0.5mL，离心(3000转/分钟)10min；离心结束后，取上清液1mL，加入蒸馏水1mL，再加入0.1mL 0.1％三氯化铁；将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的0.1mL 0.1％三氯化铁改成0.1mL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度；平行3份；将上述加入的药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；

(二)对DPPH清除能力的影响：

取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加入适量甲醇至体积为2.425mL(即用移液枪精密吸取2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇)，加入0.075m LDPPH(取DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可)，立即混匀；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC₅₀；同时，以1mg/mL的没食子酸为阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC₅₀；

清除率(％)＝(A_DPPH-A_药物)/A_DPPH×100％。

综上所述：第一，本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产，应用价值高；

第二，白芨的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制白芨的质量；

第三使用本发明提供的快繁技术得到白芨幼苗，进行人工栽培，移栽成活率比组培苗要高，更能快速适应自然环境，能缩短白芨种植年限。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种白芨组培快繁方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、外植体灭菌方法：首先用流水冲洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸馏水冲洗2-3遍，在超净工作台上先用75％酒精消毒2-3min，再用10％次氯酸钠溶液浸泡8-12min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4-6遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；

S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面；

S3、白芨种子无菌萌发：基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/L；培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；

S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121℃下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌发培养基：(1)MS；(2)MS+NAA 1.0mg/L；原球茎、叶片诱导培养基见表1；白芨生根培养基MS+NAA1.0mg/L；置于光强2000-2500lx，光周期16h/8h，温度23-27℃的条件下培养；

S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察：接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率表示，结果取平均值，有胚率＝(有胚的种子数/总种子数)×100％；

S6、白芨的组培快繁：将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片切割长度在0.35-0.6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；

S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF)；如果种胚死亡或种胚生活力衰退，则不能染色或染色较浅。

2.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于：在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：

选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5m1离心管中至0.25m1刻度处，加入1％TTC溶液1ml在30℃黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和种子活力，各样品重复3次；有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。

3.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于：在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7.0g/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L)；共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L；处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L；处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L；处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L；处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L；每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用CanonG12数码相机拍照保存图片资料。

4.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于：本发明采用组培瓶规格为240m1高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加量均为30m1。

5.一种权利要求1所述的白芨抗氧化的运用，其特征在于：

(一)对铁原子还原能力的影响：

以1mg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加甲醇至0.3mL，各加入PH＝6.6的磷酸缓冲溶液0.5mL，再加1％铁氰化钾0.5mL；混合均匀后，50℃水浴20min；水浴结束后，再每只试管中加入10％三氯乙酸0.5mL，离心(3000转/分钟)10min；离心结束后，取上清液1mL，加入蒸馏水1mL，再加入0.1mL 0.1％三氯化铁；将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的0.1mL 0.1％三氯化铁改成0.1mL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度；平行3份；将上述加入的药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；

(二)对DPPH清除能力的影响：

取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，加入适量甲醇至体积为2.425mL(即用移液枪精密吸取2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇)，加入0.075m LDPPH(取DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可)，立即混匀；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC₅₀；同时，以1mg/mL的没食子酸为阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC₅₀；

清除率(％)＝(A_DPPH-A_药物)/A_DPPH×100％。