CN112931202A - 一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，属于植物组培技术领域。本发明以德氏兜兰种子作为外植体，通过在特定的培养基上和光环境条件下进行播种、分化和壮苗与生根培养，提高了种子的萌发和生长速率，并且种子萌发率高、出苗快、种苗品质好，在短时间内生产出大量优质的德氏兜兰种苗。实施例的实验结果表明，本发明提供的方法对德氏兜兰种子进行培养60d，萌发率可达47.7％，经40d即可分化为高1.0cm左右的小苗，再经60d可生长为株高3～4cm根系发达的完整植株，且移栽成活率可达100％。

Description

一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法。
背景技术
德氏兜兰(Paphiopedilum delenatii Guill.)为兰科(Orchidaceae)兜兰属多年生植物，分布于我国广西北部、云南东南部和越南北部，分布地域十分狭窄。由于其生境的破坏和人为的过度采挖，其野生植物数量已极为稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，也被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护。
另一方面，德氏兜兰还是最奇特的观赏兰花之一，因花朵硕大、花型奇特、花色艳丽和持久的花期，具有极高的观赏价值，被奉为兰花精品，在全世界拥有为数众多的爱好者。德氏兜兰花朵具有香味，更是未来花香型兜兰育种的潜在种质。可见，德氏兜兰野生资源还是开发高档花卉和培育花卉新品种难得的好材料，具有十分重要的经济价值。
进行德氏兜兰的资源保护和开发利用，繁殖足够多的种苗是关键。德氏兜兰的繁殖可采取无性繁殖和有性繁殖两大类，无性繁殖可采用常规分株和无性组织培养。其中，德氏兜兰的分株繁殖即在自然状态下萌出侧芽长成新苗，但繁殖速度慢，繁殖率低；德氏兜兰的无性组织培养与其他兜兰属植物一样，通常是以芽、叶片和根系为外植体进行繁殖，但由于外植体去污难、易褐化及增殖速度慢等原因，其无性组织培养难度极大；而有性繁殖中，由于德氏兜兰在野外的结实率低，即使结实种子萌发率也极低。
因此，亟需提供一种萌发率高、出苗快、种苗品质好的德氏兜兰种子非共生萌发的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法。本发明提供的方法种子萌发率高、出苗快、种苗品质好，有利于德氏兜兰的资源保护和可持续利用。
本发明提供了一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，包括以下步骤：
(1)将德氏兜兰种子接种于萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发，得到原球茎；
所述萌发培养基为含香蕉80～100g/L、6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；
所述萌发光环境为：先进行遮光培养20～30d，然后进行间歇光照培养；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(2)将所述步骤(1)得到的原球茎接种于分化培养基上，在分化光环境下培养，得到小苗；
所述分化培养基为含硝酸银0.2～0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述分化培养基的pH值为5.8～6.2；
所述分化光环境为：光质为波长475±5nm的蓝光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(3)将所述步骤(2)得到的小苗接种于壮苗与生根培养基上，在壮苗与生根光环境下培养获得完整植株；
所述壮苗与生根培养基为含硝酸银0.5～1.0mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L、琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述壮苗培养基的pH值为5.8～6.2；
所述壮苗与生根光环境为：光质为波长660±5nm的红光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(4)将所述步骤(3)得到的植株进行炼苗，再经移栽后得到德氏兜兰种苗。
优选的，所述步骤(1)中德氏兜兰种子由蒴果经消毒处理后切开得到；所述蒴果在消毒处理前进行低温沉积。
优选的，所述低温沉积的温度为0～10℃，所述低温沉积的时间为20～30d。
优选的，所述蒴果为德氏兜兰花朵开放的第10～15d时进行异株人工授粉获得。
优选的，所述异株人工授粉为：选取花朵完全开放的不同单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后将父本的花粉囊涂抹在母本的柱头面上。
优选的，所述消毒处理包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗4～5次。
优选的，所述步骤(1)中的萌发培养、步骤(2)中的分化培养和步骤(3)中的生根培养的温度独立地为25～27℃。
优选的，所述步骤(4)中的炼苗在自然光下进行，炼苗的时间为10～15d。
优选的，所述步骤(4)中的移栽后的栽培基质包括植金石、松树皮和泥炭土。
优选的，所述植金石、松树皮和泥炭土的体积比为1:(4～5)：1。
本发明提供了一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，将德氏兜兰种子接种于特定的萌发培养基上在一定光环境下进行萌发培养，得到原球茎；将所述原球茎接种于特定的分化培养基上在一定光环境下进行分化，得到小苗；将所述小苗接种于特定的壮苗与生根培养基上，在一定光环境下培养，得到植株；将所述植株进行炼苗，再经移栽后得到德氏兜兰种苗。本发明以德氏兜兰种子作为外植体，通过在特定的培养基上和光环境条件下进行播种、分化和壮苗与生根培养，提高了种子的萌发和生长速率，并且种子萌发率高、出苗快、种苗品质好，在短时间内生产出大量优质的德氏兜兰种苗。实施例的实验结果表明，本发明提供的方法对德氏兜兰种子进行培养60d萌发率可达47.7％，经40d即可分化为高1.0cm左右的小苗，再经60d可生长为株高3～4cm根系发达的完整植株，且移栽成活率可达100％。
附图说明
图1为本发明对比例1中德氏兜兰的萌发培养情况照片；
图2为本发明实施例1中德氏兜兰的分化培养情况照片；
图3为本发明实施例2中德氏兜兰的生根培养情况照片。
具体实施方式
本发明提供了一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，包括以下步骤：
(1)将德氏兜兰种子接种于萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发，得到原球茎；
所述萌发培养基为含香蕉80～100g/L、6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；
所述萌发光环境为：先进行遮光培养20～30d，然后进行间歇光照培养；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(2)将所述步骤(1)得到的原球茎接种于分化培养基上，在分化光环境下培养，得到小苗；
所述分化培养基为含硝酸银0.2～0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述分化培养基的pH值为5.8～6.2；
所述分化光环境为：光质为波长475±5nm的蓝光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(3)将所述步骤(2)得到的小苗接种于壮苗与生根培养基上，在壮苗与生根光环境下培养获得完整植株；
所述壮苗与生根培养基为含硝酸银0.5～1.0mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L、琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述壮苗培养基的pH值为5.8～6.2；
所述壮苗与生根光环境为：光质为波长660±5nm的红光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(4)将所述步骤(3)得到的植株进行炼苗，再经移栽后得到德氏兜兰种苗。
本发明将德氏兜兰种子接种于萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发，得到原球茎。
在本发明中，所述德氏兜兰种子优选由蒴果经消毒处理后切开得到。
在本发明中，所述蒴果优选为德氏兜兰花朵开放的第10～15d时进行异株人工授粉获得。本发明以德氏兜兰开花植株为亲本，采用人工授粉获得蒴果，提高了蒴果饱满度和种子质量，进一步提高德氏兜兰种子培养的成活率。
在本发明中，所述异株人工授粉优选为：选取花朵完全开放的不同单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后将父本的花粉囊涂抹在母本的柱头面上。
在本发明中，所述消毒处理优选包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗4～5次；更优选包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次。在本发明中，所述消毒处理能够杀灭蒴果表面的细菌、真菌等微生物，促进后期种子的无菌萌发。
在本发明中，所述蒴果在消毒处理前优选进行低温沉积。
在本发明中，所述低温沉积的温度优选为0～10℃，更优选为4℃；所述低温沉积的时间优选为20～30d，更优选为25～30d。在本发明中，所述低温沉积优选为将蒴果用干净纸巾包裹后存入干燥器一并放入冰箱进行干燥储藏。在本发明中，所述德氏兜兰种子容易休眠，而且蒴果在潮湿环境中容易发霉腐烂，难以储存，采用干燥加低温沉积法可破除种子休眠，并且保证蒴果不受损坏，并且能提高种子萌发效率。
在本发明中，所述萌发培养基为含香蕉80～100g/L、6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基，优选为含香蕉90～100g/L、6-苄基腺嘌呤1.2～1.8mg/L、萘乙酸0.35～0.45mg/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L和琼脂3.5～4.5g/L的1/2MS培养基，更优选为含香蕉100g/L、6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、萘乙酸0.4mg/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L和琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.8～6.0，更优选为5.8。
在本发明中，所述1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素和微量元素用量为原来的1/2，其余成分不变；所述1/2MS培养基为液体培养基，不含有琼脂；MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1991:371-374.)。本发明以1/2MS培养基为基本培养基，通过添加一定量的香蕉作为有机添加物，配合相应的植物生长调节剂组合和浓度，适宜德氏兜兰种子的无菌萌发，并且能提高种子萌发效率。
在本发明中，所述萌发光环境为：先进行遮光培养20～30d，然后进行间歇光照培养。在本发明中，所述萌发光环境下培养能够提高德氏兜兰种子的萌发速度，提高萌发率。
在本发明中，所述遮光培养的时间为20～30d，优选为25～30d。在本发明中，所述遮光培养优选为用遮光布遮盖，在黑暗条件下培养。
在本发明中，所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照度为2000～3000lx，优选为2500～3000lx。在本发明中，所述间歇光照培养的光照时间为10～16h/d，优选为12～14h/d。
在本发明中，所述萌发光环境下培养的时间优选为60～90d，更优选为70～80d。在本发明中，所述萌发光环境下培养的温度优选为25～27℃。
得到原球茎后，本发明将所述原球茎接种于分化培养基上，在分化光环境下培养，得到小苗。
在本发明中，所述分化培养基为含硝酸银0.2～0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基，优选为含硝酸银0.3～0.4mg/L、6-苄基腺嘌呤2.4～2.6mg/L、萘乙酸0.6～0.9mg/L、香蕉90～100g/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L和琼脂3.5～4.5g/L的1/2MS培养基，更优选为含硝酸银0.35mg/L、6-苄基腺嘌呤2.5mg/L、萘乙酸0.8mg/L、香蕉100g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L和琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述1/2MS培养基优选与上述技术方案所述1/2MS培养基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述分化培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.9～6.1。在本发明中，所述分化培养基通过添加一定量的硝酸银，包含相应的植物生长调节剂组合和浓度，促进了德氏兜兰原球茎分化，解决了种子萌发形成的原球茎常生长停滞后死亡的问题。
在本发明中，所述分化光环境为：光质为波长475±5nm的蓝光；光照度为2000～3000lx，优选为2500～3000lx；光照时间为10～16h/d，优选为12～14h/d。在本发明中，所述蓝光的来源优选为LED蓝光平板光源。在本发明中，所述光环境较常规光环境处理能促进德氏兜兰原球茎的分化。
在本发明中，所述分化光环境下培养的时间优选为30～50d，更优选为35～45d。在本发明中，所述分化光环境下培养的温度优选为25～27℃。
得到小苗后，本发明将所述小苗接种于壮苗与生根培养基上，在壮苗与生根光环境下培养，得到植株。
在本发明中，所述壮苗与生根培养基为含硝酸银0.5～1.0mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L、琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基，优选为含硝酸银0.6～0.8mg/L、6-苄基腺嘌呤0.3～0.4mg/L、萘乙酸0.6～0.9mg/L、香蕉90～100g/L、活性炭1.0～1.5g/L、蔗糖20～25g/L、琼脂3.5～4.5g/L的1/2MS培养基，更优选为含硝酸银0.7mg/L、6-苄基腺嘌呤0.35mg/L、萘乙酸0.8mg/L、香蕉100g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖20g/L、琼脂3.5g/L的1/2MS培养基。在本发明中，所述1/2MS培养基优选与上述技术方案所述1/2MS培养基相同，在此不再赘述。在本发明中，所述壮苗与生根培养基的pH值为5.8～6.2，优选为5.8～6.0。在本发明中，所述壮苗与生根培养基通过添加一定量的硝酸银，包含相应的植物生长调节剂组合和浓度，促进了德氏兜兰壮苗和生根。
在本发明中，所述壮苗与生根培养光环境为：光质为波长660±5nm的红光；光照度为2000～3000lx，优选为2500～3000lx；光照时间为10～16h/d，优选为12～14h/d。在本发明中，所述红光的来源优选为LED红光平板光源。在本发明中，所述光环境较常规光环境处理能促进德氏兜兰原球茎的壮苗与生根。
在本发明中，所述壮苗与生根光环境下培养的时间优选为60～90d，更优选为70～80d。在本发明中，所述壮苗与生根光环境下培养的温度优选为25～27℃。
得到植株后，本发明将所述植株进行炼苗，再经移栽后得到德氏兜兰种苗。
在本发明中，所述炼苗优选在自然光下进行；所述炼苗的时间优选为10～15d，更优选为12～13d。
本发明对所述移栽的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的移栽植株的技术方案即可。在本发明中，所述移栽后的栽培基质优选包括植金石、松树皮和泥炭土；所述植金石、松树皮和泥炭土的体积比优选为1:(4～5)：1。
下面结合实施例对本发明提供的一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
对比例1
(1)人工授粉和蒴果的管护
在迁地保护园中选择生长健壮的德氏兜兰不同单株为父母亲本，分别在花朵开放1、5、10、15、20d时进行异株人工授粉，授粉时用剪刀先把母本唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上，并套袋和挂牌标记，记录授粉日期和父母本性状，然后对母本植株进行光、温、水、肥等人工栽培管理。
德氏兜兰花朵开放不同时间的人工异株授粉结实情况见表1，在花朵开放的第10、15d时授粉成功率均达到100％，获得的饱满蒴果可作为下一步低温处理和无菌播种繁育的材料。
表1花朵开放不同时间的人工授粉情况
处理号 花朵开放时间(d) 授粉成功率(％)
1 1 0
2 5 33
3 10 100
4 15 100
5 20 67
(2)蒴果的低温沉积、消毒、无菌播种和萌发培养
采收成熟饱满、无病虫侵扰的蒴果，用干净纸巾包裹后放入带盖盒子，盖紧盒子存入干燥器，然后连同干燥器一并放入冰箱中，在4℃温度下分别储藏0、10、20、30、40d后取出，在室温下解冻，进行无菌萌发，得到原球茎如图1所示。
将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果横向切开，将粉末状种子撒播到萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发，培养温度25℃～27℃，10d后统计消毒成功率为100％；所述的诱导光环境条件为：在复合波长的日光灯(欧普T5灯源，28w)下培养，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。所述的萌发培养基为：每升含有香蕉50g、6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg、萘乙酸(NAA)0.1mg、活性炭(AC)1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.5；其配制方法是将50g香蕉(50g去皮香蕉加无菌水搅碎成汁)、0.5mg 6-苄基腺嘌呤、0.1mg萘乙酸、1.0g活性炭、20g蔗糖和3.5g琼脂，加到1/2MS培养基(母液)中，然后用无菌水定容至1L，混合均匀，灭菌备用。
培养60d时对种子萌发率进行统计，结果如表2所示，随着蒴果在4℃温度下储藏时间的延长，其萌发率先上升后下降，储藏20d和30d时萌发率最高。种子萌发后继续培养逐步形成原球茎，可进行下一步的原球茎分化培养。
表2在4℃温度下不同储藏时间对萌发率的影响
处理号 储藏时间(d) 萌发率(％)
1 0 11a
2 10 17a
3 20 35b
4 30 38b
5 40 23a
注：同一列不同的小写字母表示0.05水平差异显著。
(3)原球茎的分化
将原球茎接种到分化培养基上，在分化光环境下诱导原球茎分化，培养温度25℃～27℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d；所述的分化培养基为：6-苄基腺嘌呤1.0mg、萘乙酸0.1mg、香蕉50g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.5；其配制方法是将50g香蕉(50g去皮香蕉加无菌水搅碎成汁)、1.0mg6-苄基腺嘌呤、0.1mg萘乙酸、1.0g活性炭、20g蔗糖和3.5g琼脂，加到1/2MS培养基(母液)中，然后用无菌水定容至1L，混合均匀，灭菌备用。
原球茎在不同光环境下分化培养的结果如表3所示，培养40d时均能分化出高1.0cm左右的小苗，但小苗生长情况存在差异，其中以波长475±5nm的蓝光LED平板灯具为光源的光环境下生长最好。
表3不同光环境对原球茎分化的影响
Figure BDA0002933730840000101
(4)壮苗与生根培养
将高1.0cm的小苗接种到壮苗与生根培养基上，在不同光环境下培养，光照度均为2000～3000lx，光照时间12h/d，培养温度为25℃～27℃。采用标准兰花培养瓶(容量为650mL)，每瓶接种20株。所述的壮苗与生根培养基为：每升含有硝酸银(AgNO3)0.2mg、萘乙酸0.2mg、香蕉50g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.5；其配制方法是将50g香蕉(50g去皮香蕉加无菌水搅碎成汁)、0.2mg萘乙酸、1.0g活性炭、20g蔗糖和3.5g琼脂，加到1/2MS培养基(母液)中，然后用无菌水定容至1L，混合均匀，灭菌备用。
在不同光环境下的壮苗和生根情况如表4所示，培养60d时芽苗高度均能增加，并具有发达的根系。其中以波长660±5nm的红光LED平板灯具为光源的光环境下生长最好，芽苗高度最高，平均高度达到3～3.5cm，同时具有发达的根系。
表4不同光环境对壮苗与生根的影响
Figure BDA0002933730840000111
(5)试管苗移栽
将具株高2.5cm以上的完整植株从培养瓶转移到温室中，在自然光环境下炼苗5d，然后打开培养瓶盖，将试管苗取出，洗净根部的培养基，种植于铺有栽培基质的苗床上。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮(新西兰进口)和泥炭土(以色列进口)按质量比为1:3:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，由此得到种苗，移栽的成活率可达60％。
实施例1
(1)人工授粉和蒴果的管护
在迁地保护园中选择生长健壮的德氏兜兰不同单株为父母亲本，在花朵开放10d时进行异株人工授粉，授粉时用剪刀先把母本唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上，并套袋和挂牌标记，记录授粉日期和父母本性状，然后对母本植株进行光、温、水、肥等人工栽培管理。授粉成功率达到100％，将获得的饱满蒴果作为下一步低温处理和无菌播种繁育的材料。
(2)蒴果的低温沉积、消毒、无菌播种和萌发培养
采收成熟饱满、无病虫侵扰的蒴果，用干净纸巾包裹后放入带盖盒子，盖紧盒子存入干燥器，然后连同干燥器一并放入冰箱中，在4℃温度下储藏20d后取出，在室温下解冻，进行无菌萌发试验。
将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果横向切开，将粉末状种子撒播到萌发培养基上培养，培养温度25℃～27℃，10d后统计消毒成功率为100％，60d时的萌发率47.7％。光环境条件为：先用遮光布遮盖在黑暗条件下培养20d，然后转到复合波长的日光灯(欧普T5灯源)下培养40d，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。所述的萌发培养基为：1L含有香蕉80g、6-苄基腺嘌呤1.0mg、萘乙酸0.3mg、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.8。
(3)原球茎的分化
将原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度25℃～27℃，光环境条件为：光源为波长475±5nm的蓝光LED平板灯具，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。培养40d能分化出高1cm左右的小苗，苗形态正常，如图2所示。所述的分化培养基为：1L含有硝酸银0.2mg、6-苄基腺嘌呤2.0mg、萘乙酸0.5mg、香蕉80g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.8。
(4)壮苗与生根培养
将高1.0cm的小苗接种到壮苗与生根培养基上培养，采用标准兰花培养瓶，每瓶接种20株。培养60d能形成株高2.5～3cm高根系发达的完整植株。培养温度为25℃～27℃，壮苗与生根光环境为：光源为波长660±5nm的红光LED平板灯具，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。所述的壮苗与生根培养基为：1L含有硝酸银0.5mg、6-苄基腺嘌呤0.2mg、萘乙酸0.5mg、香蕉80g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值5.8。
(5)试管苗移栽
将具株高3cm的完整植株从培养瓶转移到温室中，在自然光环境下炼苗10d，然后打开培养瓶盖，将试管苗取出，洗净根部的培养基，种植于铺有栽培基质的苗床上。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮(新西兰进口)和泥炭土(以色列进口)按质量比为1:4:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，由此得到种苗，移栽的成活率可达100％。
实施例2
(1)人工授粉和蒴果的管护
在迁地保护园中选择生长健壮的德氏兜兰不同单株为父母亲本，在花朵开放15d时进行异株人工授粉，授粉时用剪刀先把母本唇瓣的兜囊剪掉，用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上，并套袋和挂牌标记，记录授粉日期和父母本性状，然后对母本植株进行光、温、水、肥等人工栽培管理。
(2)蒴果的低温沉积、消毒、无菌播种和萌发培养
采收成熟饱满、无病虫侵扰的蒴果，用干净纸巾包裹后放入带盖盒子，盖紧盒子存入干燥器，然后连同干燥器一并放入冰箱中，在4℃温度下储藏30d后取出，在室温下解冻，进行无菌萌发试验。
将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡120s，无菌水漂洗1次，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒15min，无菌水漂洗5次，然后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，用经过高温灭菌的刀具将蒴果横向切开，将粉末状种子撒播到萌发培养基上培养，培养温度25℃～27℃，10d后统计消毒成功率为100％，50d时的萌发率45％。光环境条件为：先用遮光布遮盖在黑暗条件下培养30d，然后转到复合波长的日光灯(欧普T5灯源)下培养，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。所述的萌发培养基为：1L含有香蕉100g、6-苄基腺嘌呤2.0mg、萘乙酸0.5mg、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值6.2。
(3)原球茎的分化
将原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度25℃～27℃，光环境条件为：光源为波长475±5nm的蓝光LED平板灯具，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。40d能分化出高1.0cm左右的小苗，丛芽较多但苗较细弱。所述的分化培养基为：1L含有硝酸银0.5mg、6-苄基腺嘌呤3.0mg、萘乙酸1.0mg、香蕉100g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值6.2。
(4)壮苗与生根培养
将高1.0cm的小苗接种到壮苗与生根培养基上培养，采用标准兰花培养瓶，每瓶接种20株，60d能形成株高3～4cm高根系发达的完整植株，如图3所示。培养温度25℃～27℃，光环境条件为：光源为波长660±5nm的红光LED平板灯具，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d。所述的壮苗与生根培养基为：1L含有硝酸银0.5mg、6-苄基腺嘌呤0.5mg、萘乙酸1.0mg、香蕉100g、活性炭1.0g、蔗糖20g、琼脂3.5g，其余为1/2MS培养基，pH值6.2。
(5)试管苗移栽
将具株高3cm的完整植株从培养瓶转移到温室中，在自然光环境下炼苗15d，然后打开培养瓶盖，将试管苗取出，洗净根部的培养基，种植于铺有栽培基质的苗床上。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮(新西兰进口)和泥炭土(以色列进口)按质量比为1:5:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，由此得到种苗，移栽的成活率为100％。
从以上对比例和实施例可以看出，本发明提供的德氏兜兰种子非共生萌发的方法与常规培养基和光环境相比，能够促进无菌播种快速繁殖，具有蒴果饱满、消毒污染率低、种子萌发率高、出苗快、种苗品质好等优点，德氏兜兰种苗可应用于迁地保护和自然回归，还可用于遗传改良进行新品种培育供应市场，有利于德氏兜兰的资源保护和可持续利用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种德氏兜兰种子非共生萌发的方法，包括以下步骤：
(1)将德氏兜兰种子接种于萌发培养基上，在萌发光环境下诱导种子萌发，得到原球茎；
所述萌发培养基为含香蕉80～100g/L、6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述萌发培养基的pH值为5.8～6.2；
所述萌发光环境为：先进行遮光培养20～30d，然后进行间歇光照培养；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(2)将所述步骤(1)得到的原球茎接种于分化培养基上，在分化光环境下培养，得到小苗；
所述分化培养基为含硝酸银0.2～0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述分化培养基的pH值为5.8～6.2；
所述分化光环境为：光质为波长475±5nm的蓝光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(3)将所述步骤(2)得到的小苗接种于壮苗与生根培养基上，在壮苗与生根光环境下培养获得完整植株；
所述壮苗与生根培养基为含硝酸银0.5～1.0mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、香蕉80～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L、琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基；所述壮苗培养基的pH值为5.8～6.2；
所述壮苗与生根光环境为：光质为波长660±5nm的红光，光照度为2000～3000lx，光照时间为10～16h/d；
(4)将所述步骤(3)得到的植株进行炼苗，再经移栽后得到德氏兜兰种苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中德氏兜兰种子由蒴果经消毒处理后切开得到；所述蒴果在消毒处理前进行低温沉积。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低温沉积的温度为0～10℃，所述低温沉积的时间为20～30d。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述蒴果为德氏兜兰花朵开放的第10～15d时进行异株人工授粉获得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述异株人工授粉为：选取花朵完全开放的不同单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后将父本的花粉囊涂抹在母本的柱头面上。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒处理包括：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗4～5次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的萌发培养、步骤(2)中的分化培养和步骤(3)中的生根培养的温度独立地为25～27℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的炼苗在自然光下进行，炼苗的时间为10～15d。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的移栽后的栽培基质包括植金石、松树皮和泥炭土。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植金石、松树皮和泥炭土的体积比为1:(4～5)：1。
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