CN115474546B - 一种海伦兜兰素花的繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海伦兜兰素花的繁育方法，属于植物繁育技术领域，是以海伦兜兰素花为材料，有针对性的进行人工授粉获得种子，再以特定成熟度种子作为外植体，通过无菌播种萌发、继代增殖、壮苗与生根培养进行种苗繁殖。本发明获得了高的授粉结实率，提高了种子的萌发和生长速率，克服了芽苗褐化死亡的问题，并繁殖出大量优质的海伦兜兰素花种苗。本发明的方法可实现海伦兜兰素花的大规模繁殖，繁殖的种苗可直接供应高品质花卉市场，还可作为育种亲本以及花色性状研究材料应用到科研中去，对促进我国兜兰花卉产业的发展具有积极的推动作用。

Description

一种海伦兜兰素花的繁育方法

技术领域

本发明涉及植物繁育技术领域，尤其涉及一种海伦兜兰素花的繁育方法。

背景技术

兰科花卉产业目前正处在飞速发展的时期，人们对于开发新品种有着强烈的需求，而花色作为兰科花卉的重要性状，其改变可能意味着此品种的经济价值得到巨大提升。在众多的花色中，素花作为兰科花卉特有的花色变异类型，既符合传统兰花审美意向，又符合现代多元化审美取向，尤其在我国，自古以来就形成了“以素为美，以素为贵”的兰花文化。

兜兰属植物又称“拖鞋兰”、“仙履兰”，是兰科植物中最具特色和最具观赏价值的类群之一。兜兰花朵具有丰富的着色模式，中萼片、花瓣和唇瓣都可着色，而且色彩复杂多样。兜兰素花通常是指没有红色色素的花朵，即兜兰素花可以是绿色、黄色、白色的，或是这三种色素的任何组合。由于兜兰素花类型非常稀有，甚至有时一个种里仅发现一颗，加之独特的性状和极高的观赏价值，因而也最有价值。

海伦兜兰素花(Paphiopedilum helenae Aver f.aureum Gruss&Roeth)为海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)的一个花色变型，正式发表于1999年并得到认可，该变型花朵在开放初期为绿色，之后逐渐转变为淡黄色，整体黄绿色素雅而又精致(图1)，花型和色泽在国产兜兰属中是独一无二的，观赏价值更高。

目前市场上兜兰素花类型花卉十分稀缺，一株植株售价可达数千元至数万元，经常是一苗难求。海伦兜兰素花是兜兰中的稀缺精品，其种苗可以直接提供园艺高端花卉市场，也可以作为育种亲本以及花色性状研究材料应用到科研中去，具有重要的经济价值和科研价值。可见，繁育扩大海伦兜兰素花种苗数量应用前景广阔。

目前，人工无菌播种是兜兰属植物最有效的繁育手段，解决了包括海伦兜兰在内的数十种兜兰属植物的繁育问题，并为科研和园艺生产提供了大量的材料。但兜兰素花的繁殖速度更慢，繁殖难度更大，无菌播种萌发及成苗的方法并不相同，目前海伦兜兰素花的繁育研究尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海伦兜兰素花的繁育方法，本发明提供的繁育方法授粉结实率高、种子萌发率高、出苗快、种苗品质好，有利于海伦兜兰素花的规模化繁殖利用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种海伦兜兰素花的繁育方法，包括以下步骤：

1)在海伦兜兰素花的花朵开放的第5～10d，在上午8～10点进行人工异花授粉；

2)采收成熟度为150～240DAP的蒴果，将获取得到的种子接种到萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发、分化得到芽苗；

所述萌发培养基为含香蕉30～50g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/8MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；

所述萌发光环境包括：先在黑暗条件下培养10～30d，然后进行光照培养，光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d；

3)将所述步骤2)得到的芽苗转接到继代增殖培养基上，继代增殖培养得到丛生芽苗；

所述继代增殖培养基为含椰汁80～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～4.0mg/L、萘乙酸0.1～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述继代增殖培养基的pH值为5.8～6.2；

4)将所述步骤3)得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，培养获得完整植株；

所述壮苗与生根培养基为含香蕉50～100mL/L、硝酸银0.5～1.0mg/L、萘乙酸0.2～1.0mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述壮苗与生根培养基的pH值为5.8～6.2；

5)将所述步骤4)得到的完整植株进行炼苗，移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

优选的，所述步骤1)对蒴果进行表面消毒、切开种皮后，获取种子。

优选的，所述表面消毒包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗5～6次。

优选的，所述步骤1)中人工异花授粉是以不同开花单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上。

优选的，所述步骤1)中人工异花授粉后，进行套袋和挂牌标记，2～4d内不浇水，之后按照正常水肥需求进行管理管护。

优选的，所述步骤2)中的种子萌发、步骤3)中的继代增殖培养和步骤4)中的壮苗与生根培养的温度均为25～27℃，环境湿度为60～70％。

优选的，所述步骤5)中的炼苗在自然光下进行，炼苗的时间为10～20d。

优选的，所述步骤5)中的移栽所需的基质包括水苔。

本发明是以海伦兜兰素花开花株为亲本，进行人工授粉获得蒴果；然后采收蒴果进行表明消毒，将种子接种于萌发培养基上，萌发培养得到芽苗；将所述芽苗接种于特定的继代增殖培养基上，培养得到丛生芽苗；将所述丛生芽苗接种于特定的壮苗与生根培养基上，培养得到植株；将所述植株进行炼苗，再经移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

本发明以海伦兜兰素花开花株为亲本，有针对性地进行人工授粉和采收特定成熟度的蒴果，提高了授粉结实率和增加了蒴果饱满度，获得高质量种子。然后通过在特定的培养基上和光环境条件下进行播种、继代增殖和壮苗与生根培养，提高了种子的萌发和生长速率，并且种子萌发率高、出苗快、种苗品质好，在短时间内生产出大量优质的海伦兜兰素花种苗。

实施例的实验结果表明，本发明提供的方法对海伦兜兰素花人工授粉结实率达到100％，种子萌发率可达34.5％，经120d即可分化为高1.0cm具1～2张叶片左右的芽苗，以“芽繁芽”的方式增殖培养能形成丛生芽，培养90d的增殖系数达到3.6，再经90d壮苗与生根培养可生长为具有3～4张叶片根系发达的完整植株，且移栽成活率可达90％以上。

附图说明

图1为本发明中海伦兜兰素花亲本开花株的照片；

图2为本发明实施例1中海伦兜兰素花蒴果照片；

图3为本发明实施例1中海伦兜兰素花种子萌发照片；

图4为本发明实施例1中海伦兜兰素花继代增殖照片；

图5为本发明实施例1中海伦兜兰素花壮苗与生根照片。

具体实施方式

本发明提供了一种海伦兜兰素花的繁育方法，包括以下步骤：

1)在海伦兜兰素花花朵开放的第5～10d，在上午8～10点进行人工异花授粉；

2)采收成熟度为150～240DAP的蒴果，将获取得到的种子接种到萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发、分化得到芽苗；

所述萌发培养基为含香蕉30～50g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/8MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；

所述萌发光环境为：先在黑暗条件下培养10～30d，然后进行光照培养，光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d；

3)将所述步骤2)得到的芽苗转接到继代增殖培养基上，培养得到丛生芽苗。

所述的继代增殖培养基为含椰汁80～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～4.0mg/L、萘乙酸0.1～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述继代增殖培养基的pH值为5.8～6.2；

4)将所述步骤3)得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，培养获得完整植株；

所述的壮苗与生根培养基为含香蕉50～100mL/L、硝酸银0.5～1.0mg/L、萘乙酸0.2～1.0mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述壮苗与生根培养基的pH值为5.8～6.2；

5)将所述步骤4)得到的植株进行炼苗，移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

本发明在海伦兜兰素花花朵开放的第5～10d，在上午8～10点进行人工异花授粉，获得蒴果。

在本发明中，所述授粉时间优选为在花朵完全开放的第5～10d，具体为上午8～10点，更优选为在花朵完全开放的第5～7d，具体为上午8～9点。

在本发明中，所述人工授粉优选为以不同单株为父母亲本的异花授粉，所述异花授粉具体为，先用剪刀先把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上。

在本发明中，授粉后还需要进行蒴果管护，优选为授粉后2～4d内停止浇水，之后按照正常水肥管理，更优选为授粉后3d内停止浇水，之后按照正常水肥管理。

本发明采用人工异花授粉的结实率高达100％，提高了蒴果饱满度和种子质量，进一步提高海伦兜兰素花种子培养的萌发率。

本发明采收成熟度为150～240DAP的蒴果进行表面消毒处理，然后切开种皮，将种子接种到萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发、分化得到芽苗。在本发明中，所述成熟度是指从授粉后到采收所生长的天数(days after pollinatiaon，DAP)。在本发明中，所述的蒴果成熟度为150～240DAP，优选为150～210DAP，更优选为180～210DAP。

在本发明中，所述消毒处理优选包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗5～6次；更优选包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次。在本发明中，所述消毒处理能够杀灭蒴果表面的细菌、真菌等微生物，促进后期种子的无菌萌发。

在本发明中，所述萌发培养基为含香蕉30～50g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/8MS培养基，优选为含香蕉30～40g/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L和琼脂3.5～4.5g/L的1/2～1/4MS培养基，更优选为含香蕉30g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L和琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.8～6.0，更优选为5.8。

在本发明中，所述1/2～1/8MS培养基是指将MS培养基中大量元素和微量元素用量为原来的1/2～1/8，其余成分不变；所述MS培养基为液体培养基，不含有琼脂；MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1991:371-374.)。

本发明以1/2～1/8MS培养基为基本培养基，通过添加一定量的香蕉和活性炭，适宜海伦兜兰素花种子的无菌播种萌发，并能提高种子萌发效率，也能减轻离体芽苗褐化的发生，促进萌发原球茎的分化及芽苗的生长。

在本发明中，所述萌发光环境为：先进行黑暗条件培养，然后进行间歇光照培养。

在本发明中，所述黑暗条件培养优选为用遮光布遮盖，在黑暗条件下培养。在本发明中，所述黑暗条件培养的时间为10～30d，优选为10～20d。

在本发明中，所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照强度为1500～3000lx，优选为1600～2500lx。在本发明中，所述间歇光照培养的光照时间为10～16h/d，优选为12～14h/d，所述萌发光环境下培养的温度优选为25～27℃，环境湿度优选为60～70％。

在本发明中，所述萌发光环境下培养能够提高海伦兜兰素花种子的萌发速度，提高萌发率。

本发明将得到的芽苗转接到继代增殖培养基上，培养得到丛生芽苗。

所述的继代增殖培养基为含椰汁80～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～4.0mg/L、萘乙酸0.1～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述继代增殖培养基的pH值为5.8～6.2；

在本发明中，所述的继代增殖培养基为含椰汁80～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～4.0mg/L、萘乙酸0.1～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；优选为含椰汁100～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.1～0.2mg/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L和琼脂3.5～4.5g/L的1～1/4MS培养基，更优选为含椰汁100mL/L、6-苄基腺嘌呤3.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L和琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述继代增殖培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.8～6.0，更优选为5.8。在本发明中，所述椰汁为新鲜椰子内部的汁液。在本发明中，所述继代增殖培养基上培养90d能获得丛生芽，增殖系数达到3.6。

本发明将得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，培养获得完整植株。

在本发明中，所述壮苗与生根培养基为含硝酸银0.5～1.0mg/L、萘乙酸0.2～1.0mg/L、香蕉50～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L、琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基，优选为含硝酸银0.5～0.8mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L、琼脂3.5～4.5g/L的1/2MS培养基，更优选为含硝酸银0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、香蕉100g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L、琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述1/2MS培养基优选与上述技术方案所述1/2MS培养基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述壮苗与生根培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.8～6.0。在本发明中，所述壮苗与生根培养基通过添加相应浓度的硝酸银、萘乙酸和香蕉，促进了海伦兜兰素花类型的壮苗和生根，叶片数为3～4张，根条数为2～4条。

本发明将得到的植株进行炼苗，再经移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

得到植株后，本发明将所述植株进行炼苗，再经移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

在本发明中，所述炼苗优选在自然光下进行；所述炼苗的时间优选为10～20d，更优选为10～15d。

本发明对所述移栽的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的移栽植株的技术方案即可。在本发明中，所述移栽后的栽培基质优选为水苔。

下面结合实施例对本发明提供的一种海伦兜兰素花的繁育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)人工授粉及蒴果的管护

在位于广西桂林地区的兰科植物迁地保存种质圃内，海伦兜兰素花的花期为9月上旬至11月下旬(图1)。在开花期选择上午8点进行人工授粉，授粉方式为异花授粉，即授不同朵花的花粉，授粉时先用剪刀把花朵唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将花粉囊涂抹在柱头面上，并套袋和挂牌标记。异花授粉结果表明，在花朵开放5d时异花授粉全部成功，结实率达到100％，得到健康饱满蒴果(图2)，可作为下一步无菌播种萌发繁殖的材料。

(2)蒴果的采收、消毒、播种和萌发培养

采收成熟度180DAP的蒴果，先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果纵向切开，将内部种子接种到萌发培养基表面，萌发培养基配方为：1/4MS+香蕉30g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为5.8。在萌发光环境下诱导种子萌发，萌发光环境为：先用遮光布遮盖，在黑暗条件下培养20d，然后转到日光灯下培养，光照度1500lx，光照时间10h/d，培养温度为25℃～27℃。10d后统计消毒成功率为100％。播种结果表明，180DAP时，蒴果内部种胚已由白色团块状转变为粉状种子，播种萌发效果佳，播种45d时可见到萌发迹象(图3)，120d时的萌发率为34.5％，继续培养生长成带1～2张叶片的芽苗，可作为下一步继代增殖的材料。

(3)芽苗增殖培养

将芽苗转接到不同继代增殖培养基上，以“芽繁芽”方式进行培养，继代增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，添加椰汁100mL/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L和琼脂3.5g/L，以及不同植物生长调节剂6-苄基腺嘌呤(6-BA：2.0、3.0、4.0mg/L)和萘乙酸(NAA：0.2、0.5mg/L)组合。采用标准兰花培养瓶(容量为650mL)，每个处理组接种5瓶，每瓶接种6株，培养90d后统计诱导的芽苗数，并计算增殖系数。

由表1可知，当植物生长调节剂组合为6-苄基腺嘌呤3.0mg/L、萘乙酸0.2mg/L时，海伦兜兰素花增殖培养能形成丛生芽，诱导增殖的芽苗数最多，增殖系数最高达到3.6。

表1不同植物生长调节剂浓度对增殖的影响

注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。表中数据为平均值±标准差；同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

(4)壮苗生根培养

将得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上进行培养，壮苗与生根培养基配方为：1/2MS+香蕉50g/L+硝酸银0.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为5.8。结果表明，该培养基配方够促进叶片长度和平均根长，培养90d后平均叶片数为3.5张，平均根数为3.1条，根长为1.6cm，植株生长健壮，可进行炼苗和出瓶移栽(图5)。

(5)炼苗移栽

将具有发达根系的健壮瓶苗从培养室转移到温室大棚内炼苗15d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用稀释1 000倍的甲基托普津浸泡2～3min，取出在阴凉处放置12h后进行移栽，移栽基质为水苔，清水浸泡充分后，取出拧干，包裹植株根系栽植到直径5.0cm育苗杯中，注意保持湿度和温度，移栽90d后，植株能产生新的根系，移栽成活率达91.5％。

实施例2

(1)人工授粉及蒴果的管护

在开花期选择上午9点进行人工授粉，授粉方式为异花授粉，即授不同朵花的花粉，授粉时先用剪刀把花朵唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将花粉囊涂抹在柱头面上，并套袋和挂牌标记。异花授粉结果表明，在花朵开放7d时的授粉结实率为100％。

(2)蒴果消毒、播种和萌发培养

采收成熟度150DAP的蒴果，先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果纵向切开，将蒴果内的种胚接种到萌发培养基表面，萌发培养基配方为：1/2MS+香蕉40g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为5.8。在萌发光环境下诱导种子萌发，萌发光环境为：先用遮光布遮盖，在黑暗条件下培养10d，然后转到日光灯下培养，光照度2500lx，光照时间12h/d，培养温度为25℃～27℃。10d后统计消毒成功率为100％。播种结果表明，150DAP蒴果内部种胚为白色团块状，黏性较强，接种时用无菌刀片分散开，播种后也能部分萌发，120d时的萌发率为27.5％。

(3)芽苗增殖培养

该步骤同实施例1。

(4)壮苗生根培养

将得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，壮苗与生根培养基配方为：1/2MS+香蕉80g/L+硝酸银0.8mg/L+萘乙酸0.8mg/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为5.8。结果表明，该培养基配方够促进叶片长度和平均根长，培养90d后平均叶片数为3.3张，平均根数为2.9条，根长为1.8cm，植株生长健壮，可进行炼苗和出瓶移栽。

(5)炼苗移栽

该步骤同实施例1。

实施例3

(1)人工授粉及蒴果的管护

在开花期选择上午10点进行人工授粉，授粉方式为异花授粉，即授不同朵花的花粉，授粉时先用剪刀把花朵唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将花粉囊涂抹在柱头面上，并套袋和挂牌标记。异花授粉结果表明，在花朵开放的第10d时进行授粉也能成功，结实率为100％。

(2)蒴果消毒、播种和萌发培养

采收成熟度240DAP的蒴果，先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果横向切开，将蒴果内的种胚接种到萌发培养基上，萌发培养基配方为：1/2MS+香蕉50g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为6.2。在萌发光环境下诱导种子萌发，萌发光环境为：先用遮光布遮盖，在黑暗条件下培养30d，然后转到日光灯下培养，光照度3000lx，光照时间16h/d，培养温度为25℃～27℃。10d后统计消毒成功率为100％。播种结果表明，240DAP蒴果外表和内部种子颜色均逐渐加深至黄褐色，播种萌发率为21.4％。

(3)芽苗增殖培养

该步骤同实施例1。

(4)壮苗生根培养

将得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，壮苗与生根培养基配方为：1/2MS+香蕉100g/L+硝酸银1.0mg/L+萘乙酸1.0mg/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为6.2。结果表明，该培养基配方够促进叶片长度和平均根长，培养90d后平均叶片数为3.4张，平均根数为2.8条，根长为1.7cm，植株生长健壮，可进行炼苗和出瓶移栽。

(5)炼苗移栽

该步骤同实施例1。

对比例1

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(1)中，分别在花朵开放1～2d(初花期)、5～10d(盛花期)和30d以上(衰败期，即花朵部分开始萎蔫至完全枯萎凋谢)进行人工授粉，授粉方式为自花授粉，即授同朵花的花粉。结果见下表2，在花朵刚开放的不同阶段自花授粉均未能成功，结实率为0。

表2自花授粉结实情况

对比例2

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(1)中，在花朵开放30d以上(衰败期，即花朵部分开始萎蔫至完全枯萎凋谢)，选择上午8～9点进行人工授粉，授粉方式为异花授粉，即授不同朵花的花粉。结果表明，在花朵衰败期授粉后，花朵很快萎蔫，不能结实，结实率为0。

对比例3

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(1)中，在人工授粉后的2d内，对花朵进行浇水，花朵很快萎蔫，不能结实，结实率为0，表明海伦兜兰素花类型花粉管伸长需要的一定的时间，所以在人工授粉后2d内不要浇水，否则将影响授粉成功率。

对比例4

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(2)中，萌发培养基配方为：1/2MS+椰汁100mL/L+活性炭1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L上，pH值为5.8～6.2。播种结果表明，播种60d时可见到萌发迹象，120d时的萌发率为27.5％，继续培养生长成带1～2张叶片的芽苗，但芽苗较细弱。

对比例5

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(3)中，将继代增殖培养基配方中的椰汁换成不同浓度的香蕉。结果表明，添加不同浓度的香蕉对继代增殖和生长影响较大，并随着香蕉浓度的升高，对芽苗的生长抑制作用加强。当添加30g/L香蕉，能获得少量丛生芽，增殖系数为2.1，少部分芽苗褐化死亡；当添加100g/L香蕉时，增殖系数小于1，芽苗褐化死亡率达到60％。

表3添加物不同浓度香蕉对芽苗继代增殖的影响

对比例6

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(4)中，将壮苗生根培养基配方中的香蕉换成椰汁。结果表明，相较于添加香蕉培养基，叶片数和根条数无显著差异，但添加椰汁培养基的根系较细弱，不利于下一步的出瓶移栽。

对比例7

本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，移栽基质为植金石(日本进口，颗粒大小为3～6mm)与奥科特脱脂松树皮(新西兰进口，颗粒大小为6～9mm)，清水浸泡充分后，按1：2～4混合，移栽后注意保持湿度和温度。由表4可知，移栽90d后，植株能产生新的根系，移栽成活率为63.5～75.5％，低于以水苔为基质的91.5％。

表4不同基质对植株移栽的影响

基质	成活率(％)	是否产生新的根系
			新西兰进口水苔	91.5	是
植金石：松树皮＝1：2	75.5	是
			植金石：松树皮＝1：3	67.7	是
植金石：松树皮＝1：4	63.5	是

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种海伦兜兰素花的繁育方法，其特征在于，步骤为：

1)在海伦兜兰素花的花朵开放的第5d，在上午8～10点进行人工异花授粉；

2)采收成熟度为150DAP的蒴果，将获取得到的种子接种到萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发、分化得到芽苗；

所述萌发培养基为添加香蕉30～50g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/8MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；

所述萌发光环境为：先在黑暗条件下培养10～30d，然后进行光照培养，光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d；

3)将所述步骤2)得到的芽苗转接到继代增殖培养基上，继代增殖培养得到丛生芽苗；

所述继代增殖培养基为添加椰汁80～120mL/L、6-苄基腺嘌呤2.0～4.0mg/L、萘乙酸0.1～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述继代增殖培养基的pH值为5.8～6.2；

4)将所述步骤3)得到的丛生芽苗分成单苗接种到壮苗与生根培养基上，培养获得完整植株；

所述壮苗与生根培养基为添加香蕉50～100mL/L、硝酸银0.5～1.0mg/L、萘乙酸0.2～1.0mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2～1/4MS培养基；所述壮苗与生根培养基的pH值为5.8～6.2；

5)将所述步骤4)得到的完整植株进行炼苗，移栽后得到海伦兜兰素花种苗。

2.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤2)对蒴果进行表面消毒、切开种皮后，获取种子。

3.根据权利要求2所述的繁育方法，其特征在于，所述表面消毒包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗5～6次。

4.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤1)中人工异花授粉是以不同开花单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上。

5.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤1)中人工异花授粉后，进行套袋和挂牌标记，2～4d内不浇水，之后按照正常水肥需求进行管理管护。

6.根据权利要求1所述的繁育方法，其特征在于，步骤2)中的种子萌发、步骤3)中的继代增殖培养和步骤4)中的壮苗与生根培养的温度均为25～27℃，环境湿度为60～70％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中的炼苗在自然光下进行，炼苗的时间为10～20d。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中的移栽所需的基质包括水苔。