CN114431153B - 一种药用植物大百部的组培快繁方法及其应用 - Google Patents

一种药用植物大百部的组培快繁方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药用植物组织培养领域，具体涉及一种药用植物大百部的组培快繁方法，步骤包括：1)外植体消毒：选择大百部带芽茎段，洗净后依次用75％酒精、饱和漂白粉溶液、8％双氧水溶液和0.025％升汞消毒；2)丛生芽诱导：将消毒完的外植体接种于诱导培养基中培养；3)丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽按极性接种于增殖培养基培养；4)丛生芽生根：将增殖的丛生芽剪成单芽，按极性接种于生根培养基培养。本发明方法进行大百部的组培快繁，其消毒污染率、死亡率、增殖枯黄率、生根枯黄率远低于现有公开的技术方案，而50天诱导率、35天增殖系数、30天生根率和50天驯化成活率均高于现有技术，可实现大百部的快速繁殖。

Description

一种药用植物大百部的组培快繁方法及其应用
技术领域
本发明涉及药用植物组织培养领域，具体涉及一种药用植物大百部的组培快繁方法。
背景技术
大百部(Stemona tuberosa Lour.)又名对叶百部，九重根，山百部根，大春根药等，为百部科百部属多年生草本植物，主要生长于海拔370～2240米的山坡丛林下、溪边、路旁以及山谷和阴湿岩石中，我国长江流域以南各省区均有分布，中南半岛、菲律宾及印度北部亦有分布。以块根入药，是中药材百部的基源植物之一，其具润肺下气止咳，杀虫灭虱的功效。主要用于新久咳嗽，肺痨咳嗽，顿咳；外用于头虱，体虱，蛲虫病，阴痒等症，蜜百部有润肺止咳的功效，主要用于阴虚劳嗽。
现代医药研究表明，大百部内含百部碱，对叶百部碱，异对叶百部碱，百部次碱，次对叶百部碱，氧化对叶百部碱，滇百部碱，异滇百部碱，新对叶百部酮，对叶百部醇等活性成分，具有抗病原微生物、抗寄生虫、的杀昆虫的作用，镇咳、祛痰和平喘的作用等。百部是中国传统成方制剂的常用药材，以其为原料药的中药制剂有近200种，涉及制药企业上百余家，同时，百部还可提取生物总碱，用于洗发水、沐浴液等日用化工产品以及杀虫、杀菌等天然农药。据不完全调查统计，全国医药、农药、日化、出口等行业每年使用百部药材达5000吨，且需求量逐年上涨。
目前，百部药材主要来源为野生资源，近年来在云南、广西、贵州等地开始进行野生资源引种种植，而百部繁殖主要靠种子繁殖，但种子繁殖存在品种间杂交而导致品种不纯，结实率低，种子发芽率低等，同时，百部品种繁多，品种间生物碱等有效成分含量差异极大，使得目前人工繁殖的百部药材及种苗质量参差不齐。除此，百部还可进行扦插及压蔓繁殖，但生根率低，且繁殖率低，繁殖周期长。
近年来部分单位亦开展了百部的组培繁殖，但现有组培繁育技术存在消毒污染率高，而当使用高浓度升汞或低浓度长时间消毒时，容易导致外植体大量死亡，同时在培养过程中亦存在增殖系数及生根率低，增殖及生根培养过程中，苗大量枯黄甚至枯白的情况，使得苗损失率较高，而现有技术的生根苗，根系粗脆且易折断。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种药用植物大百部的组培快繁方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种药用植物大百部的组培快繁方法，步骤包括：
(1)外植体清洁：选择大百部，栽植于室内，每隔3天向茎叶喷施一次75％多菌灵800倍液，连续喷施3次后，取大百部顶端20～30cm的茎段，剪去叶，并将其剪成2～3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min后，用自来水洗净，后加2～3滴吐温-80，震摇15～20min，后用自来水冲淋50～60min；
(2)外植体消毒：洗净后的大百部外植体，先后用75％(v/v)酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒15～18min，无菌水涮洗3～4次，8％(v/v)双氧水溶液消毒18～20min，无菌水涮洗3～4次，0.025％(v/v)升汞消毒4～5min，无菌水涮洗5～6次；
(3)丛生芽诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉两端切口，按极性接种于WPM+NAA 0.05～0.15mg/L+ZT 0.2～0.3mg/L+TDZ 1.0～1.5mg/L+活性炭0.8g/L的诱导培养基中，在温度为23～27℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养45～55天；
(4)丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽剪成单芽，按极性接种于改良WPM(1)+ZT 0.06～0.08mg/L+KT 3.0～4.0mg/L+椰汁80～100g/L+椰乳35～40g/L+活性炭0.6g/L的增殖培养基中，在温度为23～27℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；
(5)丛生芽生根：将增殖的丛生芽剪成单芽，按极性接种于以改良WPM(2)+IBA 2.5～3.0mg/L+KT 0.8～1.2mg/L+多效唑0.1～0.2mg/L+椰汁40～60g/L+椰乳60～70g/L+活性炭0.5g/L的生根培养基中，接种时每瓶添加1～2mL已过滤灭菌，同时浓度为0.8～1.0mg/L的IAA，在温度为23～27℃，光照强度3000～4000LX，日照光14h的光暗交替环境下培养25～30天。
改良WPM(1)为大量元素中的硝酸铵改为340～360mg/L，磷酸二氢钾改为240～250mg/L，钙盐中的硝酸钙改为240～280mg/L，有机物中的肌醇改为120～130mg/L，VB1改为2.0～2.2mg/L，其余大量元素、有机物、铁盐及所有微量元素均不变。
改良WPM(2)培养基为大量元素中的硝酸铵改为190～200mg/L，磷酸二氢钾改为80～90mg/L，硫酸镁改为160～180mg/L，硫酸钾改为550～580mg/L，钙盐中的硝酸钙改为200～210mg/L，有机物中的肌醇改为160～180mg/L，VB1改为1.8～2.0mg/L，其余有机物、铁盐及所有微量元素不变。
本发明的有益技术效果是：
1、本发明采用的消毒方法，可使外植体消毒污染率仅为12％，同时，可使外植体因消毒导致的死亡率降低至1％。
2、本发明在增殖培养过程中采用了以改良WPM(1)基本培养基，能有效改善大百部在增殖培养过程中苗枯黄甚至枯白的情况，降低增殖培养过程中苗的损失率，同时采用了一定浓度的ZT及KT的比例组合，并添加一定浓度的椰汁及椰乳，可使百部在增殖培养过程中增殖系数提高到9。
3、本发明在生根培养过程中采用了以改良WPM(2)基本培养基，一方面亦能有效改善大百部在生根培养过程中苗的枯黄甚至枯白情况，另一方面，搭配一定浓度的IAA、IBA、KT及椰汁、椰乳，可使生根苗的根系较粗但不脆且不易折断；
同时，不论是IBA、NAA还是2,4-D，无论怎么组合，都不能使大百部生根率得到有效提高，而IAA具有热极不稳定性，一般在组培生根时使生根率不稳定，而本发明采用接种时添加IAA，此时培养基已凝固，IAA可在培养基内形成流动层，而在接种时，流动的IAA可与接种的大百部基部直接接触，能有效提高大百部生根率至98％。
4、本发明在生根培养过程中，加入一定浓度的多效唑，减少了一般组培过程中壮苗环节，有利于苗的健壮，同时还能增加根系的粗度，可有效提高大百部组培苗驯化成活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种药用植物大百部的组培快繁方法，步骤包括：
(1)、外植体的清洁：选择大百部，栽植于室内，每隔3天向茎叶喷施一次75％多菌灵800倍液，连续喷施3次后，取大百部顶端20cm的茎段，剪去叶，并将其剪成2cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10min后，用自来水洗净，后加2滴吐温-80，震摇15min，后用自来水冲淋50min；
(2)、外植体的消毒：洗净后的大百部外植体，先后用75％(v/v)酒精消毒15s，无菌水涮洗2次，饱和漂白粉溶液消毒15min，无菌水涮洗3次，8％(v/v)双氧水溶液消毒18min，无菌水涮洗3次，0.025％(v/v)升汞消毒4min，无菌水涮洗5次；
(3)、丛生芽的诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉两端伤口，按极性接种于WPM+NAA 0.05mg/L+ZT 0.2mg/L+TDZ 1.0mg/L+活性炭0.8g/L的诱导培养基中，在温度为25℃，光照强度2000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养50天；
(4)、丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于改良WPM(1)+ZT0.06mg/L+KT 3.0mg/L+椰汁80g/L+椰乳35g/L+活性炭0.6g/L的增殖培养基中，在温度为25℃，光照强度2000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养35天；
改良WPM(1)的配方为在WPM培养基的基础上，将大量元素中的硝酸铵改为340mg/L，磷酸二氢钾改为240mg/L，钙盐中的硝酸钙改为240mg/L，有机物中的肌醇改为120mg/L，VB1改为2.0mg/L，其余大量元素、有机物、铁盐及所有微量元素均不变。
(5)、丛生芽的生根：将增殖或初代诱导的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于以改良WPM(2)+IBA 2.5mg/L+KT 0.8mg/L+多效唑0.1mg/L+椰汁40g/L+椰乳60g/L+活性炭0.5g/L的生根培养基中，接种时每瓶添加2ml已过滤灭菌，同时浓度为0.8mg/L的IAA。在温度为25℃，光照强度3000Lux，日照光14h的光暗交替环境下培养25天；
改良WPM(2)的配方为在WPM培养基的基础上，将大量元素中的硝酸铵改为190mg/L，磷酸二氢钾改为80mg/L，硫酸镁改为160mg/L，硫酸钾改为550mg/L，钙盐中的硝酸钙改为200mg/L，有机物中的肌醇改为160mg/L，VB1改为1.8mg/L，其余有机物、铁盐及所有微量元素不变。
(6)、驯化：将生根苗，移栽于珍珠岩与泥炭土1:5的基质中，前十天保证空气湿度95％以上，后逐步降低湿度，驯化50天后查看成活率。
实施例2
(1)、外植体的清洁：选择大百部，栽植于室内，每隔3天向茎叶喷施一次75％(v/v)多菌灵800倍液，连续喷施3次后，取大百部顶端30cm的茎段，剪去叶，并将其剪成3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗15min后，用自来水洗净，后加3滴吐温-80，震摇20min，后用自来水冲淋60min；
(2)、外植体的消毒：洗净后的大百部外植体，先后用75％(v/v)酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒18min，无菌水涮洗4次，8％(v/v)双氧水溶液消毒20min，无菌水涮洗4次，0.025％(v/v)升汞消毒5min，无菌水涮洗6次；
(3)、丛生芽的诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉两端伤口，按极性接种于WPM+NAA 0.15mg/L+ZT 0.3mg/L+TDZ 1.5mg/L+活性炭0.8g/L的诱导培养基中，在温度为23℃，光照强度3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养50天；
(4)、丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于改良WPM(1)+ZT0.08mg/L+KT 4.0mg/L+椰汁100g/L+椰乳40g/L+活性炭0.6g/L的增殖培养基中，在温度为23℃，光照强度3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养35天；
改良WPM(1)的配方为在WPM培养基的基础上，将大量元素中的硝酸铵改为360mg/L，磷酸二氢钾改为250mg/L，钙盐中的硝酸钙改为280mg/L，有机物中的肌醇改为130mg/L，VB1改为2.2mg/L，其余大量元素、有机物、铁盐及所有微量元素均不变。
(5)、丛生芽的生根：将增殖或初代诱导的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于以改良WPM(2)+IBA 3.0mg/L+KT 1.2mg/L+多效唑0.2mg/L+椰汁60g/L+椰乳70g/L+活性炭0.5g/L的生根培养基中，接种时每瓶添加2mL已过滤灭菌，同时浓度为1.0mg/L的IAA；在温度为23℃，光照强度4000Lux，日照光14h的光暗交替环境下培养30天。
改良WPM(2)的配方为在WPM培养基的基础上，将大量元素中的硝酸铵改为200mg/L，磷酸二氢钾改为90mg/L，硫酸镁改为180mg/L，硫酸钾改为580mg/L，钙盐中的硝酸钙改为210mg/L，有机物中的肌醇改为180mg/L，VB1改为2.0mg/L，其余有机物、铁盐及所有微量元素不变。
(6)、驯化：将生根苗，移栽于珍珠岩与泥炭土1:5的基质中，前十天保证空气湿度95％以上，后逐步降低湿度，驯化50天后查看成活率。
对比例1
照《一种提高对叶百部组培苗生根率的方法》(公开号：CN105340741A)方法实施。
结果统计为：消毒污染率21.3％，消毒死亡率48.6％，诱导率85.2％，增殖系数4.9，增殖过程中枯黄及枯白率7.3％，生根率90.3％，生根培养过程中枯黄及枯白率4.8％，驯化成活率80.5％。
对比例2
照《一种直立百部组织培养的快速繁殖方法》(公开号号：CN104221873A)方法实施。
结果统计为：消毒污染率54.8％，消毒死亡率12.3％，诱导率64.8％，增殖系数5.4，增殖过程中枯黄及枯白率5.2％，生根率86.0％，生根培养过程中枯黄及枯白率6.2％，驯化成活率65.7％。
对比例3
照(杨振德，黄寿先等《药用植物百部的组织培养与快速繁殖》[J]，中草药，2002，33(9)：843～846)的最佳方法实施。
各对比例均按照实施例1中的驯化技术进行驯化
Figure BDA0003552074630000071
从上表可知，利用本发明方法进行大百部的组培快繁，其消毒污染率、死亡率、增殖枯黄率、生根枯黄率远低于现有公开的技术方案，而50天诱导率、35天增殖系数、30天生根率和50天驯化成活率均高于现有技术，可实现大百部的快速繁殖。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种药用植物大百部的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外植体清洁：选择大百部，栽植于室内，每隔3天向茎叶喷施一次75%多菌灵800倍液，连续喷施3次后，取大百部顶端20～30cm的茎段，剪去叶，并将其剪成2～3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min后，用自来水洗净，后加2～3滴吐温-80，震摇15～20min，后用自来水冲淋50～60min；
（2）外植体消毒：洗净后的大百部外植体，先后用75%酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次；饱和漂白粉溶液消毒15～18min，无菌水涮洗3～4次；8%双氧水溶液消毒18～20min，无菌水涮洗3～4次；0.025%升汞消毒4～5min，无菌水涮洗5～6次；
（3）丛生芽诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，同时剪掉两端切口，接种于诱导培养基中，在温度为23～27℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养45～55天；
所述诱导培养基的配方为：WPM+NAA 0.05～0.15mg/L+ZT 0.2～0.3mg/L+TDZ 1.0～1.5mg/L+活性炭0.8g/L；
（4）丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽剪成单芽，按极性接种于增殖培养基中，在温度为23～27℃，光照强度2000～3000Lux，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；
所述增殖培养基的配方为：改良WPM（1）+ZT 0.06～0.08mg/L+KT 3.0～4.0mg/L +椰汁80～100g/L +椰乳35～40g/L+活性炭0.6g/L；
（5）丛生芽生根：将增殖的丛生芽剪成单芽，按极性接种于生根培养基中，接种时每瓶加入1-2mL已过滤灭菌、浓度为0.8-1.0 mg/L的IAA，在温度为23～27℃，光照强度3000～4000 Lux，日照光14h的光暗交替环境下培养25～30天；
所述生根培养基的配方为：改良WPM（2）+IBA 2.5～3.0mg/L+KT 0.8～1.2mg/L+多效唑0.1～0.2mg/L+椰汁40～60g/L+椰乳 60～70g/L+活性炭0.5g/L；
所述改良WPM（1）为大量元素中的硝酸铵改为340～360mg/L，磷酸二氢钾改为240～250mg/L，钙盐中的硝酸钙改为240～280mg/L，有机物中的肌醇改为120～130mg/L，VB1改为2.0～2.2mg/L，其余大量元素、有机物、铁盐及所有微量元素均不变；
所述改良WPM（2）培养基为大量元素中的硝酸铵改为190～200mg/L，磷酸二氢钾改为80～90mg/L，硫酸镁改为160～180mg/L，硫酸钾改为550～580mg/L，钙盐中的硝酸钙改为200～210mg/L，有机物中的肌醇改为160～180mg/L，VB1改为1.8～2.0mg/L，其余有机物、铁盐及所有微量元素不变。
2.根据权利要求1所述方法在大百部快繁中的应用。
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