CN111903530A - 一种白芨的组培育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白芨的组培育苗方法,①种子的采收；②种子的处理，先将白芨种子置于乙烯溶液中浸泡25～30h，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡20～30min,最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.1～0.2wt%的升汞中，振荡灭菌5～10min，再用无菌水清洗5遍以上；③增殖培养：将白芨种子接种到增殖培养基中培养得到一代白芨苗；④继代培养:将一代白芨苗分株后的单苗接种到继代培养基中得到二代白芨苗；⑤驯化培养：将二代白芨苗在自然光照下炼苗5～7天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，置入培养室内的驯化基质中进行培养。本发明容易操作、成本低,既能提高增殖系数及生根率，又能缩短培养周期、提高组培苗的质量。

Description

一种白芨的组培育苗方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种白芨的组培育苗方法。

背景技术

白芨是兰科属于白芨，又名连及草、甘根、白给、箬兰、朱兰、紫兰、紫蕙、百笠。多年生草本球根植物(块根)，植株高18～60厘米。主要分布在中国、日本以及缅甸北部。主要花期在春季，但依各地气候之不同，晚冬至夏初都可能开花。白芨有广泛的药用价值及园林价值，主要用于收敛止血，消肿生肌。花有紫红、白、蓝、黄和粉等色，可盆栽室内观赏，亦可点缀于较为荫蔽的花台、花境或庭院一角。白芨具有的药理作用如下：止血作用、保护胃粘膜、抗菌、抗真菌作用、抗癌及防癌作用，其白芨药用价值及高。白芨花色艳丽，出入药外，其也是一种很好的景观植物，所以市场对白芨的需求十分旺盛。由于市场需求的扩大，近年来我国大部分地区的野生白芨遭到过度采挖，导致其野生自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一。

目前，白芨的繁殖方法主要有分株繁殖、播种繁殖和组织培养的方式。分株繁殖，是指春季新叶萌发前或秋冬地上部枯萎后，掘起老株，分割假鳞茎进行分植，每株可分3～5株，须带顶芽。传统栽培主要依靠分株繁殖，但分株繁殖周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，很难满足大量 培的需要；播种繁殖，由于白芨的种子非常细小且无胚乳，在自然状况下很难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，且需要进行严格且繁琐的苗期管理、耗费大量的人力。导致育苗成本好高，成苗率却极不稳定，组织培养虽能在较短的获得大量的植株培育，但是由于现有的组织培养织培养程序一般为:选取种子做外植体、诱导形成原球茎、原球茎大量增殖、分化出小植株、生根壮苗和温室移栽，采用这样培养方式繁殖出的种苗变异较多，种苗生长不一致，且由于白芨品种在习性上有其自身的特点，在对白芨种子外植体进行组培时，采用现有的外植体消毒方式、采用普通的培养基进行组培，仍不能取得满意的组培效果，致使繁殖周期长，增值率低，所得组培苗的质量不好，移栽后存在成活率低的情况。因此，研制开发一种容易操作、成本低、既能提高增殖系数及生根率、又能缩短培养周期、提高组培苗质量的白芨的组培育苗方法是客观需要的。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种容易操作、成本低，既能提高增殖系数及生根率、又能缩短培养周期、提高组培苗质量的白芨的组培育苗方法。

本发明所述的一种白芨的组培育苗方法,包括以下步骤：

①种子的采收:采收成熟的白芨种子,用手轻轻搓除果皮后,再采用重力法将干瘪的种子除去后得到合格的白芨种子；

②种子的处理，先将步骤①得到的白芨种子置于乙烯溶液中浸泡25～30h，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡20～30min,所述消毒液由以下重量份的原料组成:甘草酸1～2份、石榴皮提取物2～3份、鱼腥草提取物0.8～1.5份、乳化剂3～5份、酵母菌0.2～0.5份和无菌水150～200份，之后再将白芨种子从消毒液中滤出，并置于纱布中，在湿度为30～50%的条件下静置放置30～40h，最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.1～0.2wt%的升汞中，振荡灭菌5～10min，再用无菌水清洗5遍以上；

③增殖培养：向组培瓶中盛放5～6cm厚的增殖培养基，所述增殖培养基包括硝酸钙0.5～0.6g、18～25mg/L蔗糖、3～6g/L植物凝胶、2～3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1～0.2g/L和1～1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后将经步骤②处理的白芨种子接种到增殖培养基中，并密闭组培瓶，于温度为22～25℃、湿度为40～50%、光照为6000～7000LX的条件下培养至白芨种子长出芽孢，种苗长至2～3cm，培养得到一代白芨苗；

④继代培养: 向另外一组组培瓶中盛放5～6cm厚的继代培养基，所述继代培养基包括硝酸钙0.5～0.6g、18～25mg/L蔗糖、3～6g/L植物凝胶、2～3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1～0.2g/L和1～1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后同时将经步骤③培养得到的一代白芨苗从增殖培养基中剥离后分隔成单苗，并将单苗的部分叶片或全部叶片切除，接着将单苗用无菌水冲洗后，再将单苗接种到另一组组培瓶中的继代培养基中，密闭组培瓶后于温度为24～28℃、湿度为45～55%、光照为6500～8000LX的条件下培养至单苗增长至原来的3～5倍，苗高至6～8cm后得到二代白芨苗；

⑤驯化培养：将装有二代白芨苗的培养瓶转至自然光照下炼苗5～7天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，将二代白芨苗分株后置入培养室内的驯化基质中进行培养，培养室内的温度控制在24～28℃、湿度控制在60～70%、遮光率控制在70%以上。

进一步的，在步骤②中，所述乙烯溶液是按照每升无菌水中加入800～1200uL乙烯后混合制得。

进一步的，在步骤②中，所述鱼腥草提取物的提取方法为：将新鲜鱼腥草用6～10倍量的水煎煮2次，每次1.5～2h，合并提取液，过滤浓缩至干得到鱼腥草提取物。

进一步的，所述石榴皮提取物的制备方法是：先将石榴皮烘干，制成石榴粉，再按照固液比为1～2g:50～60mL体积浓度为60～70％的乙醇加热回流提取二次，过滤，减压回收乙醇，减压浓缩得醇提物,之后加水配制成浓度为8～10mg/mL、pH值为5.5～6.5的醇提物溶液，上大孔吸附树脂柱，加水洗涤，然后用体积浓度为 40～50％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得流浸膏，真空干燥即得石榴皮提取物。

进一步的，在步骤③和步骤④中，所述黄秋葵汁的制备方法是：先将黄秋葵洗净表皮后用打浆机打成浆状，再用纱布过滤，所得滤液即为黄秋葵汁。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

一是本发明对种子的消毒方式严谨、科学，消毒处理前，先利用乙烯溶液对种子进行浸泡，乙烯溶液是一种植物内源激素，白芨种子在休眠阶段脱落酸含量增加，适量的乙烯溶液能够促使脱落酸含量降低，打破白芨种子的休眠期，消毒时采用专用的消毒液浸泡，该该消毒液是由甘草酸、石榴皮提取物、鱼腥草提取物、酵母菌、乳化剂和无菌水制成，其中石榴皮提取物和鱼腥草提取物均具有良好的杀菌抗病毒的作用，两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足外植体消毒的需要，且加入少量的甘草酸配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果，酵母菌可以增加消毒液的活性成分，进而大大降低外白芨种子的损伤率和降低接种的污染率，消毒后再进行后续的灭菌处理，能够彻底的避免种子污染的情况；

二是本发明增殖培养和诱导培养采用相同的培养基，可以降低组织培养的成本，培养基中含有适宜种子发芽的营养成分和生长激素，采用本发明制成的培养基进行增殖培养，白芨种子5天左右即可观察到萌发，且萌发率高达91.2％以上，10天左右便可观察到长有2～3片叶子的一代白芨苗，这时，可将一代白芨苗诱导培养， 7～8天便可观察到一代白芨苗长成有5～6片的植株，为了使一代白芨苗生长更健壮，在继续进行诱导培养至二代白芨苗的苗高长至6～8cm后，再进行驯化炼苗，炼苗1个月后即可得到生长健壮的实生苗，这样的培养基配方不仅可以显著提高白芨种子的诱导分化率、增殖系数及生根率，而且了缩短培养周期，提高蕙兰组培苗的质量，另外还能节约大量的人力、物力、财力，带来良好的经济效益，具有较好的推广利用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例1所述的白芨的组培育苗方法,包括以下步骤：

①种子的采收:采收成熟的白芨种子,用手轻轻搓除果皮后,再采用重力法将干瘪的种子除去后得到合格的白芨种子；

②种子的处理，先将步骤①得到的白芨种子置于乙烯溶液中浸泡30h，所述乙烯溶液是按照每升无菌水中加入1200uL乙烯后混合制得，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡20～30min,所述消毒液由以下重量份的原料组成:甘草酸2份、石榴皮提取物3份、鱼腥草提取物1.5份、乳化剂5份、酵母菌0.5份和无菌水200份，之后再将白芨种子从消毒液中滤出，并置于纱布中，在湿度为50%的条件下静置放置40h，最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.2wt%的升汞中，振荡灭菌10min，再用无菌水清洗5遍以上；

在对种子处理的过程中，先利用乙烯溶液对种子进行浸泡，乙烯溶液是一种植物内源激素，白芨种子在休眠阶段脱落酸含量增加，适量的乙烯溶液能够促使脱落酸含量降低，打破白芨种子的休眠期，消毒时采用专用的消毒液浸泡，该该消毒液是由甘草酸、石榴皮提取物、鱼腥草提取物、酵母菌、乳化剂和无菌水制成，其中石榴皮提取物和鱼腥草提取物均具有良好的杀菌抗病毒的作用，两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足外植体消毒的需要，且加入少量的甘草酸配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果，酵母菌可以增加消毒液的活性成分，进而大大降低外白芨种子的损伤率和降低接种的污染率，消毒后再进行后续的灭菌处理，能够彻底的避免种子污染的情况；

所述鱼腥草提取物的提取方法为：将新鲜鱼腥草用10倍量的水煎煮2次，每次2h，合并提取液，过滤浓缩至干得到鱼腥草提取物；

所述石榴皮提取物的制备方法是：先将石榴皮烘干，制成石榴粉，再按照固液比为1g:50mL体积浓度为60％的乙醇加热回流提取二次，过滤，减压回收乙醇，减压浓缩得醇提物,之后加水配制成浓度为8mg/mL、pH值为5.5的醇提物溶液，上大孔吸附树脂柱，加水洗涤，然后用体积浓度为 40％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得流浸膏，真空干燥即得石榴皮提取物；

③增殖培养：向组培瓶中盛放5cm厚的增殖培养基，所述增殖培养基包括硝酸钙0.5g、18mg/L蔗糖、3g/L植物凝胶、2g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1g/L和1mg/L激素ZT，高温灭菌后将经步骤②处理的白芨种子接种到增殖培养基中，并密闭组培瓶，于温度为22℃、湿度为40%、光照为6000LX的条件下培养至白芨种子长出芽孢，种苗长至2cm，培养得到一代白芨苗；

④继代培养: 向另外一组组培瓶中盛放5cm厚的继代培养基，所述继代培养基包括硝酸钙0.5g、18mg/L蔗糖、3g/L植物凝胶、2g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1g/L和1mg/L激素ZT，高温灭菌后同时将经步骤③培养得到的一代白芨苗从增殖培养基中剥离后分隔成单苗，并将单苗的部分叶片或全部叶片切除，接着将单苗用无菌水冲洗后，再将单苗接种到另一组组培瓶中的继代培养基中，密闭组培瓶后于温度为24℃、湿度为45%、光照为6500LX的条件下培养至单苗增长至原来的3倍，苗高至6cm后得到二代白芨苗；

增殖培养基和诱导培养基的成分相同，其各组分的作用机理如下：

硝酸钙：硝酸钙一是能同时给作物提供水溶性的硝态氮和速效钙，由于钙是细胞壁和细胞质膜的重要组成部分，可防止细胞液外渗，硝酸钙对于增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用。硝酸钙增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用，二是与其它常规不能完全溶于水的钙肥相比，品质较好纯度较高的硝酸钙它能完全水溶，吸收快，能迅速被植物吸收，三是迅速缓解各种作物的缺钙症状，如某些百合品种的叶烧、蕃茄的脐腐病、苹果的苦痘病、大白菜的心腐病等，四是适用作物吸收营养高峰期，如结果期和生长中后期，适用于磷素含量高导致有效钙含量较低的土壤，硝酸钙可利于提高产量和改善品质；

激素ZT：玉米素是植物激素的一种，是从玉米嫩籽中分离出的一种存在于高等植物中的天然细胞分裂素。它是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素，已能人工合成。

蔗糖：需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。

植物凝胶：凝固剂，是植物组织培养过程中用来凝固培养基的物质，其自身一般不具有营养，作为固体支持物而存在。

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秋葵汁的营养丰富，幼果中含有大量的粘滑汁液，具有特殊的香味；其汁液中混有果胶，牛乳聚糖及阿 拉聚糖等，它的果胶为可溶性纤维，在现代保健新观念中极为重视，凡经常食用它有健胃肠，滋补阴阳之功效，据测定每百克嫩果中含蛋白质2.5克、脂肪0.1克、糖类2.7克，纤维素 A660国际单位；维生素B1，0.2毫克、维生素B20.06毫克、维生素44毫克、钙81毫克、磷63毫 克、铁0.8毫克，所述黄秋葵汁的制备方法是：先将黄秋葵洗净表皮后用打浆机打成浆状，再用纱布过滤，所得滤液即为黄秋葵汁；

秋葵汁、硝酸钙、蔗糖和WPM粉末、激素ZT、植物凝胶一起作用，可以显著提高白芨种子的诱导分化率、、增殖系数及生根率，缩短培养周期，并提组培苗的质量；

⑤驯化培养：将装有二代白芨苗的培养瓶转至自然光照下炼苗5天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，将二代白芨苗分株后置入培养室内的驯化基质中进行培养，培养室内的温度控制在24℃、湿度控制在60%、遮光率控制在70%以上。

采用本实施例1的技术进行增殖培养，白芨种子5天左右即可观察到萌发，且萌发率高达91.2％以上，10天左右便可观察到长有2～3片叶子的一代白芨苗，这时，可将一代白芨苗诱导培养， 7～8天便可观察到一代白芨苗长成有5～6片的植株，为了使一代白芨苗生长更健壮，在继续进行诱导培养至二代白芨苗的苗高长至6～8cm后，再进行驯化炼苗，炼苗1个月后即可得到生长健壮的实生苗。

实施例2：

本实施例2所述的白芨的组培育苗方法,包括以下步骤：

①种子的采收:采收成熟的白芨种子,用手轻轻搓除果皮后,再采用重力法将干瘪的种子除去后得到合格的白芨种子；

②种子的处理，先将步骤①得到的白芨种子置于乙烯溶液中浸泡28h，所述乙烯溶液是按照每升无菌水中加入1000uL乙烯后混合制得，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡25min,所述消毒液由以下重量份的原料组成:甘草酸1.5份、石榴皮提取物2.5份、鱼腥草提取物1.2份、乳化剂4份、酵母菌1.3份和无菌水180份，之后再将白芨种子从消毒液中滤出，并置于纱布中，在湿度为40%的条件下静置放置35h，最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.15wt%的升汞中，振荡灭菌8min，再用无菌水清洗5遍以上；

在对种子处理的过程中，先利用乙烯溶液对种子进行浸泡，乙烯溶液是一种植物内源激素，白芨种子在休眠阶段脱落酸含量增加，适量的乙烯溶液能够促使脱落酸含量降低，打破白芨种子的休眠期，消毒时采用专用的消毒液浸泡，该该消毒液是由甘草酸、石榴皮提取物、鱼腥草提取物、酵母菌、乳化剂和无菌水制成，其中石榴皮提取物和鱼腥草提取物均具有良好的杀菌抗病毒的作用，两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足外植体消毒的需要，且加入少量的甘草酸配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果，酵母菌可以增加消毒液的活性成分，进而大大降低外白芨种子的损伤率和降低接种的污染率，消毒后再进行后续的灭菌处理，能够彻底的避免种子污染的情况；

所述鱼腥草提取物的提取方法为：将新鲜鱼腥草用8倍量的水煎煮2次，每次1.8h，合并提取液，过滤浓缩至干得到鱼腥草提取物；

所述石榴皮提取物的制备方法是：先将石榴皮烘干，制成石榴粉，再按照固液比为1.5g:55mL体积浓度为65％的乙醇加热回流提取二次，过滤，减压回收乙醇，减压浓缩得醇提物,之后加水配制成浓度为9mg/mL、pH值为6的醇提物溶液，上大孔吸附树脂柱，加水洗涤，然后用体积浓度为 45％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得流浸膏，真空干燥即得石榴皮提取物；

③增殖培养：向组培瓶中盛放5.5cm厚的增殖培养基，所述增殖培养基包括硝酸钙0.55g、22mg/L蔗糖、4g/L植物凝胶、2.5g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.15g/L和1.1mg/L激素ZT，高温灭菌后将经步骤②处理的白芨种子接种到增殖培养基中，并密闭组培瓶，于温度为23℃、湿度为45%、光照为6500LX的条件下培养至白芨种子长出芽孢，种苗长至2.5cm，培养得到一代白芨苗；

④继代培养: 向另外一组组培瓶中盛放5～6cm厚的继代培养基，所述继代培养基包括硝酸钙0.55g、22mg/L蔗糖、4g/L植物凝胶、2.5g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.15g/L和1.1mg/L激素ZT，高温灭菌后同时将经步骤③培养得到的一代白芨苗从增殖培养基中剥离后分隔成单苗，并将单苗的部分叶片或全部叶片切除，接着将单苗用无菌水冲洗后，再将单苗接种到另一组组培瓶中的继代培养基中，密闭组培瓶后于温度为26℃、湿度为50%、光照为7200LX的条件下培养至单苗增长至原来的4倍，苗高至7cm后得到二代白芨苗；

增殖培养基和诱导培养基的成分相同，其各组分的作用机理如下：

硝酸钙：硝酸钙一是能同时给作物提供水溶性的硝态氮和速效钙，由于钙是细胞壁和细胞质膜的重要组成部分，可防止细胞液外渗，硝酸钙对于增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用。硝酸钙增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用，二是与其它常规不能完全溶于水的钙肥相比，品质较好纯度较高的硝酸钙它能完全水溶，吸收快，能迅速被植物吸收，三是迅速缓解各种作物的缺钙症状，如某些百合品种的叶烧、蕃茄的脐腐病、苹果的苦痘病、大白菜的心腐病等，四是适用作物吸收营养高峰期，如结果期和生长中后期，适用于磷素含量高导致有效钙含量较低的土壤，硝酸钙可利于提高产量和改善品质；

激素ZT：玉米素是植物激素的一种，是从玉米嫩籽中分离出的一种存在于高等植物中的天然细胞分裂素。它是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素，已能人工合成。

蔗糖：需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。

植物凝胶：凝固剂，是植物组织培养过程中用来凝固培养基的物质，其自身一般不具有营养，作为固体支持物而存在。

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秋葵汁的营养丰富，幼果中含有大量的粘滑汁液，具有特殊的香味；其汁液中混有果胶，牛乳聚糖及阿 拉聚糖等，它的果胶为可溶性纤维，在现代保健新观念中极为重视，凡经常食用它有健胃肠，滋补阴阳之功效，据测定每百克嫩果中含蛋白质2.5克、脂肪0.1克、糖类2.7克，纤维素 A660国际单位；维生素B1，0.2毫克、维生素B20.06毫克、维生素44毫克、钙81毫克、磷63毫 克、铁0.8毫克，所述黄秋葵汁的制备方法是：先将黄秋葵洗净表皮后用打浆机打成浆状，再用纱布过滤，所得滤液即为黄秋葵汁；

秋葵汁、硝酸钙、蔗糖和WPM粉末、激素ZT、植物凝胶一起作用，可以显著提高白芨种子的诱导分化率、、增殖系数及生根率，缩短培养周期，并提组培苗的质量；

⑤驯化培养：将装有二代白芨苗的培养瓶转至自然光照下炼苗6天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，将二代白芨苗分株后置入培养室内的驯化基质中进行培养，培养室内的温度控制在26℃、湿度控制在65%、遮光率控制在70%以上。

采用本实施例2的技术进行增殖培养，白芨种子5天左右即可观察到萌发，且萌发率高达93.4％以上，10天左右便可观察到长有2～3片叶子的一代白芨苗，这时，可将一代白芨苗诱导培养， 7～8天便可观察到一代白芨苗长成有5～6片的植株，为了使一代白芨苗生长更健壮，在继续进行诱导培养至二代白芨苗的苗高长至6～8cm后，再进行驯化炼苗，炼苗1个月后即可得到生长健壮的实生苗。

实施例3：

本实施例3所述的白芨的组培育苗方法,包括以下步骤：

①种子的采收:采收成熟的白芨种子,用手轻轻搓除果皮后,再采用重力法将干瘪的种子除去后得到合格的白芨种子；

②种子的处理，先将步骤①得到的白芨种子置于乙烯溶液中浸泡30h，所述乙烯溶液是按照每升无菌水中加入1200uL乙烯后混合制得，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡30min,所述消毒液由以下重量份的原料组成:甘草酸2份、石榴皮提取物3份、鱼腥草提取物1.5份、乳化剂5份、酵母菌0.5份和无菌水200份，之后再将白芨种子从消毒液中滤出，并置于纱布中，在湿度为50%的条件下静置放置40h，最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.2wt%的升汞中，振荡灭菌10min，再用无菌水清洗5遍以上；

在对种子处理的过程中，先利用乙烯溶液对种子进行浸泡，乙烯溶液是一种植物内源激素，白芨种子在休眠阶段脱落酸含量增加，适量的乙烯溶液能够促使脱落酸含量降低，打破白芨种子的休眠期，消毒时采用专用的消毒液浸泡，该该消毒液是由甘草酸、石榴皮提取物、鱼腥草提取物、酵母菌、乳化剂和无菌水制成，其中石榴皮提取物和鱼腥草提取物均具有良好的杀菌抗病毒的作用，两者复合使用时消毒效果和杀菌谱均不能满足外植体消毒的需要，且加入少量的甘草酸配合可起到增效作用，能大大增加消毒的效果，酵母菌可以增加消毒液的活性成分，进而大大降低外白芨种子的损伤率和降低接种的污染率，消毒后再进行后续的灭菌处理，能够彻底的避免种子污染的情况；

所述鱼腥草提取物的提取方法为：将新鲜鱼腥草用10倍量的水煎煮2次，每次2h，合并提取液，过滤浓缩至干得到鱼腥草提取物；

所述石榴皮提取物的制备方法是：先将石榴皮烘干，制成石榴粉，再按照固液比为2g:60mL体积浓度为70％的乙醇加热回流提取二次，过滤，减压回收乙醇，减压浓缩得醇提物,之后加水配制成浓度为10mg/mL、pH值为6.5的醇提物溶液，上大孔吸附树脂柱，加水洗涤，然后用体积浓度为50％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得流浸膏，真空干燥即得石榴皮提取物；

③增殖培养：向组培瓶中盛放6cm厚的增殖培养基，所述增殖培养基包括硝酸钙0.6g、25mg/L蔗糖、6g/L植物凝胶、3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.2g/L和1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后将经步骤②处理的白芨种子接种到增殖培养基中，并密闭组培瓶，于温度为25℃、湿度为50%、光照为7000LX的条件下培养至白芨种子长出芽孢，种苗长至3cm，培养得到一代白芨苗；

④继代培养: 向另外一组组培瓶中盛放6cm厚的继代培养基，所述继代培养基包括硝酸钙0.6g、25mg/L蔗糖、6g/L植物凝胶、3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.2g/L和1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后同时将经步骤③培养得到的一代白芨苗从增殖培养基中剥离后分隔成单苗，并将单苗的部分叶片或全部叶片切除，接着将单苗用无菌水冲洗后，再将单苗接种到另一组组培瓶中的继代培养基中，密闭组培瓶后于温度为28℃、湿度为55%、光照为8000LX的条件下培养至单苗增长至原来的5倍，苗高至8cm后得到二代白芨苗；

增殖培养基和诱导培养基的成分相同，其各组分的作用机理如下：

硝酸钙：硝酸钙一是能同时给作物提供水溶性的硝态氮和速效钙，由于钙是细胞壁和细胞质膜的重要组成部分，可防止细胞液外渗，硝酸钙对于增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用。硝酸钙增强植株的抗逆性和提高果实的风味有很明显的作用，二是与其它常规不能完全溶于水的钙肥相比，品质较好纯度较高的硝酸钙它能完全水溶，吸收快，能迅速被植物吸收，三是迅速缓解各种作物的缺钙症状，如某些百合品种的叶烧、蕃茄的脐腐病、苹果的苦痘病、大白菜的心腐病等，四是适用作物吸收营养高峰期，如结果期和生长中后期，适用于磷素含量高导致有效钙含量较低的土壤，硝酸钙可利于提高产量和改善品质；

激素ZT：玉米素是植物激素的一种，是从玉米嫩籽中分离出的一种存在于高等植物中的天然细胞分裂素。它是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素，已能人工合成。

蔗糖：需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。

植物凝胶：凝固剂，是植物组织培养过程中用来凝固培养基的物质，其自身一般不具有营养，作为固体支持物而存在。

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秋葵汁的营养丰富，幼果中含有大量的粘滑汁液，具有特殊的香味；其汁液中混有果胶，牛乳聚糖及阿 拉聚糖等，它的果胶为可溶性纤维，在现代保健新观念中极为重视，凡经常食用它有健胃肠，滋补阴阳之功效，据测定每百克嫩果中含蛋白质2.5克、脂肪0.1克、糖类2.7克，纤维素 A660国际单位；维生素B1，0.2毫克、维生素B20.06毫克、维生素44毫克、钙81毫克、磷63毫 克、铁0.8毫克，所述黄秋葵汁的制备方法是：先将黄秋葵洗净表皮后用打浆机打成浆状，再用纱布过滤，所得滤液即为黄秋葵汁；

秋葵汁、硝酸钙、蔗糖和WPM粉末、激素ZT、植物凝胶一起作用，可以显著提高白芨种子的诱导分化率、、增殖系数及生根率，缩短培养周期，并提组培苗的质量；

⑤驯化培养：将装有二代白芨苗的培养瓶转至自然光照下炼苗7天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，将二代白芨苗分株后置入培养室内的驯化基质中进行培养，培养室内的温度控制在28℃、湿度控制在70%、遮光率控制在70%以上。

采用本实施例1的技术进行增殖培养，白芨种子5天左右即可观察到萌发，且萌发率高达92.6.2％以上，10天左右便可观察到长有2～3片叶子的一代白芨苗，这时，可将一代白芨苗诱导培养， 7～8天便可观察到一代白芨苗长成有5～6片的植株，为了使一代白芨苗生长更健壮，在继续进行诱导培养至二代白芨苗的苗高长至6～8cm后，再进行驯化炼苗，炼苗1个月后即可得到生长健壮的实生苗。

Claims (5)

1.一种白芨的组培育苗方法,其特征在于:包括以下步骤：

①种子的采收:采收成熟的白芨种子,用手轻轻搓除果皮后,再采用重力法将干瘪的种子除去后得到合格的白芨种子；

②种子的处理，先将步骤①得到的白芨种子置于乙烯溶液中浸泡25～30h，接着将白芨种子转入消毒液中继续浸泡20～30min,所述消毒液由以下重量份的原料组成:甘草酸1～2份、石榴皮提取物2～3份、鱼腥草提取物0.8～1.5份、乳化剂3～5份、酵母菌0.2～0.5份和无菌水150～200份，之后再将白芨种子从消毒液中滤出，并置于纱布中，在湿度为30～50%的条件下静置放置30～40h，最后将白芨种子用无菌水清洗后，置于0.1～0.2wt%的升汞中，振荡灭菌5～10min，再用无菌水清洗5遍以上；

③增殖培养：向组培瓶中盛放5～6cm厚的增殖培养基，所述增殖培养基包括硝酸钙0.5～0.6g、18～25mg/L蔗糖、3～6g/L植物凝胶、2～3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1～0.2g/L和1～1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后将经步骤②处理的白芨种子接种到增殖培养基中，并密闭组培瓶，于温度为22～25℃、湿度为40～50%、光照为6000～7000LX的条件下培养至白芨种子长出芽孢，种苗长至2～3cm，培养得到一代白芨苗；

④继代培养: 向另外一组组培瓶中盛放5～6cm厚的继代培养基，所述继代培养基包括硝酸钙0.5～0.6g、18～25mg/L蔗糖、3～6g/L植物凝胶、2～3g/L WPM粉末、黄秋葵汁0.1～0.2g/L和1～1.2mg/L激素ZT，高温灭菌后同时将经步骤③培养得到的一代白芨苗从增殖培养基中剥离后分隔成单苗，并将单苗的部分叶片或全部叶片切除，接着将单苗用无菌水冲洗后，再将单苗接种到另一组组培瓶中的继代培养基中，密闭组培瓶后于温度为24～28℃、湿度为45～55%、光照为6500～8000LX的条件下培养至单苗增长至原来的3～5倍，苗高至6～8cm后得到二代白芨苗；

⑤驯化培养：将装有二代白芨苗的培养瓶转至自然光照下炼苗5～7天，接着将二代白芨苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部后，将二代白芨苗分株后置入培养室内的驯化基质中进行培养，培养室内的温度控制在24～28℃、湿度控制在60～70%、遮光率控制在70%以上。

2.根据权利要求1所述的一种白芨的组培育苗方法,其特征在于: 在步骤②中，所述乙烯溶液是按照每升无菌水中加入800～1200uL乙烯后混合制得。

3.根据权利要求1所述的一种白芨的组培育苗方法,其特征在于: 在步骤②中，所述鱼腥草提取物的提取方法为：将新鲜鱼腥草用6～10倍量的水煎煮2次，每次1.5～2h，合并提取液，过滤浓缩至干得到鱼腥草提取物。

4.根据权利要求1所述的一种白芨的组培育苗方法,其特征在于: 在步骤②中，所述石榴皮提取物的制备方法是：先将石榴皮烘干，制成石榴粉，再按照固液比为1～2g:50～60mL体积浓度为60～70％的乙醇加热回流提取二次，过滤，减压回收乙醇，减压浓缩得醇提物,之后加水配制成浓度为8～10mg/mL、pH值为5.5～6.5的醇提物溶液，上大孔吸附树脂柱，加水洗涤，然后用体积浓度为 40～50％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得流浸膏，真空干燥即得石榴皮提取物。

5.根据权利要求1所述的一种白芨的组培育苗方法,其特征在于: 在步骤③和步骤④中，所述黄秋葵汁的制备方法是：先将黄秋葵洗净表皮后用打浆机打成浆状，再用纱布过滤，所得滤液即为黄秋葵汁。