CN110574682B - 一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法 - Google Patents

一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，包括先获取无菌苗，后切取带柄子叶作为外植体，接种到诱导培养基上诱导获得不定芽、再依次切分转移至伸长培养基和生根培养基，其中MS诱导培养基为MS+6‑BA 5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+AgNO3 3.0mg/L；伸长培养基为MS+6‑BA 2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA3 3.0mg/L+AgNO3 3.0mg/L；生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L，待生根苗株高至8‑10cm，去瓶盖置于室温自然光照下炼苗移栽，采用柔毛辣椒带柄子叶作为外植体，应用开发的诱导培养基、伸长培养基和生根培养基，首次获得了具有较高诱芽率和生根率的离体再生苗，本发明方法构建的离体再生体系，为柔毛辣椒的基因功能验证以及分子育种奠定了研究基础。

Description

一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法。
背景技术
组织培养是农业生物技术的重要组成部分，在蔬菜作物离体再生过程中发挥重要作用。辣椒为茄科辣椒属植物，是我国主要蔬菜之一，辣椒属(Capsicum L.)共有5个栽培种：一年生辣椒(Capsicum annuum)、中国辣椒(Capsicum chinense)、灌木状辣椒(Capsicum frutescens)、下垂辣椒(Capsicum baccatum)和柔毛辣椒(Capsicumpubescens)。柔毛辣椒种子为黑色或近黑色，果肉较厚；花为紫色或浅紫色，基部有白色环，花上通常有一个黄色蜜腺的凸起斑点，植株有毛。柔毛辣椒(Capsicum pubescens)与其它辣椒栽培种相互间授粉产生不了种子，存在生殖隔离，因此柔毛辣椒的离体培养意义重大，目前还没有一种适用柔毛辣椒(Capsicum pubescens)诱导离体再生方法的文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，解决采用现有培养基离体培养柔毛辣椒仅产生少量的愈伤组织且不定芽的分化率很低且根系再生能力弱的问题，首次实现柔毛辣椒的离体再生，包括以下步骤：
(1)无菌苗的获取：取柔毛辣椒的种子置于超纯水中，低温浸泡后进行灭菌处理，再接种到MS培养基上培养得到辣椒无菌苗；
(2)不定芽的诱导：将步骤(1)获得的无菌苗，切取0.5-1cm带柄子叶作为外植体，接种到MS诱导培养基上进行不定芽诱导30d后获得2-3cm不定芽，所述MS诱导培养基为MS+6-BA 5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+AgNO3 3.0mg/L；
(3)不定芽的伸长：将步骤(3)的不定芽从外植体切分并转移至伸长培养基中培养20d，获得长度为4-5cm的伸长不定芽，所述伸长培养基为MS+6-BA2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA3 3.0mg/L+AgNO3 3.0mg/L；
(4)不定芽的生根及炼苗：将步骤(3)中伸长不定芽从愈伤组织上切分并接种到生根培养基中诱导生根，待生根苗株高至8-10cm，去瓶盖置于室温自然光照下炼苗1天，将再生苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，移栽至由品氏营养土中，所述生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L。
优选地，步骤(1)中低温浸泡具体在4℃环境下置放24h。
优选地，步骤(1)中灭菌处理具体包括将种子用75％的乙醇震荡1min，用无菌水冲洗后，用10％-15％次氯酸钠溶液摇晃15min，用无菌水冲洗5次后将消毒后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，次氯酸钠浓度低于10％脱毒效果差，污染率高；次氯酸钠浓度大于15％，种子发芽率降低。
优选地，步骤(1)中，辣椒无菌苗的苗龄为20-25d。
与现有技术相比，本发明提供一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，包括柔毛辣椒无菌苗的获取、不定芽的诱导(诱导分化率为45.7％)、不定芽的伸长(伸长率为70％)和不定芽的生根(生根率达到86.7％)等，首次实现了柔毛辣椒带柄子叶为外植体的质量优良的再生苗，为柔毛辣椒的功能基因验证、离体繁殖、育种提供技术支持。
进一步地，本发明方法能较快获得无菌苗且污染率低，在不定芽的生根培养基中两周能长出粗壮的根系，幼苗移栽到配好的基质中，放入人工温室培养，成活率可达98％。
进一步地，本发明获得柔毛辣椒再生植株的方法，不受地区、季节、气候的限制，且遗传性状相对稳定，为柔毛辣椒(Capsicum pubescens)遗传转化体系的构建提供了条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明柔毛辣椒外植体诱导再生苗的过程示意图。
其中：图中A为带柄子叶的示意图；B为带柄子叶诱导的愈伤组织图；C为愈伤组织分化形成不定芽图；D为柔毛辣椒伸长的外植体诱导生根图；E为诱导生根的再生苗；F为移栽后的再生苗。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明涉及到组织培养基及激素具体为：MS培养基、1/2MS培养基购自青岛海博公司；植物激素：6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，IAA为吲哚-3-乙酸；GA3为赤霉素，NAA为萘乙酸，2、4-D为2、4-二氯苯氧乙酸，TDZ为噻苯隆，均购自Sigma公司。
实施例一：一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，包括以下步骤：
(1)无菌苗的获取：取辣椒栽培种柔毛辣椒(Capsicum pubescens)种子置于50mL离心管中，加入超纯水，在4℃环境下置放24h，浸泡时间过短，发芽时间慢；浸泡时间过长会导致辣椒种子腐烂，发芽率降低，后加入75％乙醇震荡1min，用无菌水冲洗两遍后，用10-15％次氯酸钠溶液摇晃20min，用无菌水冲洗5次，最后将消毒后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，接种到MS培养基培养得到无菌苗；
(2)不定芽的诱导：将步骤(1)正常生长20d的无菌苗，切取0.5-1cm带柄子叶作为外植体，接种到诱导培养基MS+6-BA 5.0mg/L+IAA0.5mg/L+AgNO3 3.0mg/L上进行不定芽诱导30d，带柄子叶端生成不定芽，诱导率＝诱导出不定芽的外植体数/总外植体数；
(3)不定芽的伸长：将步骤(2)中分化出2-3cm的不定芽切分并转移至伸长培养基MS+6-BA 2.5mg/L+IAA0.8mg/L+GA3 3.0mg/L+AgNO3 3.0mg/L中20d伸长4-5cm，伸长率＝不定芽伸长至4-5cm的外植体数/总外植体数；
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中伸长至4-5cm的不定芽切分时保留少量愈伤组织，并接种到生根培养基1/2MS+NAA 0.2mg/L中诱导生根，14d长出10条左右粗壮的根系，生根率＝生根的外植体数/总外植体数；
(5)移栽：待生根试管苗株高约8-10cm，去瓶盖炼苗1天，将再生苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭中，置于光照培养室内培养，保持土壤湿润，幼苗成活后移栽至基地大田。
实施例二：不同外植体对不定芽诱导分化的影响，其中步骤2中分别选择柔毛辣椒子叶、下胚轴与带柄子叶作为外植体，由表1结果可知，子叶作为外植体褐化较为严重，能产生少量的愈伤组织，诱导率为26％，下胚轴同样存在褐化的问题，能产生大量的愈伤，但不定芽诱导率低，分化率最高近为3％。带柄子叶作为外植体能在靠近叶柄端出现膨胀，产生不定芽，诱导分化率为46％以上。
表1 不同外植体对芽分化的影响
Figure BDA0002214780790000041
实施例三：不同苗龄对不定芽诱导分化的影响，其中步骤2中分别选择苗龄为15d、25d和30d的柔毛辣椒无菌苗进行切取组织来诱导培养再生苗，结果如表2，选择20～25天苗龄的无菌苗，不定芽诱导率较高，可达到48％，说明无菌苗的苗龄过大或过小都不利于愈伤组织和不定芽的形成。
表2 不同苗龄对芽分化的影响
Figure BDA0002214780790000051
实施例四：不同浓度诱导培养基对芽分化的影响，其中步骤2中采用不同的诱导培养基进行诱导实验，结果如表3，在辣椒组培中常用的激素有6-BA，IAA，NAA以及TDZ等，通过实验表明6-BA+2,4-D配方不适用于本发明中的柔毛辣椒，外植体易出现褐化，诱导率较低，而添加TDZ虽能诱导出大量的愈伤组织，但是不定芽分化率较低，6-BA+NAA组合能分化出少量的不定芽但伸长率很低，本发明发现柔毛辣椒诱导培养基最佳配方为MS+6-BA5.0mg/L+IAA0.5mg/L+AgNO3 3.0mg/L，不定芽的诱导分化率为45.7％。
表3 不同诱导培养基对芽分化的影响
Figure BDA0002214780790000052
Figure BDA0002214780790000061
实施例五：不同伸长培养基对芽伸长的影响，结果参见表4，通过实验发现降低6-BA的浓度，配上合适浓度的GA3，以利于不定芽的伸长，研究发现分化芽伸长的最优配方是MS+6-BA 2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA3 3.0mg/L+AgNO3 3.0mg/L，使不定芽的伸长诱导率提升至70％。
表4 不同浓度的伸长培养基对芽伸长的影响
Figure BDA0002214780790000062
实施例六：不同生根培养基对根诱导的影响，参见表5，通过在MS培养基分别加入NAA、IAA和IBA，发现1/2MS+NAA培养基中，生出的根粗壮、较短且数量较多，而在1/2MS+IAA或1/2MS+IBA培养基中，根较细长，数量少，获得诱导生根培养基最佳配方为1/2MS+NAA0.2mg/L，生根率达到86.7％。
表5 不同生根培养基对根诱导的影响
Figure BDA0002214780790000063
综上，本发明提供一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，包括柔毛辣椒无菌苗的获取、不定芽的诱导、不定芽的伸长、不定芽的生根和移栽等，先提高辣椒带柄子叶的愈伤组织诱导率和伸长率，再改善根的质量，从而获得了质量优良的再生苗，为辣椒遗传转化、快繁及育种提供技术支持。
进一步地，本发明方法能较快获得无菌苗且污染率低，在不定芽的生根培养基中14d能长出粗壮的根系，幼苗移栽到配好的基质中，放入人工温室培养，成活率可达98％。
进一步地，本发明获得辣椒再生植株的方法，不受地区、季节、气候的限制，且遗传性状相对稳定，为柔毛辣椒(Capsicum pubescens)遗传转化体系的构建提供了条件。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (3)

1.一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌苗的获取：取柔毛辣椒的种子置于超纯水中，低温浸泡后进行灭菌处理，再接种到MS培养基上培养得到辣椒无菌苗；所述低温浸泡具体在4℃环境下置放24 h；
(2)不定芽的诱导：将步骤(1)获得的辣椒无菌苗，切取0.5-1cm带柄子叶作为外植体，接种到MS诱导培养基上进行不定芽诱导30d后获得2-3cm不定芽，所述MS诱导培养基为MS+6-BA 5.0mg/L+IAA 0.5mg/L +AgNO3 3.0mg/L；
(3)不定芽的伸长：将步骤(2)的不定芽切分并转移至伸长培养基中培养20 d，获得长度为4-5cm的伸长不定芽，所述伸长培养基为MS+6-BA2.5mg/L+IAA 0.8mg/L+GA3 3.0mg/L+AgNO3 3.0mg/L；
(4)不定芽的生根及炼苗：将步骤(3)中伸长不定芽切分并接种到生根培养基中诱导生根，待生根苗株高至8-10cm，去瓶盖置于室温自然光照下炼苗，再从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，移栽至基质中，所述生根培养基为1/2 MS＋NAA 0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭菌处理具体包括将种子用75%的乙醇震荡1min，用无菌水冲洗后，用10%-15%次氯酸钠溶液摇晃15min，用无菌水冲洗5次后将消毒后的种子置于无菌滤纸上吸干水分。
3.根据权利要求1所述一种柔毛辣椒外植体诱导再生苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，辣椒无菌苗的苗龄为20-25d。
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