CN105340741B - 一种提高对叶百部组培苗生根率的方法 - Google Patents

一种提高对叶百部组培苗生根率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：选择百部顶芽作为外植体，对外植体进行无菌处理；切茎尖，转入诱导培养基培养28‑35d，得到无菌苗；将无菌苗切割为1.0～1.5cm的带芽切段接种于增殖培养基，诱导丛生芽，培养时间为18‑25d，得到无菌芽；将无菌芽切成带芽茎段接种于生根培养基；得到生根苗后于常温下遮阴处炼苗处理，然后移栽到草炭或黄心土基质中。该方法培养的对叶百部组培苗的生根率可达95％；生根苗的成活率可达99％，且生根率稳定性好，有效解决了对叶百部组培苗难于生根和生根率低的难题，降低了生产成本。

Description

一种提高对叶百部组培苗生根率的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，涉及一种提高对叶百部组培苗生根率的方法。
背景技术
对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)主产于广西、湖南、贵州等省，为《中华人民共和国药典》(2005、2010年版)所收载。具有归肺经，性微温，味甘、苦，具有润肺下气止咳、杀虫灭虱等效果，用于新久咳嗽、肺痨咳嗽和百日咳；外用于头虱、体虱、蛲虫病和阴痒等。国内已有140家制药企业将其制成颗粒剂、片剂、膏剂、糖浆剂销往全国内服、外用，多个产品已成为国内外知名品牌，生产企业也成为当地的经济支柱之一。
百部是中国传统成方制剂的常用药材，每年还大量出口到港、澳、台、韩国、日本。有二十多个企业进行百部生物总碱的提取，制作洗发水、沐浴液等日用化工产品，制作杀虫、灭菌生物农药。市场调查显示，全国医药、农药、日化、出口等行业每年使用百部药材达3000吨，并呈逐年增加之势。
目前，对叶百部药材完全依靠采挖野生资源，而对叶百部在野生状态下结实性差，自然繁殖能力弱，生长缓慢，三年以上才能形成产量，需求明显大于产出，造成其药材经常缺货断档。业内人士研究用组织培养解决种苗繁育问题，但在生根环节一直没有取得突破。因此，提高植物组织培养过程中对叶百部的生根率，开展人工种植迫在眉睫。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明针对目前对叶百部人工栽培用苗紧缺的问题，建立对叶百部组培快速繁殖体系，尤其是解决对叶百部组培苗生根难、生根率低的问题，为对叶百部的快速繁殖提供技术保证，适合于规模化生产。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：
(a)、选择百部顶芽作为外植体，对所述外植体进行无菌处理；
(b)、将无菌处理后的外植体切取茎尖，得到的茎尖转入诱导培养基培养28-35d，得到无菌苗；
(c)、将所述无菌苗切割为1.0～1.5cm的带芽茎段，接种于增殖培养基，诱导丛生芽，培养时间为18-25d，得到无菌芽；
(d)、将所述无菌芽切成带芽茎段，接种于生根培养基，所述生根培养基为：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 1.5～2.5mg/L、IBA 0.5～3.0mg/L、氯化胆碱0～1.5g/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5～7.4g/L；
(e)、所述生根培养基中的带芽茎段长出新芽、新根，即得到生根苗，将所述生根苗于常温下遮阴处炼苗处理，然后移栽到草炭或黄心土基质中；
所述改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3改为800±10mg/L、KH2PO4改为340±10mg/L，无水CaCl2改为330±2mg/L，其余成分含量不变。
本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，以茎尖作为诱导材料，能减少种苗带病毒的几率；在增殖阶段诱导丛生芽，提高了增殖倍数；生根培养基中选择性添加NAA、IBA、氯化胆碱，提高对叶百部组培苗的生根率，生根率可达95％；生根苗经过炼苗后移栽到草炭或黄心土基质中移栽，提高成活率，成活率可达99％，并且整个过程提高对叶百部组培苗生根率稳定性好，有效解决了对叶百部组培苗难于生根和生根率低的难题，降低了生产成本，为实现规模化生产和种质资源的保护提供了条件。
本发明对MS培养基进行了改良，MS培养基以及改良MS培养基具体成分含量如表1所示。
表1 MS培养基以及改良MS培养基具体成分
为了进一步减少种苗带病毒的几率，优选地，在步骤(a)中，选择无病害、健壮的百部顶芽作为外植体，以易于后续培养。
优选地，在步骤(a)中，所述无菌处理为：
将所述外植体用无菌水冲洗后，放在超净工作台上，用70％-75％的酒精浸泡30～40s，再用0.1％～0.2％的升汞溶液处理6～14min，无菌水清洗4～6次。
经过该无菌处理后得到的外植体无菌，利于后续的培养。
优选地，在步骤(b)中，所述茎尖的长度为0.15-0.30mm。以该长度的茎尖进行培养，易于诱导丛生芽，诱导培养过程中，茎尖接种于诱导培养基表面。
为了提高诱导的效果，优选地，在步骤(b)中，所述诱导培养基的成分为：
改良MS培养基中含有NAA 0.2～0.5mg/L、BA 0～1.0mg/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5～7.4g/L。
更优选地，在步骤(b)中，所述诱导培养基的成分为：
改良MS培养基中含有NAA 0.4～0.5mg/L、BA 0.9～1.0mg/L、蔗糖30～32g/L、琼脂5～5.5g/L。
为了达到更好的增殖效果，优选地，在步骤(c)中，所述增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1.0～2.0mg/L、KT 0～1.0mg/L、NAA 0～1.2mg/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5.0～7.4g/L。
更优选地，在步骤(c)中，所述增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1.8～2.0mg/L、KT 0.8～1.0mg/L、NAA 0.2～0.3mg/L、蔗糖38～40g/L、琼脂5.5～6.0g/L。
生根培养基中选择性添加NAA、IBA、氯化胆碱，以提高对叶百部组培苗的生根率。优选地，在步骤(d)中，所述生根培养基为：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 2.3～2.5mg/L、IBA 1.0～1.2mg/L、氯化胆碱0.9～1.0g/L、蔗糖38～40g/L、琼脂5.0～5.5g/L。
为了进一步提高生根率，优选地，在步骤(d)中，所述生根培养基前期在100lx弱光下培养5～7d，再进行光照培养。
为了给组培苗的生长提供更适宜的生长条件，优选地，步骤(b)～(d)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为23℃～27℃，光照时间为10～14小时/天，光照强度为1400-2000lx。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，以茎尖作为诱导材料，能减少种苗带病毒的几率；在增殖阶段诱导丛生芽，提高了增殖倍数，增殖倍数在4.5倍以上。
(2)本发明提供的一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，生根培养基中添加NAA、IBA、氯化胆碱，生根培养前期在100lx弱光下培养，明显提高对叶百部组培苗的生根率，生根率为95％；生根苗经过炼苗后移栽到草炭基质中移栽成活率为99％，稳定性好。
(3)本发明有效解决了对叶百部组培苗难于生根和生根率低的难题，降低了生产成本，为实现规模化生产和种质资源的保护提供了条件。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用75％的酒精浸泡30s，再用0.1％的升汞溶液处理8min，无菌水清洗4次，备用。
(2)诱导培养：将处理好的外植体切取0.2mm茎尖，接种于诱导培养基表面，诱导培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAA0.5mg/L、BA1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，培养8d后开始萌芽，初始生长较慢，经过30d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率为95％。
(3)将步骤(2)中无菌苗剪切为长1.0cm的带芽茎段接种于增殖培养基，诱导丛生芽，增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 2.0mg/L、KT 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖40g/L、琼脂5.5g/L。培养周期20d，培养3d后开始长新芽，培养7d后开始长丛生芽。培养到20d时，80％的苗能诱导长丛生芽，增殖倍数为5倍。
(4)生根培养：将步骤(3)中的无菌丛生芽切成带芽茎段接种于生根培养基：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 2.5mg/L、IBA 1.0mg/L、氯化胆碱1.0g/L、蔗糖40g/L、琼脂5g/L。生根培养前期在100lx弱光下培养5d，再进行光照培养。培养周期为40d，培养7d后，可长出新芽。培养12d后基部膨大，形成根源基。培养40d后可形成发达的根系，生根率达95％。
(5)移栽：将步骤(4)中根系长到3cm的生根苗移出组培室，置于常温下遮阴处炼苗4d，打开培养瓶的盖子2d，然后将组培苗取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽植到草炭基质中。移植后盖上塑料薄膜保湿，并进行遮阴处理，移栽后保持试验基质保持湿润且不积水为宜。移栽3d后可萌发新的根须，移栽15d后开始长新芽，移栽50d后成活率达99％。
步骤(1)～(4)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为24℃～27℃，光照时间为10小时/d，光照强度为2000lx。
实施例2
一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用75％的酒精浸泡40s，再用0.2％的升汞溶液处理6min，无菌水清洗6次，备用。
(2)诱导培养：将处理好的外植体切取0.2mm带芽茎段，接种于诱导培养基表面，诱导培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAA 0.5mg/L、BA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，培养10d后开始萌芽，初始生长较慢，经过30d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率为92％。
(3)将步骤(2)中无菌苗切割为长1.5cm的带芽茎段接种于增殖培养基，诱导丛生芽，增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、NAA 0.3mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L。培养周期18d，培养5d后开始长新芽，培养10d后开始长丛生芽。培养到18d时，75％的苗能诱导长丛生芽，增殖倍数为4.7倍。
(4)生根培养：将步骤(3)中的无菌丛生芽切成带芽茎段接种于生根培养基：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 2.3mg/L、IBA 1.2mg/L、氯化胆碱0.9g/L、蔗糖38g/L、琼脂5.5g/L。生根培养前期在100lx弱光下培养5d，再进行光照培养。培养周期为40d，培养10d后，可长出新芽。培养15d后基部膨大，形成根源基。培养40d后可形成发达的根系，生根率达94％。
(5)移栽：将步骤(4)中根系长到4cm的生根苗移出组培室，置于常温下遮阴处炼苗5d，打开培养瓶的盖子3d，然后将组培苗取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽植到黄心土基质中。移植后盖上塑料薄膜保湿，并进行遮阴处理，移栽后保持试验基质保持湿润且不积水为宜。移栽6d后可萌发新的根须，移栽20d后开始长新芽，移栽50d后成活率达95％。
步骤(1)～(4)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为23℃～26℃，光照时间为12小时/d，光照强度为1600lx。
实施例3
一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用70％的酒精浸泡35s，再用0.1％的升汞溶液处理14min，无菌水清洗5次，备用。
(2)诱导培养：将处理好的外植体切取0.30mm茎尖，接种于诱导培养基表面，诱导培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAA0.4mg/L、BA 0.9mg/L、蔗糖32g/L、琼脂5.5g/L，培养8d后开始萌芽，初始生长较慢，经过28d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率为93％。
(3)将步骤(2)中无菌苗切割为长1.0cm的带芽茎段接种于增殖培养基，诱导丛生芽，增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1.8mg/L、KT 0.8mg/L、NAA 0.3mg/L、蔗糖38g/L、琼脂6.0g/L。培养周期23d，培养3d后开始长新芽，培养7d后开始长丛生芽。培养到23d时，78％的苗能诱导长丛生芽，增殖倍数为4.7倍。
(4)生根培养：将步骤(3)中的无菌丛生芽切成带芽茎段接种于生根培养基：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 1.5mg/L、IBA 0.5mg/L、氯化胆碱1.5g/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L。生根培养前期在100lx弱光下培养6d，再进行光照培养。培养周期为40d，培养7d后，可长出新芽。培养12d后基部膨大，形成根源基。培养40d后可形成发达的根系，生根率达95％。
(5)移栽：将步骤(4)中根系长到5cm的生根苗移出组培室，置于常温下遮阴处炼苗4d，打开培养瓶的盖子2d，然后将组培苗取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽植到草炭基质中。移植后盖上塑料薄膜保湿，并进行遮阴处理，移栽后保持试验基质保持湿润且不积水为宜。移栽3d后可萌发新的根须，移栽15d后开始长新芽，移栽50d后成活率达97％。
步骤(1)～(4)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为25℃～27℃，光照时间为14小时/d，光照强度为1400lx。
实施例4
一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和无菌预处理：选择无病害、健壮的百部顶芽为外植体，用无菌水冲洗，将材料放在超净工作台上，用74％的酒精浸泡35s，再用0.1％的升汞溶液处理10min，无菌水清洗5次，备用。
(2)诱导培养：将处理好的外植体切取0.15mm茎尖，接种于诱导培养基表面，诱导培养基的成分为：改良MS培养基中含有NAA0.2mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7.4g/L，培养8d后开始萌芽，初始生长较慢，经过35d的诱导培养获得健壮的无菌苗，诱导率为90％。
(3)将步骤(2)中无菌苗切割为长1.0cm的带芽茎段接种于增殖培养基，诱导丛生芽，增殖培养基成分为：改良MS培养基中含有6-BA 1.0mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7.4g/L。培养周期25d，培养3d后开始长新芽，培养7d后开始长丛生芽。培养到25d时，76％的苗能诱导长丛生芽，增殖倍数为4.0倍。
(4)生根培养：将步骤(3)中的无菌丛生芽切成带芽茎段接种于生根培养基：1/2浓度的改良MS培养基中含有NAA 2.5mg/L、IBA 3mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7.4g/L。生根培养前期在100lx弱光下培养7d，再进行光照培养。培养周期为40d，培养7d后，可长出新芽。培养12d后基部膨大，形成根源基。培养40d后可形成发达的根系，生根率达90％。
(5)移栽：将步骤(4)中根系长到4cm的生根苗移出组培室，置于常温下遮阴处炼苗4d，打开培养瓶的盖子2d，然后将组培苗取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽植到草炭基质中。移植后盖上塑料薄膜保湿，并进行遮阴处理，移栽后保持试验基质保持湿润且不积水为宜。移栽3d后可萌发新的根须，移栽15d后开始长新芽，移栽50d后成活率达95％。
步骤(1)～(4)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为25℃～27℃，光照时间为12小时/d，光照强度为1800lx。
另外，本发明实施例中的改良MS培养基的成分及其含量如表1所示，1/2浓度的改良MS培养基为改良MS培养基稀释一倍即可。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (7)

1.一种提高对叶百部组培苗生根率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、选择对叶百部顶芽作为外植体，对所述外植体进行无菌处理；
(b)、将无菌处理后的外植体切取茎尖，得到的茎尖转入诱导培养基培养28－35d，得到无菌苗；
(c)、将所述无菌苗切割为1.0～1.5cm的带芽茎段，接种于增殖培养基，诱导丛生芽，培养时间为18－25d，得到无菌芽；
(d)、将所述无菌芽切成带芽茎段，接种于生根培养基，所述生根培养基为：1/2浓度的改良MS培养基中添加NAA 1.5～2.5mg/L、IBA 0.5～3.0mg/L、氯化胆碱0～1.5g/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5～7.4g/L；
(e)、所述生根培养基中带芽茎段长出新芽、新根即得到生根苗，将所述生根苗于常温下遮阴处炼苗处理，然后移栽到草炭或黄心土基质中；
在步骤(b)中，所述诱导培养基的成分为：改良MS培养基中添加NAA 0.2～0.5mg/L、BA0～1.0mg/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5～7.4g/L；
在步骤(c)中，所述增殖培养基成分为：改良MS培养基中添加6－BA 1.0～2.0mg/L、KT0～1.0mg/L、NAA 0～1.2mg/L、蔗糖30～40g/L、琼脂5.0～7.4g/L；
在步骤(d)中，所述生根培养基前期在100lx弱光下培养5～7d，再进行光照培养；
步骤(b)～(d)中的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度为23℃～27℃，光照时间为10～14小时/天，光照强度为1400－2000lx；
所述改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3改为800±10mg/L、KH2PO4改为340±10mg/L，无水CaCl2改为330±2mg/L，其余成分含量不变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，选择无病害、健壮的对叶百部顶芽作为外植体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述无菌处理为：
将所述外植体用无菌水冲洗后，放在超净工作台上，用70％－75％的酒精浸泡30～40s，再用0.1％～0.2％的升汞溶液处理6～14min，无菌水清洗4～6次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述茎尖的长度为0.15－0.30mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述诱导培养基的成分为：
改良MS培养基中添加NAA 0.4～0.5mg/L、BA 0.9～1.0mg/L、蔗糖30～32g/L、琼脂5～5.5g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述增殖培养基成分为：改良MS培养基中添加6－BA 1.8～2.0mg/L、KT 0.8～1.0mg/L、NAA 0.2～0.3mg/L、蔗糖38～40g/L、琼脂5.5～6.0g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述生根培养基为：1/2浓度的改良MS培养基中添加NAA 2.3～2.5mg/L、IBA 1.0～1.2mg/L、氯化胆碱0.9～1.0g/L、蔗糖38～40g/L、琼脂5.0～5.5g/L。
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