CN108207632A - 一种快速繁殖白芨的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速繁殖白芨的方法，包括以下步骤：1.选择成熟未开裂的蒴果无菌处理后，剥开取出种子，迅速接种在萌发培养基上；2.壮苗生根培养：选取长至1cm左右的植株，接种在培养基上，培养60～70天；3.试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，常温下炼苗3‑4天，洗净琼脂，用50％多菌灵浸泡，移栽基质中。本发明的快速繁殖白芨的方法，所用步骤少，能一次性成苗，对于建立工业化繁殖白芨体系有重大意义，不仅简化生产程序，提高效率，降低了成本，而且降低接种过程中所产生的污染率，相对提高生产效率。

Description

一种快速繁殖白芨的方法
技术领域
本发明属于药用植物栽培技术领域，涉及一种快速繁殖白芨的方法。
背景技术
白芨(Bletilla striata)为兰科白芨属多年生草本植物，白芨不仅具有较高观赏价值，也是我国常用的中药材之一(中国植物志，1999)。以干燥块茎入药，具有收敛止血、消肿生肌等功效(中国药典,2015)，此外，白芨茎中还含有较高的白芨胶，具有特殊的黏度特性，可作为增稠剂、混悬剂、保湿剂和助乳化剂等应用于化妆品中，具有良好的效果(刘光斌等，2005；马世宏等，2009)，使用范围广，需求量呈现不断上升态势。野生白芨因需求被过度采挖，导致其野生自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一，传统的人工栽培繁殖方式通常以分株法繁殖，繁殖系数低(黄泰康和孔令义,2002)。为保护白芨野生资源，人工繁育和栽培白芨成了研发人员大力研究方向，如白芨的无菌萌发与组织培养，但其分为使用了三种培养基培养各个阶段，且萌发和生根效率都有待于进一步提高。为得到更高的萌发率及更快速繁殖白芨，本发明从培养基的优化及一次性成苗的方法研究中，利用植物组织培养技术探讨快速繁殖白芨种苗的有效方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速繁殖白芨的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种快速繁殖白芨的方法，包括以下步骤：
(1)种子无菌萌发：将未开裂成熟白芨蒴果无菌处理，从蒴果中部剥开，取出种子，迅速接种在萌发培养基上；培养条件：培养温度24～26℃,光照强度1500～2000Lx，光照时间10h·d-1；萌发培养基为：MS+6-BA1～1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8；
(2)壮苗生根培养：将步骤(1)中长至1cm左右的植株，接种在MS+NAA1.5mg/L+IBA0～0.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8的培养基上；培养条件：培养温度24～26℃，光照强度1500～2000Lx，光照时间10h·d-1；
(3)试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，常温下炼苗3-4天，洗净琼脂，用50％多菌灵浸泡，移栽基质中，保持遮光率为80％，土壤水分60～70％。
进一步，所述萌发培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
进一步，所述萌发培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
进一步，步骤(2)中培养基为：MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
进一步，步骤(2)中培养基为：MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥100g/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
以上任一项所述的快速繁殖白芨的方法，所述无菌处理为用洗洁精水清洗蒴果表面，水冲洗干净，无菌环境下，75％酒精的浸泡30～60S，无菌水冲洗3-4遍，用0.1％升汞灭菌8min，再用无菌水冲洗7-8遍，用无菌纸吸干蒴果表面水分。
本发明的有益效果在于：1.本发明的快速繁殖白芨的方法，所用步骤少，能一次性成苗，即用2种培养基便完成种子萌发、诱导、壮苗、生根的培养；这对于建立工业化繁殖白芨体系有重大意义，一次性成苗不仅简化生产程序，提高效率，尽量避免萌发、诱导、壮苗、生根4个培养过程中使用不同的培养基，降低了成本，而且降低接种过程中所产生的污染率，相对提高生产效率。2.通过对萌发培养基的优化调整，加速无菌萌发的时间，10d就开始种子就开始萌发，到20天统计时基本都萌发到1cm以上，且萌发率高达96.9％。3.进一步优化条件壮苗生根的培养基，使得所培养的试管苗植株的生根率较好、植株高度叫高、假鳞茎直径较大、单株须根较多。最好的生根率能达到97.9％，且诱导出来的根长势较好，植株的健壮度也很好，对下一步的移栽打下坚实的基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例2中使用5号萌发培养基接种后10天种子萌发状态；
图2为实施例2中使用5号萌发培养基接种后20天种子萌发状态；
图3为实施例3中使用7号培养基繁殖的白芨苗；
图4为实施例3中使用7号培养基繁殖的白芨苗植株高度测量图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料：白芨种子，取自贵州黔康生态科技农业发展有限公司白芨种植基地。
实施例1
快速繁殖白芨的方法：
(1)种子无菌萌发：挑选未开裂成熟的白芨蒴果，用洗洁精水清洗蒴果表面，自来水冲洗干净，在超净工作台上，75％酒精的浸泡30S，无菌水冲洗3-4遍，用0.1％升汞灭菌8min，再用无菌水冲洗7-8遍，用无菌纸吸干蒴果表面水分，从蒴果中部剥开，取出种子，迅速接种在萌发培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种4个团块，定期观察记录，20d后分析统计结果；培养条件：培养温度(25±1)℃,光照强度2000Lx，光照时间10h·d-1；萌发培养基为：MS+6-BA 1mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.8。
(2)壮苗生根培养：将步骤(1)中长至1cm左右的植株，接种在MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥60g/L+AC0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.8的培养基上；每个处理接种10瓶，每瓶接种20苗，定期观察记录，70d后分析统计试验结果。培养条件：培养温度25±1℃,光照强度2000Lx，光照时间10h·d-1；
(3)试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，置于常温条件下的室内，炼苗3-4天，打开瓶盖，将苗拿出洗净琼脂，用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡30min，移栽于配制好的基质中，起小拱棚，搭上遮光率为80％的遮阳网，保持土壤水分60％。
由此实施例得到试验结果统计计算萌发率为48.2％。
实施例2
快速繁殖白芨的方法：
(1)种子无菌萌发：挑选未开裂成熟的白芨蒴果，用洗洁精水清洗蒴果表面，自来水冲洗干净，在超净工作台上，75％酒精的浸泡30S，无菌水冲洗3-4遍，用0.1％升汞灭菌8min，再用无菌水冲洗7-8遍，用无菌纸吸干蒴果表面水分，从蒴果中部剥开，取出种子，迅速接种在萌发培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种4个团块，定期观察记录，20d后分析统计结果；培养条件：培养温度(25±1)℃,光照强度1800Lx，光照时间10h·d-1；萌发培养基为：MS+6-BA1mg/L+NAA0.8mg/L+AC0.3g/L+脯氨酸0g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.8。
(2)壮苗生根培养：将步骤(1)中长至1cm左右的植株，接种在MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥100g/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8的培养基上；每个处理接种10瓶，每瓶接种20苗，定期观察记录，70d后分析统计试验结果。培养条件：培养温度25±1℃,光照强度1800Lx，光照时间10h·d-1；
(3)试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，置于常温条件下的室内，炼苗3-4天，打开瓶盖，将苗拿出洗净琼脂，用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡30min，移栽于配制好的基质中，起小拱棚，搭上遮光率为80％的遮阳网，保持土壤水分70％。
与实施例2基本相同，步骤(1)中种子萌发阶段以表1所列培养基组合进行试验统计，最后以萌发率来考察培养基的优劣，未标明的组分同实施例2，其余步骤不再赘述。
表1白芨种子萌发培养基筛选表
如图1所示，萌发培养基编号5接种10d左右，种子就开始萌发，如图2所示，20d后大部分都已经萌发，统计结果计算萌发率见表1。
由表1可以看出白芨种子高效萌发培养基为：MS+6-BA1～1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8；优选的为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8；更优选的为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
实施例3
快速繁殖白芨的方法：
(1)种子无菌萌发：挑选未开裂成熟的白芨蒴果，用洗洁精水清洗蒴果表面，自来水冲洗干净，在超净工作台上，75％酒精的浸泡30S，无菌水冲洗3-4遍，用0.1％升汞灭菌8～10min，再用无菌水冲洗7-8遍，用无菌纸吸干蒴果表面水分，从蒴果中部剥开，取出种子，迅速接种在萌发培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶接种4个团块，定期观察记录，20d后分析统计结果；培养条件：培养温度25±1℃,光照强度1500Lx，光照时间10h·d-1；萌发培养基为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.8。
(2)壮苗生根培养：将步骤(1)中长至1cm左右的植株，接种在MS+NAA1mg/L+IBA0g/L+香蕉泥0g/L+AC 0g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.8的培养基上(培养基编号为1)；每个处理接种10瓶，每瓶接种20苗，定期观察记录，70d后分析统计试验结果。培养条件：培养温度25±1℃,光照强度1500Lx，光照时间10h·d-1；
(3)试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，置于常温条件下的室内，炼苗3-4天，打开瓶盖，将苗拿出洗净琼脂，用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡30min，移栽于配制好的基质中，起小拱棚，搭上遮光率为80％的遮阳网，保持土壤水分60％左右。
与实施例3基本相同，步骤(2)中壮苗生根培养阶段以表2所列培养基组合进行试验统计，最后以生根率、植株高度、假鳞茎直径、单株须根数来考察培养基的优劣，未标明的组分同实施例3，其余步骤不再赘述。
表2白芨壮苗生根培养基筛选表
表2中的生根率、苗高、假鳞茎直径、须根数的数据为10瓶数据平均值,其健壮度从差到好用“+”、“++”、“+++”、“++++”级表示。
由表2可以看出其中7号培养基，生根率达到97.9％，诱导出来的根长势很好，须根数最低达8条以上，平均能达13条以上，为后续的植株移栽及其提高成活率打下坚实基础，实施例7中的白芨苗经步骤(3)驯化移栽后成活率达80％以上。如图3和图4所示，白芨植株高度最高达15.2cm、最低的也有10.6cm，且植株颜色偏绿；假鳞茎直径最低也达到0.52cm以上，植株健壮。所以快速繁殖白芨的壮苗生根培养阶段培养基为：MS+NAA1.5mg/L+IBA0～0.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8，优选的：MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8；更优选的MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥100g/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
本发明还对比过以1/2MS为基础的培养基，这对于一次性成苗的方法没有较好的效果。目前还有一些其他能有效激发白芨种子萌发的培养基，但其原球茎在培养60d后有一部分能长出了幼叶，同时很少数的原球茎则会继续长大但并不分化出幼叶，在同一培养基中，常存在不同发育时期的原球茎、芽和幼苗；这对下一步培养没法统一，还需要再换其他培养基进行丛生芽诱导增殖长出组培苗，如果应用于产业化生产有一定难度。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种快速繁殖白芨的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子无菌萌发：将未开裂成熟白芨蒴果无菌处理，从蒴果中部剥开，取出种子，迅速接种在萌发培养基上；培养条件：培养温度24～26℃,光照强度1500～2000Lx，光照时间10h·d-1；萌发培养基为：MS+6-BA1～1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8；
(2)壮苗生根培养：将步骤(1)中长至1cm左右的植株，接种在MS+NAA1.5mg/L+IBA 0～0.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8的培养基上；培养条件：培养温度24～26℃，光照强度1500～2000Lx，光照时间10h·d-1；
(3)试管苗驯化移栽：将长至10cm以上生根的试管苗，常温下炼苗3-4天，洗净琼脂，用50％多菌灵浸泡，移栽基质中，保持遮光率为80％，土壤水分60～70％。
2.根据权利要求1所述的快速繁殖白芨的方法，其特征在于，所述萌发培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5～0.8mg/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
3.根据权利要求2所述的快速繁殖白芨的方法，其特征在于，所述萌发培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
4.根据权利要求1所述的快速繁殖白芨的方法，其特征在于，步骤(2)中培养基为：MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥60～100g/L+AC0.3～0.5g/L+脯氨酸0.3～0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
5.根据权利要求4所述的快速繁殖白芨的方法，其特征在于，步骤(2)中培养基为：MS+NAA1.5mg/L+香蕉泥100g/L+AC0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L，pH5.6～5.8。
6.根据权利要求1～5任一项所述的快速繁殖白芨的方法，其特征在于，所述无菌处理为用洗洁精水清洗蒴果表面，水冲洗干净，无菌环境下，75％酒精的浸泡30～60S，无菌水冲洗3-4遍，用0.1％升汞灭菌8min，再用无菌水冲洗7-8遍，用无菌纸吸干蒴果表面水分。
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