CN111557138B - 一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法。包括以下步骤：(1)种子预处理：将剥离后的桃金娘种子用杀菌溶液消毒，水清洗后干燥；(2)浸种：将步骤(1)预处理后的种子依次用CaCl₂水溶液和赤霉素水溶液浸泡，水清洗后干燥；(3)湿沙处理：将步骤(2)所得浸种后的种子与湿润河沙混合，于0～8℃下进行堆积；(4)种子无菌处理：将步骤(3)所得湿沙处理后的种子用水清洗，依次用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，每次消毒后用水清洗；(5)萌发培养：最后将步骤(4)所得无菌处理后的种子干燥，置于培养基中培养。本发明方法可以有效提高桃金娘种子的萌发率和降低种子组培的污染率。

Description

一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法

技术领域

本发明涉及现代中草药栽培技术领域，特别是涉及一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法。

背景技术

桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hask)为桃金娘科桃金娘属常绿小灌木，别名岗稔、山稔、山旦仔、桃娘等，原产于我国东南部、南部、西南部以及亚洲热带和亚热带地区。桃金娘集观赏、药用、营养保健等用途于一身，其叶片浓绿、花色艳丽，果实可食，具有很高的观赏价值以及食用、药用价值，是一种优良的野生植物资源，对华南地区荒山绿化、水土保持贡献巨大，也是重要的蜜源、药用和香料树种。

桃金娘是传统中药材，主要以根、叶、果入药，性味甘、涩、平；具清热解毒、收敛止泻、理气止痛、祛风活络、祛瘀止血、安胎等功效；也可用于急、慢性肠胃炎、消化不良、痢疾、腹泻、呕吐泄泻、脘腹疼痛等疾病。其果实完全成熟时极甜，略有涩味，汁液呈诱人的紫红色，富含多糖、单宁、黄酮类、花青素及花色苷等多种活性成分。研究表明，桃金娘多糖具有抗氧化、护肝等功能。

当前，桃金娘还处于野生资源阶段，其开发利用进展较慢。近年来，随着人为、牲畜活动频繁，桃金娘生境屡遭破坏。同时由于对其过度挖掘，使个体数锐减，导致遗传多样性减少。虽然桃金娘医药、保健价值高，经济效益大，但因其种子萌发率较低、组培时污染死亡率高，而有文献表明桃金娘在某些地区扦插成活率极低，进行大面积人工驯化栽培较难，故桃金娘仍处于野生状态，影响桃金娘栽培推广及深入研究。虽然周勇辉发表的《浸种对桃金娘种子萌发特性的影响》记载了一种提高桃金娘种子发芽率的方法，其通过选择在4℃恒温浸种处理，种子处理60天可以提高种子的发芽率。但是，其选取的种子是12月成熟鲜果剥离出的新成熟的桃金娘种子，此时期的种子萌发率虽然比储藏一段时间后的种子高很多，但是限制了种子萌发的时节必须接近种子采收时间，不利于大规模产业化推行。而桃金娘种子在储存期间随着储存时间的延长，其种子活力和萌发率会大大降低，萌发时间延长。一般桃金娘种子自采摘后储藏1年左右会几乎失去萌发活力。

因此，如何提高桃金娘种子经过长时间储存之后的种子活力、提高萌发率和降低污染率，以促进实现人工栽培种植，保护生态地理多样性刻不容缓。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种提高经过长时间储存之后的桃金娘种子的组培萌发率和降低污染率的处理方法。

具体技术方案如下：

一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法，包括以下步骤：

(1)种子预处理：将剥离后的桃金娘种子用杀菌溶液消毒，水清洗后干燥；

(2)浸种：将步骤(1)预处理后的种子依次用CaCl₂水溶液和赤霉素水溶液浸泡，水清洗后干燥；

(3)湿沙处理：将步骤(2)所得浸种后的种子与湿润河沙混合，于0～8℃下进行堆积；

(4)种子无菌处理：将步骤(3)所得湿沙处理后的种子用水清洗，依次用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，每次消毒后用水清洗；

(5)萌发培养：最后将步骤(4)所得无菌处理后的种子干燥，置于培养基中培养。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述湿沙处理过程中，湿润河沙的湿度为15～35％，优选湿润河沙的湿度为23～27％。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述浸种后的种子与湿润河沙的体积比为1：4～6。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述堆积为避光堆积。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述湿润河沙的粒径为1～3mm。

在其中一些实施例中，步骤(4)中，所述乙醇水溶液的体积分数为70～80％，乙醇水溶液消毒的时长为5～15s；所述氯化汞水溶液的质量浓度为0.01～0.1％，氯化汞水溶液消毒的时长为5～15min；所述次氯酸钠水溶液的质量浓度为1～5％，次氯酸钠水溶液消毒的时长为5～15min。

在其中一些实施例中，所述乙醇水溶液的体积分数为73～77％，乙醇水溶液消毒的时长为8～12s；所述氯化汞水溶液的质量浓度为0.08～0.1％，氯化汞水溶液消毒的时长为8～12min；所述次氯酸钠水溶液的质量浓度为2～4％，次氯酸钠水溶液消毒的时长为8～12min。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述堆积的时长为35～45天，每8～12天翻动一次种子。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述堆积为层积。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述CaCl₂水溶液的浓度为300～500mg/L。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述赤霉素水溶液的浓度为300～700mg/L。

在其中一些实施例中，所述种子的体积与CaCl₂水溶液或赤霉素水溶液的体积的比值为1：2～4。

在其中一些实施例中，所述CaCl₂水溶液或赤霉素水溶液浸泡的时间为22～26h。

在其中一些实施例中，步骤(5)中，所述培养基为MS复合培养基、1/2MS复合培养基或无菌水浸泡的无菌纱布。

在其中一些实施例中，所述MS复合培养基包括以下组分：MS培养基、0.8～1.2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/L激动素和30～50mg/L赤霉素。

在其中一些实施例中，所述1/2MS复合培养基包括以下组分：1/2MS培养基、0.8～1.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/L激动素和30～50mg/L赤霉素。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述杀菌溶液为4～6wt％CuSO₄水溶液，杀菌溶液消毒的时间为25～35min。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述浸泡为避光4～6℃浸泡；步骤(5)中所述培养的温度为25～28℃。

在其中一些实施例中，所述桃金娘种子为从桃金娘干果中剥离所得种子。

在其中一些实施例中，所述桃金娘干果为采摘后储藏3～8个月后的桃金娘干果。进一步地，所述桃金娘干果为采摘后储藏5～6个月后的桃金娘干果。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述剥离为人工徒手剥离；步骤(4)的无菌处理操作和步骤(5)的萌发培养操作均在无菌环境下进行。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

为了解决桃金娘种子萌发率低、组培污染率高的缺陷，本发明方法先采用CaCl₂和赤霉素水溶液对桃金娘种子进行浸种，促进种子解除休眠；在此基础上，然后用湿沙对浸种后的种子进行低温湿沙堆积，使得种子进一步破除休眠，促进种子萌发，再结合其他条件，本发明最终显著提高了种子萌发率，尤其是将储藏5～6个月后的种子的萌发率提高达41％。并且，通过将桃金娘种子按照本发明方法处理后萌发后的种苗，繁殖速度快，移栽成活率高。

在对湿沙处理过的桃金娘种子进行无菌处理的过程中，发明人发现依次选用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，对桃金娘种子的杀菌效果好，污染率低；进一步对消毒剂的浓度和时间进行精准控制，不会有损种子的萌发，且可以显著降低种子组培的污染率。

此外，本发明方法的操作简单、易于掌握，有利于开展桃金娘种苗扩繁的后续工作。

附图说明

图1是在不同培养基中培养的桃金娘种子萌发情况；

图2是实施例1桃金娘小苗移栽生长情况。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本实施方式提供一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法，包括以下步骤：

(1)种子预处理：将剥离后的桃金娘种子用杀菌溶液消毒，水清洗后干燥；

(2)浸种：将步骤(1)预处理后的种子依次用CaCl₂水溶液和赤霉素水溶液浸泡，水清洗后干燥；

(3)湿沙处理：将步骤(2)所得浸种后的种子与湿润河沙混合，于0～8℃下进行堆积；

(4)种子无菌处理：将步骤(3)所得湿沙处理后的种子用水清洗，依次用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，每次消毒后用水清洗；

(5)萌发培养：最后将步骤(4)所得无菌处理后的种子干燥，置于培养基中培养。

进一步地，发明人在研究中发现，桃金娘种子对于步骤(3)中湿沙的湿度对于较为敏感，控制湿沙的湿度为23～27％，表现出更好的萌发率。湿度过低，则会种子休眠解除减慢，萌发延迟；湿度过高，则会种子呼吸受到抑制，降低萌发率。

此外，对桃金娘种子无菌处理过程中，消毒剂的种类、浓度以及消毒顺序会对桃金娘种子的杀菌效果以及桃金娘种子的萌发率均有较大的影响。本发明的研究团队通过大量的研究实验，通过对消毒剂的浓度和作用时间进行精准控制：依次用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，并控制乙醇水溶液的体积分数为73～77％，乙醇水溶液消毒的时长为8～12s；氯化汞水溶液的质量浓度为0.08～0.1％，氯化汞水溶液消毒的时长为8～12min；次氯酸钠水溶液的质量浓度为2～4％，次氯酸钠水溶液消毒的时长为8～12min，实现种子组培的无污染，并且上述消毒步骤避免了对桃金娘种子的萌发率的不利影响，最终同时实现了桃金娘种子的高萌发率和低污染率。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例涉及的桃金娘种子的采集来源：所用桃金娘种子采自于广州华南植物园，选取植株成熟、饱满的浆果，将果实干燥后于4℃下储藏备用，种子采摘时间是2019年8月。

实施例1

(1)种子预处理：取储藏5～6个月的桃金娘干果，人工剥离出种子后(忌用机械处理，避免造成的种子损伤)，用5wt％CuSO₄溶液浸泡消毒30min，用蒸馏水将种子冲洗干净，平铺在滤纸上于室内阴干表面水分，阴干水分以滤纸轻拭种子表面无水印为标准。

(2)浸种：将预处理后的种子依次用两种浸种溶液按种子和浸种溶液的体积比为1:3进行浸泡，浸泡的容器用封口膜封住，避光放置于4摄氏度的环境中，分别浸泡24h；所述第一种浸种溶液为浓度为400mg/L的氯化钙水溶液；所述第二种浸种溶液为浓度为500mg/L的赤霉素水溶液。浸泡结束然后用清水清洗两次种子，于室内晾干得到洁净种子。

(3)湿沙处理：将步骤(2)获得的洁净种子与湿润河沙(湿度为23-27％，使用前经高温消毒，粒径为1～3mm)按体积比1：5拌匀，置于透气良好的全网状筐内，于4℃下沙层积室内避光保藏40天，每10天翻动一次种子，使种子透气并获得足够氧气，在整个层积时间内保持湿沙的含水量始终在25％左右；

(4)种子无菌处理：将步骤(3)获得的洁净种子，用无菌水冲洗3～4次，用体积分数为75％的乙醇水溶液消毒10s后，立即用无菌水冲洗3～4次，接着用0.1wt％的HgCl₂水溶液消毒10min，立即用无菌水冲洗6～7次，最后用3wt％的NaClO水溶液消毒10min，立即用无菌水冲洗6～7次，转移至无菌滤纸或纱布上晾干。

(5)萌发培养：用无菌的镊子将种子均匀铺在MS复合培养基(或者1/2MS复合培养基、无菌水浸泡的无菌纱布)上，每瓶铺20粒种子，盖上培养瓶盖子，放在25～28℃的培养间培养，观察种子萌发和污染霉变情况。

MS复合培养基：MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+GA₃ 40mg/L；

1/2MS复合培养基：1/2MS培养基+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+GA₃40mg/L；

上述培养基配置时需要经过高温灭菌消毒，赤霉素需经过过滤除菌后添加。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(4)中，HgCl₂水溶液的消毒时长为5min。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(4)中，HgCl₂水溶液的消毒时长为20min。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：湿润河沙的湿度为15％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：湿润河沙的湿度为35％。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(4)种子无菌处理为：将步骤(3)获得的洁净种子，立即用无菌水冲洗3～4次，用体积分数为75％的乙醇水溶液消毒10s后，用无菌水冲洗3～4次，接着用3wt％的NaClO水溶液消毒10min，立即用无菌水冲洗6～7次，最后用0.1wt％的HgCl₂水溶液消毒10min，立即用无菌水冲洗6～7次，转移至无菌滤纸或纱布上晾干。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(4)种子无菌处理为：将步骤(3)获得的洁净种子，用无菌水冲洗3～4次，用体积分数为75％的乙醇水溶液消毒10s后，立即用无菌水冲洗3～4次，转移至无菌滤纸或纱布上晾干。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，不包括湿沙处理步骤，直接将浸种所得种子进行无菌处理和萌发培养。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，不包括浸种步骤，直接将预处理所得种子进行湿沙处理。

性能测试：

污染率＝污染种子数/接种数×100％；

萌发率＝萌发种子数/接种数×100％；

移栽成活率＝成活苗数/移栽苗数×100％。

不同处理下种子污染及萌发情况如表1所示，从表1可知，本发明方法可以使储藏5～6个月后的种子的组培污染率降低到0～0.3％，种子萌发率提高到41.3％。实施例3中在实施例1的基础上进一步延长HgCl₂水溶液的消毒时间，尽管可以保持低污染率，但是种子萌发率低有明显降低，说明HgCl₂水溶液消毒时间过久可使种子萌发受到不利影响。实施例4和5中，对实施例1中的湿沙的湿度进行了调整，发现种子萌发率均有明显下降，说明湿沙的湿度对于种子的萌发具有较大的影响，当湿沙湿度保持在23～27％时促进种子萌发的效果最佳。湿度过低，则会种子休眠解除减慢，萌发延迟；湿度过高，则会种子呼吸受到抑制，降低萌发率。

相比实施例1，对比例1中，调整了HgCl₂水溶液和NaClO水溶液的消毒顺序，发现种子的污染率明显增加。由此可知，在本发明中，各消毒剂是在特定的浓度、时间下，以特定的消毒顺序才实现了良好的消毒效果。对比例2中，仅仅用75％乙醇进行种子的消毒，消毒效果不明显。对比例3和4中，相比实施例1，分别缺少了湿沙堆积步骤和浸种步骤，种子萌发率均有明显下降，可见在本发明中，浸种步骤和湿沙堆积两者的配合对于促进种子萌发十分关键。

表1不同处理下种子污染及萌发情况

取实施例1以及未经浸种和湿沙处理的对照组的萌发种子，经培养得到种苗后进行移栽，在相同的条件下进行移栽培养，计算移栽成活率，结果如表2所示，本发明实施例1处理后的种子，培养成种苗质量更好，具有更好的移栽成活率。

表2移栽成活率

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种提高桃金娘种子组培萌发和降低污染率的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）种子预处理：将剥离后的桃金娘种子用杀菌溶液消毒，水清洗后干燥；

（2）浸种：将步骤（1）预处理后的种子依次用CaCl₂水溶液和赤霉素水溶液浸泡，水清洗后干燥；

（3）湿沙处理：将步骤（2）所得浸种后的种子与湿润河沙混合，于0~8℃下进行堆积；

（4）种子无菌处理：将步骤（3）所得湿沙处理后的种子用水清洗，依次用乙醇水溶液、氯化汞水溶液和次氯酸钠水溶液消毒，每次消毒后用水清洗；

（5）萌发培养：将步骤（4）所得无菌处理后的种子干燥，置于培养基中培养；所述桃金娘种子为从桃金娘干果中剥离所得种子；所述桃金娘干果为采摘后储藏5~6个月后的桃金娘干果；

步骤（3）中，湿润河沙的湿度为23~27%；

步骤（4）中，所述乙醇水溶液的体积分数为73~77%，乙醇水溶液消毒的时长为8~12s；所述氯化汞水溶液的质量浓度为0.08~0.1%，氯化汞水溶液消毒的时长为8~12min；所述次氯酸钠水溶液的质量浓度为2~4%，次氯酸钠水溶液消毒的时长为8~12min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CaCl₂水溶液的浓度为300~500mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述乙醇水溶液的体积分数为75%，乙醇水溶液消毒的时长为10s；所述氯化汞水溶液的质量浓度为0.1%，氯化汞水溶液消毒的时长为10min；所述次氯酸钠水溶液的质量浓度为3%，次氯酸钠水溶液消毒的时长为10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述湿润河沙的粒径为1~3mm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述堆积的时长为35~45天，每8~12天翻动一次种子。

6.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述赤霉素水溶液的浓度为300~700mg/L。

7.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述培养基为MS复合培养基、1/2MS复合培养基或无菌水浸泡的无菌纱布；

所述MS复合培养基包括以下组分：MS培养基、0.8~1.2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.4~0.6mg/L激动素和30~50mg/L 赤霉素；

所述1/2MS复合培养基包括以下组分：1/2MS培养基、0.8~1.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.4~0.6mg/L激动素和30~50mg/L赤霉素。

8.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述杀菌溶液为4~6wt% CuSO₄水溶液，杀菌溶液消毒的时间为25~35min。

9.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述浸泡为避光4~6℃浸泡；步骤（5）中所述培养的温度为25~28℃。

10.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述剥离为人工徒手剥离；步骤（4）的无菌处理操作和步骤（5）的萌发培养操作均在无菌环境下进行。

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