CN106613952A - 一种芦蒿脱毒苗的快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芦蒿脱毒苗的快繁方法，通过选取品种特性鲜明、健康芦蒿植株的中上部带节茎段作为外植体，经过腋芽诱导、脱毒培养、生根培养、移栽定植，最后形成完整的脱毒芦蒿种苗。本发明中芦蒿脱毒苗的繁殖速度快、脱毒效果好、脱毒种苗生长势强、遗传稳定性好，从外植体接种到形成可移栽试管苗，整个过程仅需90d左右，增殖系数可达20，解决了芦蒿生产中长期无性繁殖导致的种苗带病毒严重、产量品质下降的问题，实现了芦蒿脱毒苗快速繁殖，满足脱毒苗的规模化生产。

Description

一种芦蒿脱毒苗的快繁方法
技术领域
本发明涉及一种芦蒿脱毒种苗的快繁方法，具体涉及一种芦蒿带节茎段在离体条件下组织培养获得脱毒试管种苗的快繁方法，属于生物技术领域。
背景技术
芦蒿是菊科蒿属多年生草本植物，营养丰富、清香脆嫩，具有清凉、平抑肝火、祛风湿、消炎、镇咳等功效，另外对降血压、降血脂、缓解心血管疾病均有较好的食疗作用，是一种典型的保健蔬菜，开发前景广阔。目前生产上，芦蒿主要是通过茎秆扦插无性繁殖的方式进行芦蒿生产和种苗保留，且种苗以群众长期自繁为主，品种感染病毒退化严重，严重影响芦蒿产量与品质。
中国专利201410291953.8公开了一种甘薯脱毒苗的制备方法，将薯块晒种后与成熟的香蕉放在一起，然后将薯块栽种在培养箱中催芽，剥取茎尖，分别诱导不定芽的分化和体细胞胚胎发生，经继代培养、炼苗、移栽后获得脱毒苗。中国专利201310724001.6公开了一种山葵脱毒苗的培养方法，选用无菌的山葵芽体为培养材料，经变温处理后，取其芽分生组织接入丛生芽分化培养基中，再经壮苗培养基和生根培养基的诱导培养而获得山葵脱毒苗。上述专利分别获得了甘薯脱毒苗和山葵脱毒苗，但由于植物和病毒的不同难以直接应用于芦蒿。目前，尚未有芦蒿脱毒苗的培养方法的报道。开展芦蒿脱毒种苗快繁体系研究，不仅有利于芦蒿优质品种的提纯复壮，更为脱毒种苗工厂化生产和脱毒种苗的定期更新提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种能使芦蒿高效脱毒、恢复品种种性、快速繁殖和实现芦蒿种苗规模化供应的芦蒿脱毒苗的快繁方法，解决生产中长期通过无性繁殖保留种苗所导致的品种带毒退化的问题，为芦蒿生产提供优质脱毒种苗，提高芦蒿产量和品质。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种芦蒿脱毒苗的快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的准备：选取田间生长健壮、品种特征鲜明的芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段作为外植体；
(2)外植体的灭菌：将选取的带节茎段置于流水中冲洗10～20min后，无菌条件下，用75％的酒精浸泡30～60s，再用84消毒液灭菌5～10min，无菌水冲洗后接种在MS培养基中；
(3)腋芽的诱导分化：将灭菌后的外植体接种在6-BA浓度为1.0-1.5mg·l-1、NAA浓度为0.4-0.6mg·l-1的MS培养基中；
(4)脱毒培养：诱导培养基上萌发出的不定芽长到高6±1cm小苗时，将小苗取出，去除叶片，切成1.0～1.5cm茎段，接种在2,4-D浓度为1.0mg·l-1、KT浓度为0.2-0.4mg·l-1的MS培养基中；
(5)生根培养：经脱毒培养的小苗长到高10±1cm时，将小苗切成带1-2节的茎段转入6-BA浓度为0.5-1.0mg·l-1、NAA浓度为0.5-1.0mg·l-1、活性炭百分比为0.02％的MS培养基中；
(6)脱毒组培苗移栽：将根系浓密，植株健壮的试管苗，移到与外界温度相近的室内，放置5～6d后旋开瓶盖，于自然散射光下炼苗7～9d后，洗净根表面培养基，植于营养土中，并做好防雨和保温措施，苗移栽成活后，再栽入有防虫措施的大棚中，用于芦蒿种苗的生产。
步骤3～5中，培养室的培养条件为：温度为25±2℃，光照强度为1200-1500lx，每天光照12h。
所述的MS培养基的pH值为5.8，琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
本发明利用芦蒿带节茎段离体条件下经不定芽诱导、脱毒培养和生根培养等过程获得脱毒试管苗，从外植体接种到形成可移栽试管苗，整个过程仅需90d左右，增殖系数可达20，具有种苗繁殖系数高、繁殖速度快、脱毒效果好、生长势强、遗传稳定性好的特点，实现了芦蒿脱毒种苗快速繁殖，满足脱毒种苗的规模化生产。
附图说明
图1为培养9d后分化的腋芽。
图2为愈伤化的茎段。
图3为芦蒿脱毒苗(A)和未脱毒苗(B)。
图4为生根培养5d后的芦蒿脱毒苗(A)和生根培养30d后的芦蒿脱毒苗(B)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中利用昆明白芦蒿带节茎段离体培养条件下获得脱毒试管苗。
实施例1
1、试验培养基灭菌及培养条件
高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121℃灭菌20min。培养室温度为25℃，光照强度1300lx，每天光照12h/d。MS培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
2、无菌材料的处理
选取生长健壮的昆明白芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段，置于流水中冲洗10min后，置于超净工作台上，将芦蒿茎段先用75％的酒精浸泡30s，再用84消毒液灭菌5min，无菌水冲洗5次，然后接种在MS培养基中。
3、腋芽诱导
(1)带节茎段灭菌后接种在添加不同浓度的6-BA和0.2mg·l-1NAA组合的培养基中，每个处理接种20个茎段。设置4个处理：
①MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA0.2mg·l-1；
②MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.2mg·l-1；
③MS+6-BA1.5mg·l-1+NAA0.2mg·l-1；
④MS+6-BA2.0mg·l-1+NAA0.2mg·l-1
结果如表1所示，培养9d后各处理均有腋芽分化(图1)，其中以MS+6BA1.0mg·l-1+NAA0.2mg·l-1和MS+6BA1.5mg·l-1+NAA0.2mg·l-1腋芽分化率最高，达75％。部分茎段培养15d后表面愈伤化(图2)，愈伤化的茎段不再分化腋芽。
表1 不同6-BA浓度对腋芽诱导的影响
(2)带节茎段灭菌后接种在添加不同浓度的NAA和1.0mg·l-16-BA组合的培养基中，每个处理接种20个茎段。设置4个处理：
①MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.2mg·l-1；
②MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.4mg·l-1；
③MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.6mg·l-1；
④MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.8mg·l-1
表2 不同NAA浓度对腋芽诱导的影响
结果如表2所示，培养9d后各处理均有腋芽分化，其中以MS+6BA1.0mg·l-1+NAA0.4mg·l-1和MS+6BA1.0mg·l-1+NAA0.6mg·l-1腋芽分化率最高，达85％。
实施例2
1、试验培养基灭菌及培养条件
高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121℃灭菌20min。培养室温度为25℃，光照强度1300lx，每天光照12h/d。MS培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
2、无菌材料的处理
选取生长健壮的昆明白芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段，置于流水中冲洗10min后，置于超净工作台上，将芦蒿茎段先用75％的酒精浸泡30s，再用84消毒液灭菌5min，无菌水冲洗5次，然后接种在MS培养基中。
3、腋芽诱导
带节茎段灭菌后接种在MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.4mg·l-1的培养基中。
4、脱毒培养
腋芽分化后45d即可长成高度6～7cm的小苗，之后将小苗切成1.0～1.5cm茎段，去除叶片，接种在添加不同浓度的2,4-D和KT组合的培养基中，每个处理接种15个茎段。首先设置4个处理确定最优的2,4-D浓度：(①MS+2,4-D0.5mg·l-1+KT0.1mg·l-1；②MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.1mg·l-1；③MS+2,4-D1.5mg·l-1+KT0.1mg·l-1；④MS+2,4-D2.0mg·l-1+KT0.1mg·l-1)，然后设置4个处理确定最优的KT浓度：(①MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.2mg·l-1；②MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.4mg·l-1；③MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.6mg·l-1；④MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.8mg·l-1)
表3 不同2,4-D和KT浓度对脱毒苗生长的影响
结果表明，培养13d时不同处理有愈伤和腋芽分化，培养35d时，腋芽高度达6.8cm左右(图3A)，当KT浓度为0.2mg·l-1时，以2,4-D1.0mg·l-1的小苗株高最高，最为健壮；当2,4-D浓度为1.0mg·l-1时，KT浓度以0.2-0.4mg·l-1小苗株高最高，最为健壮。仅经过MS+6BA1.0mg·l-1+NAA0.2mg·l-1培养基分化出的腋芽，培养35d时腋芽高度仅为3.3cm左右(表1和图3B)，说明经脱毒培养后有效促进了芦蒿组培苗的生长。
实施例3
1、试验培养基灭菌及培养条件
高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121℃灭菌20min。培养室温度为25℃，光照强度1300lx，每天光照12h/d。MS培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
2、无菌材料的处理
选取生长健壮的昆明白芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段，置于流水中冲洗20min后，置于超净工作台上，将芦蒿茎段先用75％的酒精浸泡60s，再用84消毒液灭菌10min，无菌水冲洗5次，然后接种在MS培养基中。
3、腋芽诱导
带节茎段灭菌后接种在MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.4mg·l-1的培养基中。
4、脱毒培养
腋芽分化后45d即可长成高度6～7cm的小苗，之后将小苗切成1.0～1.5cm茎段，去除叶片，接种在MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.2mg·l-1培养基中。
5、生根及壮苗培养
将经脱毒培养长到10cm左右高度的小苗切成带2-3节的茎段转入添加不同浓度的6-BA和NAA生根培养基中(含0.02％活性炭)，每个处理接种15个茎段。首先设置4个处理确定最优的6-BA浓度：(①MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA0.5mg·l-1；②MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.5mg·l-1；③MS+6-BA1.5mg·l-1+NAA0.5mg·l-1；④MS+6-BA2.0mg·l-1+NAA0.5mg·l-1)，然后设置4个处理确定最优的NAA浓度：(①MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA0.5mg·l-1；②MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA1.0mg·l-1；③MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA1.5mg·l-1；④MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA2.0mg·l-1)
表3 不同2,4-D和KT浓度对脱毒苗生长的影响
注：从Ⅰ-Ⅱ-Ⅲ，代表芦蒿苗根系越浓密和植株越健壮。
结果表明，生根培养5d即可看到白色细根，30d时根系浓密、植株健壮(图4)，在NAA浓度为0.5mg·L-1时，6-BA浓度为0.5-1.0mg·L-1根系最为浓密和植株最为健壮；在6-BA浓度为0.5mg·L-1时，NAA浓度为0.5-1.0mg·L-1根系最为浓密和植株最为健壮。
实施例4
1、试验培养基灭菌及培养条件
高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121℃灭菌20min。培养室温度为25℃，光照强度1300lx，每天光照12h/d。MS培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
2、无菌材料的处理
选取生长健壮的昆明白芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段，置于流水中冲洗20min后，置于超净工作台上，将芦蒿茎段先用75％的酒精浸泡60s，再用84消毒液灭菌10min，无菌水冲洗5次，然后接种在MS培养基中。
3、腋芽诱导
带节茎段灭菌后接种在MS+6-BA1.0mg·l-1+NAA0.4mg·l-1的培养基中。
4、脱毒培养
腋芽分化后45d即可长成高度6～7cm的小苗，之后将小苗切成1.0～1.5cm茎段，去除叶片，接种在MS+2,4-D1.0mg·l-1+KT0.2mg·l-1培养基中。
5、生根及壮苗培养
将经脱毒培养长到10cm左右高度的小苗切成带2-3节的茎段转入MS+6-BA0.5mg·l-1+NAA0.5mg·l-1+活性炭0.02％培养基中诱导生根。
6、再生植株的脱毒效果检测
对再生植株苗用酶联免疫检测法进行脱毒效果检测，结果表明脱毒率达78％。
7、再生植株的炼苗及移栽
将根系浓密，植株健壮的试管苗，移到与外界温度相近的室外，放置5d后旋开瓶盖，于散射光下炼苗9d。移栽时将苗从瓶中取出，用清水将根表面培养基洗净，植于营养土中，移栽后浇定根水，搭拱棚，移栽9d时成活率达100％。

Claims (3)

1.一种芦蒿脱毒苗的快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的准备：选取田间生长健壮、品种特征鲜明的芦蒿植株，在其中上部剪取1～1.5cm健康的带节茎段作为外植体；
(2)外植体的灭菌：将选取的带节茎段置于流水中冲洗10～20min后，无菌条件下，用75％的酒精浸泡30～60s，再用84消毒液灭菌5～10min，无菌水冲洗后接种在MS培养基中；
(3)腋芽的诱导分化：将灭菌后的外植体接种在6-BA浓度为1.0-1.5mg·l-1、NAA浓度为0.4-0.6mg·l-1的MS培养基中；
(4)脱毒培养：诱导培养基上萌发出的不定芽长到高6±1cm小苗时，将小苗取出，去除叶片，切成1.0～1.5cm茎段，接种在2,4-D浓度为1.0mg·l-1、KT浓度为0.2-0.4mg·l-1的MS培养基中；
(5)生根培养：经脱毒培养的小苗长到高10±1cm时，将小苗切成带1-2节的茎段转入6-BA浓度为0.5-1.0mg·l-1、NAA浓度为0.5-1.0mg·l-1、活性炭百分比为0.02％的MS培养基中；
(6)脱毒组培苗移栽：将根系浓密，植株健壮的试管苗，移到与外界温度相近的室内，放置5～6d后旋开瓶盖，于自然散射光下炼苗7～9d后，洗净根表面培养基，植于营养土中，并做好防雨和保温措施，苗移栽成活后，再栽入有防虫措施的大棚中，用于芦蒿种苗的生产。
2.根据权利要求1所述的芦蒿脱毒苗的快繁方法，其特征在于，步骤3～5中，培养室的培养条件为：温度为25±2℃，光照强度为1200-1500lx，每天光照12h。
3.根据权利要求1所述的芦蒿脱毒苗的快繁方法，其特征在于，所述的MS培养基的pH值为5.8，琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。
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