CN107306790A - 白及微块茎的组培快繁方法 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
本发明涉及白及微块茎的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)白及果实的选择、(2)无菌播种、(3)种胚萌发培养、(4)芽分化培养、(5)生根与微块茎诱导培养。本发明提供的白及微块茎的组培快繁方法，在不同生长阶段给予不同光照强度与培养温度，促进白及种胚高效萌发，及其萌发后及时分化叶原基形成芽体，生根与块茎形成在同一培养基中诱导完成，实现种子萌发与叶芽分化、生根成苗与微块茎诱导同步完成，诱导率高，种苗质量高和移栽成活率高，实现白及种苗的优质生产，能有效保护和抢救野生资源，还能满足规模化生产的需求。
Description
技术领域
本发明涉及白及组织培养方法，尤其涉及白及微块茎的组培快繁方法。
背景技术
白及Bletilla striat为兰科白及属(Bletilla Rchb.f.)植物，为多年生宿根草本，地下部假鳞茎块根状，又称良姜、紫兰、甘根、连及草，为我国传统中药材，1977年以后各版《中国药典》均有收载。其味苦、甘、涩；性微寒，归肺、肝、胃经，具有收敛止血,消肿生肌的功能。主要用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咳血、溃疡病出血等。现代研究发现块根含有近5O种化合物，在医药、化工、食品等方面的应用前景十分广阔，综合利用潜力很大。近年来野生资源遭到了无限制采挖，加上生态环境的破坏，野生资源量急剧减少，价格也逐年攀升，已被我国列为珍稀濒危保护植物，同时也被列入《濒危动植物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ中，受到国际保护。因此需要引导和开展人工栽培满足市场需求及保护野生白及资源。长期以来，白及种植常常以分割块茎的方式进行繁殖种苗，不仅繁殖系数低、周期长、耗种量大，且易导致病毒累积，种苗成本居高不下。白及种子非常细小且无胚乳，自然条件下萌发率极低，而种子非共生培养则能获得萌发，已有白及种子无菌播种繁育种苗的研究报道和公开的专利，有的采用“种子萌发原球茎→原球茎增殖→分化芽→生根培养”的组织培养途径，有的采用“种子萌发原球茎→分化芽→诱导芽增殖丛生芽→生根培养”的途径，也有“种子萌发原球茎→分化芽→生根培养”的培养途径。以上组培育苗途径和培养方法极易分化出丛生苗，苗体纤细瘦弱，生长缓慢，很难形成微块茎，种苗生产存在培养周期长、种苗易老化、质量参差不齐、移栽成活率较低、或者增殖率低、种植后块茎产量低等诸多问题，尚未能实现种苗工业化生产。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的问题，提供白及微块茎的组培快繁方法，该方法在种胚萌发培养和芽分化培养阶段诱导种子高效萌发并快速分化出叶，在生根与微块茎诱导培养阶段促使微块茎形成与根分化同步进行，实现了使种子萌发率提高、快速繁育形成微块茎，缩短白及组培育苗周期，提高田间种植块茎药材的产量，克服试管苗易老化、移栽成活率低、块茎药材产量低等目的。该项技术操作简便，生产周期短，节省成本，成苗率高，实用性强，为白及种业的产业化提供新方法。
本发明通过以下技术方案实现：
白及微块茎的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)白及果实的选择：选择外表颜色为黄绿色、黄色或褐色且饱满、未开裂的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡45秒以上，然后置于质量百分比浓度为0.12-0.25％的升汞溶液中消毒8-15分钟，之后用无菌水冲洗3-5次后，切开果皮，将黄白色或黄色或褐色的粉状种子均匀撒播在种胚萌发培养基表面；
(3)种胚萌发培养：将上述撒播了种子后的种胚萌发培养基置于温度为15-25℃且无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(4)芽分化培养：在上述步骤(3)种胚萌发培养7-20天的时候，观察种胚，当种胚陆续膨大、萌发形成白色或乳黄色的尚未突破种皮的近球状体时，转入以下条件进行光照培养：光照强度为2000-2500lx，光照时间8-10小时/天，培养温度15-25℃；光照培养10-20天，当种胚由白色转为绿色，近球状体顶端分生组织陆续分化出子叶、子叶分化发育形成具2-3片叶的芽体，且95％以上的球状体发育形成芽体时转入下一阶段培养；
所述芽分化培养中，注意在种胚膨大发育尚未突破种皮时及时进行光照培养，诱导叶原基分化，以避免形成根原基。在原球茎形成初期由黑暗转移到光照条件下分化出子叶，利于诱导健壮芽体及微块茎，培养过程减少了现有技术的原球茎培养阶段。
(5)生根与微块茎诱导培养：将上述步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行第一阶段的生根光照培养；光照培养条件为：光照强度1300-1700lux，每天光照10-13小时，温度18-28℃，培养时间40-65天；
当观察芽体基部膨大，并且有的在膨大处萌生出3-5条白色根系，有的膨大呈1mm左右球状并在其周边长出1-3条细根时，接着进行第二阶段的诱导微块茎光照培养；光照培养条件为：光照强度为1000-1500lux，每天光照6-8小时，温度为17-23℃，培养20-30天；直至诱导培养根芽交界处膨大形成2mm以上近球形的微块茎，且上部叶片展开、叶长3cm及以上。
进一步地，所述白及微块茎的组培快繁方法还包括步骤(6)继代培养：将上述步骤(5)生根与微块茎诱导培养得到的微块茎的种苗切去叶片和根系，然后分割微块茎重复步骤(5)的生根与微块茎诱导培养，在微块茎的叶痕处分化出数个粗壮的不定芽后，继续培养不定芽基部形成小块茎。
继代培养实现了微块茎和植株的增殖,平均增殖倍数3.63。所述的继代培养条件与生根与微块茎诱导培养条件相同。由此继代长出的芽非常粗壮，是种子苗不可相比的，切割再次转移继代培养，生长优势突出，长势旺盛，移栽成活率高，且药材的产量也比种子苗的块茎产量高。
本发明进一步提供种胚萌发培养基，它同时综合N6和B5培养基的特点，合理调整培养基中的S元素和N元素的用量，并在此基础上添加了椰汁和玉米粉等有机物，椰汁和玉米粉两种有机物的协同增效作用促使白及种胚快速吸水膨大、萌发。
步骤(2)所述种胚萌发培养基按照浓度计包括以下组分：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1950mg/L、硫酸铵200mg/L、氯化钙230-300mg/L、硝酸钙80mg/L、硫酸镁250-360mg/L、磷酸二氢钾180-190mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.0mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素1.2-2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.4mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇130mg/L、甘氨酸1.0mg/L、椰汁40-60ml/L、玉米粉40-200g/L和蔗糖10-20g/L及琼脂6-8g/L。该培养基是改良MS一号培养基加椰汁40-60ml/L、玉米粉40-200g/L和蔗糖10-20g/L及琼脂6-8g/L。
本发明进一步提供生根与微块茎诱导培养基，该培养基以MS为基础培养基同时综合了N6和B5培养基的特点，调整了N元素和S元素的用量，大幅提高了盐酸硫胺素等有机物使用量及其配比，有效降低了不利于生长发育的有害物质对试管苗的毒害作用；只添加生长素萘乙酸(NAA)而没有添加细胞分裂素，利于芽体伸长而不分化丛生苗，在蛋白胨的作用下更有利于培养健壮芽体；添加的玉米粉不仅含有丰富的蛋白质、淀粉和脂肪等营养物质，而且富含粗纤维，与萘乙酸协同诱导发根壮根，促进了微块茎诱导和的继代培养。
步骤(5)所述生根与微块茎诱导培养基按照浓度计包括：硝酸铵1200mg/L、硝酸钾2000mg/L、硫酸铵230mg/L、氯化钙280-330mg/L、硝酸钙100-150mg/L、硫酸镁200-300mg/L、磷酸二氢钾180-250mg/L、碘化钾0.85-0.95mg/L、硼酸4.5mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素2-10mg/L、盐酸吡哆醇1.8mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇125mg/L、生物素0.4mg/L、甘氨酸1.3mg/L、0.2-0.4mg/L萘乙酸(NAA)、0.02-0.04mg/L多效唑、30-45g/L香蕉、0.5-2.0g/L蛋白胨、50-100g/L玉米粉、28-50g/L蔗糖、6-7g/L和6-7g/L琼脂。该培养基是改良MS二号培养基加30-45g/L香蕉、0.5-2.0g/L蛋白胨、50-100g/L玉米粉、28-50g/L蔗糖、6-7g/L和6-7g/L琼脂。
进一步地，步骤(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或异株人工授粉。
本发明的原理：本发明提供2种培养基配方，以MS为基础培养基，综合N6和B5培养基的优点，添加了白及种子组培不同发育阶段所需要的有机物质，通过合理调整培养基中的S元素和N元素的用量，适时调整盐酸硫胺素等有机物使用量及其配比，有效降低了不利于生长发育的有害物质对试管苗的毒害作用。同时在不同生长阶段给予不同光照强度，促进白及种胚萌动后及时分化叶原基，实现种子萌发、叶芽分化、块茎形成及生根同步进行，萌发率最高可以达到97％。培养过程不经过原球茎阶段，缩短培养时间近50天，降低了生产成本。培养得到的白及种苗浓绿健壮、长势旺盛、移栽成活率高、块茎大，培养周期短，能有效提高田间种植的块茎发育速度，提高药材产量。
本发明所提供的一种白及微块茎的快速繁殖方法，对比现有技术有如下优点：
1)本发明提供的白及微块茎的组培快繁方法，在不同生长阶段给予不同光照强度与培养温度，促进白及种胚高效萌发，及其萌发后及时分化叶原基形成芽体，生根与块茎形成在同一培养基中诱导完成，实现种子萌发与叶芽分化、生根成苗与微块茎诱导同步完成，诱导率高，种苗质量高和移栽成活率高，实现白及种苗的优质生产，能有效保护和抢救野生资源，还能满足规模化生产的需求。
2)本发明结合改良的2种培养基配方和3种光照培养条件，通过合理调整MS基本培养基中的S元素和N元素的用量，以及适时调整盐酸硫胺素等有机物质使用量及其配比，从而能协同增效作用促使白及种胚快速吸水膨大、萌发；更有利于培养健壮芽体。
3)继代培养实现了微块茎和植株的增殖,平均增殖倍数3.63。由此继代长出的芽非常粗壮，是种子苗不可相比的，切割再次转移继代培养，生长优势突出，长势旺盛，移栽成活率高，且药材的产量也比种子苗的块茎产量高。
4)本发明的培养方法促进白及种子高效萌发，不经历原球茎阶段，能快速分化叶和芽，无需经历壮苗阶段直接诱导出微块茎，诱导率高，种子萌发率可达97％，微块茎诱导率达181％以上，缩短培养时间50天左右，降低了生产成本。培养得到的白及种苗与微块茎浓绿健壮、长势旺盛、移栽成活率高，培养周期短，能有效提高田间种植的块茎发育速度，提高产量。
5)本发明操作简便，具有投入少、产出高的特点，生产周期短，可操作性强，应用价值高，适于工厂化规模化生产。
6)本发明利用种子进行有性繁殖，能够在一定时间内获得数量巨大的可供遗传利用的种苗，还能经过筛选获得大量的性状优良的株系与品系，应用前景广阔。
附图说明
图1为采用不同添加物对白及种子萌发率影响的结果；
图2为诱导萌发的白及芽体；
图3为具微块茎的白及植株；
图4为分割微块茎增殖培养萌发不定芽；
图5为移栽试管苗基部生成的块茎。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
根据本发明提出的白及微块茎的组培快繁方法可选因素较多，可以设计出多种实施例，因此具体的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。为了具体的描述本发明，有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，选择以下实施例进行示例性说明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明未述部分与现有技术相同。
实施例1
本发明白及微块茎的组培快繁方法
白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)白及果实的选择：选择外表颜色为黄绿色、黄色或褐色且饱满、未开裂的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70％的酒精浸泡45秒以上，然后置于质量百分比浓度为0.12％的升汞溶液中消毒8分钟，之后用无菌水冲洗3次后，切开果皮，将黄白色或黄色或褐色的粉状种子均匀撒播在种胚萌发培养基表面；
(3)种胚萌发培养：将上述撒播了种子后的种胚萌发培养基置于温度为15℃且无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(4)芽分化培养：在上述步骤(3)种子萌发培养7天的时候，观察种胚，当种胚陆续膨大、萌发形成白色或乳黄色的尚未突破种皮的近球状体时，接着在以下条件进行光照培养：光照强度为2000lx，光照时间8小时/天，培养温度15℃；光照10-20天时，当种胚由白色转为绿色，近球状体顶端分生组织陆续分化出子叶、子叶分化发育形成具2-3片叶的芽体，且95％以上的球状体发育形成芽体时转入下一阶段培养；
(5)生根与微块茎诱导培养：将上述步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行第一阶段的生根光照培养；光照培养条件为：光照强度1300lux，每天光照10小时，温度18℃，培养时间40天；
当观察芽体基部膨大，并且有的在膨大处萌生出3条白色根系，有的膨大呈1mm左右球状并在其周边长出1条细根时，接着进行第二阶段的诱导微块茎光照培养；光照培养条件为：光照强度为1000lux，每天光照6-8小时，温度为17℃，培养20天；直至诱导培养根芽交界处膨大形成2mm以上近球形的微块茎，且上部叶片展开、叶长3cm及以上。
步骤(2)所述种胚萌发培养基按照浓度计包括以下组分：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1950mg/L、硫酸铵200mg/L、氯化钙230mg/L、硝酸钙80mg/L、硫酸镁250mg/L、磷酸二氢钾180mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.0mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素1.2-2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.4mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇130mg/L、甘氨酸1.0mg/L、椰汁40ml/L、玉米粉40g/L和蔗糖10g/L及琼脂6-8g/L。
步骤(5)所述生根与微块茎诱导培养基按照浓度计包括：硝酸铵1200mg/L、硝酸钾2000mg/L、硫酸铵230mg/L、氯化钙280mg/L、硝酸钙100mg/L、硫酸镁200mg/L、磷酸二氢钾180mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.5mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素2-10mg/L、盐酸吡哆醇1.8mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇125mg/L、生物素0.4mg/L、甘氨酸1.3mg/L、0.2mg/L萘乙酸(NAA)、0.02mg/L多效唑、30g/L香蕉、0.5g/L蛋白胨、50g/L玉米粉、28g/L蔗糖、6g/L和6-7g/L琼脂。
步骤(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或异株人工授粉。
实施例2
本发明白及微块茎的组培快繁方法
白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)白及果实的选择：选择外表颜色为黄绿色、黄色或褐色且饱满、未开裂的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为85％的酒精浸泡45秒以上，然后置于质量百分比浓度为0.25％的升汞溶液中消毒15分钟，之后用无菌水冲洗5次后，切开果皮，将黄白色或黄色或褐色的粉状种子均匀撒播在种胚萌发培养基表面；
(3)种胚萌发培养：将上述撒播了种子后的种胚萌发培养基置于温度为25℃且无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(4)芽分化培养：在上述步骤(3)种子萌发培养20天的时候，观察种胚，当种胚陆续膨大、萌发形成白色或乳黄色的尚未突破种皮的近球状体时，接着在以下条件进行光照培养：光照强度为2500lx，光照时间10小时/天，培养温度25℃；光照培养10-20天，当种胚由白色转为绿色，近球状体顶端分生组织陆续分化出子叶、子叶分化发育形成具2-3片叶的芽体，且95％以上的球状体发育形成芽体时转入下一阶段培养；如图2所示的是诱导萌发的白及芽体。
(5)生根与微块茎诱导培养：将上述步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行第一阶段的生根光照培养；光照培养条件为：光照强度1700lux，每天光照13小时，温度28℃，培养时间65天；
当观察芽体基部膨大，并且有的在膨大处萌生出5条白色根系，有的膨大呈1mm左右球状并在其周边长出3条细根时，接着进行第二阶段的诱导微块茎光照培养；光照培养条件为：光照强度为1500lux，每天光照8小时，温度为23℃，培养30天；直至诱导培养根芽交界处膨大形成2mm以上近球形的微块茎，且上部叶片展开、叶长3cm及以上。如图3所示是具微块茎的白及植株。
(6)继代培养：将上述步骤(5)生根与微块茎诱导培养得到的微块茎的种苗切去叶片和根系，然后分割微块茎重复步骤(5)的生根与微块茎诱导培养，在微块茎的叶痕处分化出数个粗壮的不定芽后，继续培养不定芽基部形成小块茎。如图4所示的是分割微块茎增殖培养萌发不定芽
步骤(2)所述种胚萌发培养基按照浓度计包括以下组分：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1950mg/L、硫酸铵200mg/L、氯化钙300mg/L、硝酸钙80mg/L、硫酸镁360mg/L、磷酸二氢钾190mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.0mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.4mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇130mg/L、甘氨酸1.0mg/L、椰汁60ml/L、玉米粉200g/L和蔗糖20g/L及琼脂8g/L。
步骤(5)所述生根与微块茎诱导培养基按照浓度计包括：硝酸铵1200mg/L、硝酸钾2000mg/L、硫酸铵230mg/L、氯化钙330mg/L、硝酸钙150mg/L、硫酸镁300mg/L、磷酸二氢钾250mg/L、碘化钾0.85-0.95mg/L、硼酸4.5mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1.8mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇125mg/L、生物素0.4mg/L、甘氨酸1.3mg/L、0.4mg/L萘乙酸(NAA)、0.04mg/L多效唑、45g/L香蕉、2.0g/L蛋白胨、100g/L玉米粉、50g/L蔗糖、7g/L和6-7g/L琼脂。
步骤(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或异株人工授粉。
实施例3
本发明白及微块茎的组培快繁方法
白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)白及果实的选择：选择外表颜色为黄绿色、黄色或褐色且饱满、未开裂的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为80％的酒精浸泡45秒以上，然后置于质量百分比浓度为20％的升汞溶液中消毒10分钟，之后用无菌水冲洗4次后，切开果皮，将黄白色或黄色或褐色的粉状种子均匀撒播在种胚萌发培养基表面；
(3)种胚萌发培养：将上述撒播了种子后的种胚萌发培养基置于温度为20℃且无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(4)芽分化培养：在上述步骤(3)种子萌发培养13天的时候，观察种胚，当种胚陆续膨大、萌发形成白色或乳黄色的尚未突破种皮的近球状体时，接着在以下条件进行光照培养：光照强度为2200lx，光照时间9小时/天，培养温度20℃；光照培养10-20天，当种胚由白色转为绿色，近球状体顶端分生组织陆续分化出子叶、子叶分化发育形成具2-3片叶的芽体，且95％以上的球状体发育形成芽体时转入下一阶段培养；
(5)生根与微块茎诱导培养：将上述步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行第一阶段的生根光照培养；光照培养条件为：光照强度1500lux，每天光照12小时，温度22℃，培养时间55天；
当观察芽体基部膨大，并且有的在膨大处萌生出4条白色根系，有的膨大呈1mm左右球状并在其周边长出2条细根时，接着进行第二阶段的诱导微块茎光照培养；光照培养条件为：光照强度为1200lux，每天光照7小时，温度为20℃，培养22天；直至诱导培养根芽交界处膨大形成2mm以上近球形的微块茎，且上部叶片展开、叶长3cm及以上。
所述白及微块茎的组培快繁方法还包括步骤(6)继代培养：将上述步骤(5)生根与微块茎诱导培养得到的微块茎的种苗切去叶片和根系，然后分割微块茎重复步骤(5)的生根与微块茎诱导培养，在微块茎的叶痕处分化出数个粗壮的不定芽后，继续培养不定芽基部形成小块茎。
步骤(2)所述种胚萌发培养基按照浓度计包括以下组分：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1950mg/L、硫酸铵200mg/L、氯化钙280mg/L、硝酸钙80mg/L、硫酸镁300mg/L、磷酸二氢钾185mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.0mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素2.0mg/L、盐酸吡哆醇1.4mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇130mg/L、甘氨酸1.0mg/L、椰汁50ml/L、玉米粉120g/L和蔗糖15g/L及琼脂7g/L。
步骤(5)所述生根与微块茎诱导培养基按照浓度计包括：硝酸铵1200mg/L、硝酸钾2000mg/L、硫酸铵230mg/L、氯化钙300mg/L、硝酸钙120mg/L、硫酸镁250mg/L、磷酸二氢钾210mg/L、碘化钾0.90mg/L、硼酸4.5mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素7mg/L、盐酸吡哆醇1.8mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇125mg/L、生物素0.4mg/L、甘氨酸1.3mg/L、0.3mg/L萘乙酸(NAA)、0.03mg/L多效唑、37g/L香蕉、1.2g/L蛋白胨、75g/L玉米粉、41g/L蔗糖、7g/L和6g/L琼脂。
步骤(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或异株人工授粉。
表1不同基础培养基对白及种子萌发的影响
将白及种子播撒于下述各个培养基中，然后置于温度为15-25℃且无光照条件下培养诱导种子萌发种胚(MS、N6、B5和实施例1所述的种胚萌发培养基)，试验结果如表1所示。
从上表可知，采用本发明的培养基，萌发快速，且接种30d生长发育情况良好。
表2不同基础培养基对白及微块茎培养的影响
注：微块茎平均粒径＝(微块茎长经+微块茎短茎)/2
实施例2步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行生根光照培养(MS、N6、B5和实施例2所述的生根与微块茎诱导培养基)，然后按照实施例2所述的生根与微块茎培养，其它条件相同，从上表可知，采用本发明的培养基，微块茎诱导率高，微块茎平均粒径大，植株涨势好。
培养基中添加不同添加物对白及种子萌发的影响实验
(1)白及果实的选择：采集自然授粉的白及蒴果，选择果实饱满、外表颜色黄绿色或近黄色且未开裂者用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡60秒后，置于质量百分比浓度为0.15％升汞溶液中消毒8-10分钟，用无菌水冲洗干净后(一般冲洗3-5次即可)，切开果皮，将黄白色或黄色粉状物种子均匀撒播在种胚萌发的固体培养基表面，所述培养基分别为MS改良一号培养基加相同浓度(50g/L)的椰汁、玉米粉、马铃薯、玉米粉+椰汁、什么都没有添加；
(3)种胚萌发培养：接种后的培养瓶置于温度20±5℃、无光照条件下培养诱导种子萌发；
(4)萌发结果调查：图1表明，在MS改良一号培养基的基础上，分别添加椰汁、玉米粉、马铃薯、玉米粉+椰汁、什么都没有添加对白及种子萌发有一定的影响作用。结果显示：没有添加的对照萌发率最低，仅有40％左右，添加椰汁的萌发率约61％，添加马铃薯的萌发率67.32％与添加玉米粉(78.63％)及玉米粉+椰汁(96.71％)间具明显差异，同时添加玉米粉与椰汁表现出明显的促进萌发作用，不仅具有协同增效的促进作用，萌发率高达93.11％，远高于添加马铃薯的萌发率，而且配制培养基时无需制备马铃薯汁/泥，大大简化了程序，便于工厂化生产。
萘乙酸对白及微块茎形成和生长的影响
(1)将诱导分化发育的芽体转接至以下添加不同浓度萘乙酸(NAA)的生根与微块茎诱导培养基上，所述生根与微块茎诱导培养基以MS为基础培养基调整形成的MS改良二号培养基，分别添加0.02mg/L多效唑、35g/L香蕉、1.0g/L蛋白胨、50g/L玉米粉和50g/L蔗糖及7g/L琼脂粉上，萘乙酸(NAA)的浓度为0-0.6mg/L进行比较。
(2)接种的培养瓶置于室温23±5℃，光照强度1300-1700lux，每天光照10小时的条件下培养40-65天。此时需调整光照条件诱导微块茎形成。所述诱导微块茎的光照条件为光照度1000-1500lux，每天光照6-8小时，培养温度为20±3℃，培养20-30天。
(3)微块茎形成的调查：结果见表3。萘乙酸(NAA)对白及微块茎形成有显著的促进作用，没有添加NAA，则微块茎诱导率仅8.7％；NAA浓度越高，诱导率越高，但微块茎越小，可利用率也小。综合考量微块茎诱导率和大小，NAA的浓度以0.2-0.4mg/L为宜。
表3萘乙酸对白及微块茎形成和生长的影响
| 萘乙酸NAA(mg/L) | 微块茎诱导率(％) | 微块茎平均粒径(mm) |
| 0 | 8.7 | 0.79 |
| 0.1 | 53.1 | 1.16 |
| 0.2 | 167 | 4.17 |
| 0.3 | 198 | 3.63 |
| 0.4 | 284 | 3.12 |
| 0.5 | 330.3 | 1.20 |
| 0.6 | 341 | 0.77 |
蛋白胨对白及微块茎形成和生长的影响
(1)将诱导分化发育的芽体转接至以下添加不同浓度蛋白胨的生根与微块茎诱导培养基上，所述生根与微块茎诱导培养基以MS为基础培养基调整形成的MS改良二号培养基，分别添加0.3mg/L萘乙酸(NAA)、0.02mg/L多效唑、35g/L香蕉、50g/L玉米粉和50g/L蔗糖及7g/L琼脂粉上，蛋白胨的试验浓度为0-3.0mg/L进行比较。
(2)接种的培养瓶置于室温23±5℃，光照强度1300-1700lux，每天光照10小时的条件下培养40-65天。此时需调整光照条件诱导微块茎形成。所述诱导微块茎的光照条件为光照度1000-1500lux，每天光照6-8小时，培养温度为20±3℃，培养20-30天。
(3)微块茎形成的调查：结果见表4。蛋白胨对微块茎的形成和发育有影响，随着蛋白胨浓度的提高，块茎增大明显，浓度达2.5mg/l时，微块茎达最大，但诱导率下降明显，且出现死苗块茎软、烂。可见，蛋白胨促进微块茎发育增大，高浓度对种苗有一定的毒害作用，死苗比例随着蛋白胨浓度提高增大。
表4蛋白胨对白及微块茎形成和生长的影响
玉米粉对白及微块茎形成和生长的影响
(1)将诱导分化发育的芽体转接至以下添加不同浓度玉米粉的生根与微块茎诱导培养基上，所述生根与微块茎诱导培养基以MS为基础培养基调整形成的MS改良二号培养基，添加0.3mg/L萘乙酸(NAA)、0.02mg/L多效唑、35g/L香蕉、50g/L玉米粉和50g/L蔗糖及7g/L琼脂粉上，蛋白胨的试验浓度为0-3.0mg/L进行比较。
(2)接种的培养瓶置于室温23±5℃，光照强度1300-1700lux，每天光照10小时的条件下培养40-65天。此时需调整光照条件诱导微块茎形成。所述诱导微块茎的光照条件为光照度1000-1500lux，每天光照6-8小时，培养温度为20±3℃，培养20-30天。
(3)微块茎形成的调查：结果见表5。玉米粉促进微块茎形成作用明显，随着浓度提高诱导率提高明显，微块茎则随之变小，植株的下部叶片黄化，根细长，出现死苗现象。
表5玉米粉对白及微块茎形成和生长的影响
Claims (5)
1.白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)白及果实的选择：选择外表颜色为黄绿色、黄色或褐色且饱满、未开裂的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡45秒以上，然后置于质量百分比浓度为0.12-0.25％的升汞溶液中消毒8-15分钟，之后用无菌水冲洗3-5次后，切开果皮，将黄白色或黄色或褐色的粉状种子均匀撒播在种胚萌发培养基表面；
(3)种胚萌发培养：将上述撒播了种子后的种胚萌发培养基置于温度为15-25℃且无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(4)芽分化培养：在上述步骤(3)种胚萌发培养7-20天的时候，观察种胚，当种胚陆续膨大、萌发形成白色或乳黄色的尚未突破种皮的近球状体时，接着在以下条件进行光照培养：光照强度为2000-2500lx，光照时间8-10小时/天，培养温度15-25℃；光照培养10-20天，直至95％以上的球状体或近球状体发育形成芽体时转入下一阶段培养
(5)生根与微块茎诱导培养：将上述步骤(4)芽分化培养发育出的芽体接种至生根与微块茎诱导培养基上进行第一阶段的生根光照培养；光照培养条件为：光照强度1300-1700lux，每天光照10-13小时，温度18-28℃，培养时间40-65天；
当观察芽体基部膨大，有的芽体在膨大处萌生出3-5条白色根系，有的芽体基部膨大呈1mm左右球状并在其周边长出1-3条细根时，接着进行第二阶段的诱导微块茎光照培养；光照培养条件为：光照强度为1000-1500lux，每天光照6-8小时，温度为17-23℃，培养20-30天；直至诱导培养根芽交界处膨大形成2mm以上近球形的微块茎，且上部叶片展开、叶长3cm及以上。
2.根据权利要求1所述的白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：所述白及微块茎的组培快繁方法还包括步骤(6)继代培养：将上述步骤(5)生根与微块茎诱导培养得到的微块茎的种苗切去叶片和根系，然后分割微块茎重复步骤(5)的生根与微块茎诱导培养，在微块茎的叶痕处分化出数个粗壮的不定芽后，继续培养不定芽基部形成小块茎。
3.根据权利要求1或2所述的白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：步骤(2)所述种胚萌发培养基按照浓度计包括以下组分：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1950mg/L、硫酸铵200mg/L、氯化钙230-300mg/L、硝酸钙80mg/L、硫酸镁250-360mg/L、磷酸二氢钾180-190mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸4.0mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素1.2-2.5mg/L、盐酸吡哆醇1.4mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇130mg/L、甘氨酸1.0mg/L、椰汁40-60ml/L、玉米粉40-200g/L和蔗糖10-20g/L及琼脂6-8g/L。
4.根据权利要求1或2所述的白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：步骤(5)所述生根与微块茎诱导培养基按照浓度计包括：硝酸铵1200mg/L、硝酸钾2000mg/L、硫酸铵230mg/L、氯化钙280-330mg/L、硝酸钙100-150mg/L、硫酸镁200-300mg/L、磷酸二氢钾180-250mg/L、碘化钾0.85-0.95mg/L、硼酸4.5mg/L、硫酸锰20.3mg/L、硫酸锌6.2mg/L、钼酸钠0.31mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸铁27.8mg/L、盐酸硫胺素2-10mg/L、盐酸吡哆醇1.8mg/L、烟酸0.75mg/L、肌醇125mg/L、生物素0.4mg/L、甘氨酸1.3mg/L、0.2-0.4mg/L萘乙酸(NAA)、0.02-0.04mg/L多效唑、30-45g/L香蕉、0.5-2.0g/L蛋白胨、50-100g/L玉米粉、28-50g/L蔗糖、6-7g/L和6-7g/L琼脂。
5.根据权利要求1所述的白及微块茎的组培快繁方法，其特征在于：步骤(1)所述的蒴果是采用人工授粉或者自然授粉得到的蒴果，所述的人工授粉包括同株人工授粉或异株人工授粉。
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