CN106879471A - 一种改良的白及组培苗生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种改良的白及组培苗生产方法，该方法的特征在于以常用培养基MS为对照，提高大量元素中的磷、钾用量，减少氮和钙、镁用量。增加B族维生素用量，新增氯化胆碱、AgNO3，柠檬酸、复硝酚钠，用低浓度植物激素6‑BA 0.02‑0.2mg/L，NAA 0.02‑0.5mg/L。提高培养室温度到28℃，调节播种期、壮苗及生根期光照强度，采用“种子播种→壮苗培养→生根培养→晒苗培养”四步法生产白及种苗。本发明方法显著提高了白及组培苗的质量，生产周期缩短到170～180天，缩短了培养周期，且组培苗生长健壮，形成的假鳞茎达到0.8cm以上，出瓶移栽成活率达90％以上。

Description

一种改良的白及组培苗生产方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及通过改良白及组培培养基中的关键成份，生产出优质白及组培苗的方法。
背景技术
兰科植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)被收入中国药典(2000年版1部)，其功能与主治为收敛止血，消肿生肌。用于咳血吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂；肺结核咳血，溃疡病出血。
近年研究发现白及多糖胶具有特殊的黏度，可作为混悬剂及乳化剂用于食品及化工领域。现代药理研究表明白及多糖胶对葡萄球菌、链球菌、结核杆菌等有抑制作用，具有保护皮肤和延缓衰老等功能，是安全性高的医药原料，市场需求量急剧增长。
白及种子萌发困难，生长缓慢。目前国内也有组培室开展白及组培苗生产，但普遍现象是种苗较细弱，形成的假鳞茎直径较小，组培苗驯化成活率不高，组培时间较长。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种改良的白及组培苗生产方法。本发明的技术方案如下：
1.一种改良的白及组培苗生产方法，包括以下步骤：
(1)白及蒴果灭菌及瓶内播种培养
用75％的酒精擦拭成熟的白及蒴果表面，再用3％洗衣粉水清洗白及蒴果表面，然后置超净工作台上用0.2％氯化汞溶液消毒15min，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌的滤纸吸干白及蒴果表面水分后，用手术刀切去白及蒴果顶部，再从白及蒴果中部纵向剖开，将种子取出均匀撒播到盛有种子播种培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度1500～1800lx，光照时间12小时的条件下培养至幼苗株高为1cm以上；所述种子播种培养基为：改良的MS+柠檬酸100mg/L+AgNO3 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱50mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，pH值5.5～5.8，所述改良的MS由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机物组成：
大量元素为：KNO3 2930mg/L，(NH4)2SO4 463g/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L；
微量元素为：KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐为：Na2·EDTA 37.25mg/L，FeSO4·7H2O 27.85mg/L；
有机物为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素50mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸0.5mg/L；
(2)壮苗培养
转接步骤(1)培养的植株高为1cm以上的幼苗到盛有壮苗及生根培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养，待幼苗长成3～5片叶片，苗高3cm以上，植株基部膨大呈球形假鳞茎的小苗时进行如下生根培养；所述壮苗及生根培养基为：改良的MS+柠檬酸300mg/L+AgNO3 0.2mg/L+6-BA 0.02～0.1mg/L+NAA0.2mg/L～0.5mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱150mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，PH值5.5～5.8，所述改良的MS与步骤(1)中所述的种子播种培养基中所述的改良的MS相同。
(3)生根培养
将步骤(2)培养的小苗转接到盛有新的步骤(2)中所述的壮苗及生根培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养培养45～50天，苗高5cm以上、假鳞茎的大小在5mm以上；
(4)晒苗培养
将步骤(3)经过生根培养的组培瓶置入大棚内，在自然光下晒苗培养20天～25天即得出瓶移栽的白及组培苗。
2.根据技术方案1所述的一种改良的白及组培苗生产方法，步骤(1)中将种子取出均匀撒播到盛有种子播种培养基的瓶内采用稀播，每个白及蒴果播种50-80瓶。
与现有技术相比，本发明的创新点和有益效果如下：
本发明结合白及假鳞茎形成的生理生化特性，改良基本培养基中的关键成份，降低激素浓度使用，结合光温条件的调控，不需诱导分化及继代培养步骤，白及组培苗从播种到出瓶，生产周期缩短到170～180天，比现有技术缩短生产周期40天～60天；且组培苗生长健壮，形成的假鳞茎达到0.8cm以上，比现有技术的假鳞茎增大0.4cm左右，白及组培苗的移栽成活率明显提高，达到90％以上，提高12.5％～28.6％以上，产生了预料不到的技术效果，解决了白及组培中存在的种苗较细弱，形成的假鳞茎直径较小，组培苗驯化成活率不高，组培时间较长的生产实际难题。
具体改良措施主要有：
1.改良MS基本培养基，以常用培养基MS为对照，提高大量元素中的磷、钾用量，减少氮和钙、镁用量。硝酸钾用量从1900mg/L提高到2930mg/L；磷酸二氢钾用量从170mg/L提高到400mg/L；硝酸铵用量1650mg/L改用为硫酸铵463mg/L；氯化钙用量从440mg/L减少为166mg/L；硫酸镁用量从370mg/L减少为185mg/L。微量元素和铁盐的用量同MS。
2.增加B族维生素用量即盐酸硫胺素用量从0.1mg/L提高到50mg/L；盐酸吡哆醇用量从0.5mg/L提高到1mg/L。
3.新增氯化胆碱50mg/L～150mg/L；抗氧化剂AgNO3 0.1～0.2mg/L；柠檬酸100mg/L～300mg/L；复硝酚钠0.1mg/L。同时添加蔗糖30g/L；香蕉30g/L。
在白及组培苗的整个生长发育期，增加B族维生素用量对白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育和增殖起到重要作用，其数据见表1。
柠檬酸作为抗褐化剂，抑制白及组培过程中酚类物质产生，减少幼小原球茎死亡，提高了成苗率；AgNO3作为抗衰老剂，有效地防止了乙烯对白及组培苗生长的影响。
4.采用低浓度植物激素6-BA 0.02-0.2mg/L；NAA 0.02mg/L～0.5mg/L。低浓度植物激素提高了植株的正常苗比率。
5.提高培养室温度及后期组培苗培养的光照强度。调节培养室温度到28℃；光照强度播种期1500lux-1800lux，壮苗及生根期2200lux-2500lux，光照时间12小时。适当提高培养室温度及壮苗及生根期光照强度，增加了光合作用，促进了植株生长旺盛。
6.采用“种子播种→壮苗培养→生根培养→晒苗培养”四步法生产白及种苗，省略了诱导分化、继代培养步骤，缩短了白及组培苗培养周期，现有技术白及组培的培养周期210～240天，本发明生产周期缩短到170～180天，白及组培苗生产周期缩短40～60天。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中按常规植物组织培养的要求对培养基配制和灭菌，在常规的植物组培无菌条件下进行，无特殊说明的均为常规方法。
实施例1本发明方法，包括以下步骤：
(1)白及蒴果灭菌及瓶内播种培养
用体积分数为75％的酒精擦拭成熟的白及蒴果表面，所述成熟的白及蒴果为.蒴果生长周期达到22周的果实，再用质量分数为3％的洗衣粉水清洗所述成熟的白及蒴果表面，然后置超净工作台上用质量分数为0.2％氯化汞溶液消毒15min，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌的滤纸吸干白及蒴果表面水分后，用手术刀切去白及蒴果顶部，再从白及蒴果中部纵向剖开，将种子取出均匀撒播到盛有种子播种培养基的瓶内，采用稀播，播种量为一个白及蒴果播种60瓶，所述瓶为常规的植物组培瓶，瓶内径为8cm,瓶高10cm。播种采用稀播有利于种子萌发后幼苗的生长，播得太密，小苗生长纤弱，不利于后期培养。然后将瓶置于在28℃，光照强度1500～1800lx，光照时间12小时的条件下培养至幼苗株高为1cm以上；所述种子播种培养基为：改良的MS+柠檬酸100mg/L+AgNO3 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA0.02mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱50mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，PH值5.5～5.8，所述改良的MS由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机物组成：
大量元素为：KNO3 2930mg/L，(NH4)2SO4 463g/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L；
微量元素为：KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐为：Na2·EDTA 37.25mg/L，FeSO4·7H2O 27.85mg/L；
有机物为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素50mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸0.5mg/L；
以上从播种起培养5天后种子萌发形成原球茎，从播种起培养20天后长出第1片真叶，再培养30天，植株高1cm～1.2cm，从播种起至植株高1cm以上共50天。
(2)壮苗培养
转接步骤(1)培养的植株高为1cm以上的幼苗到盛有壮苗及生根培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养，待幼苗长成3～5片叶片，苗高3cm以上，植株基部膨大呈球形假鳞茎的小苗时进行如下生根培养；所述壮苗及生根培养基为：改良的MS+柠檬酸300mg/L+AgNO3 0.2mg/L+6-BA 0.02mg/L+NAA0.3mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱150mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，pH值5.5～5.8，壮苗及生根培养基中所述改良的MS与步骤(1)中所述种子播种培养基中的改良的MS相同。
壮苗培养50天，幼苗长成3-5片叶片，苗高3cm以上，植株基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。
(3)生根培养
将步骤(2)培养的小苗转接到盛有新的步骤(2)中所述的壮苗及生根培养基的瓶内(即生根培养的培养基与壮苗培养的培养基是相同的)，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养50天，苗高5cm以上、植株根系发达，茎杆粗壮、叶片舒展宽大，假鳞茎的大小在5mm以上。
(4)晒苗培养
将步骤(3)经过生根培养的组培瓶苗(瓶盖不打开)置入大棚内，在自然光下晒苗培养20天即得可出瓶移栽的白及组培苗。在大棚内自然光下晒过的瓶苗，苗的高度提高，叶片舒展厚度增加，叶绿素含量大幅提高，假鳞茎增大到8mm以上，这些白及组培苗因健壮出瓶移栽成活率达90％以上。而现有技术组培的白及组培苗出瓶移栽的成活率在70-80％。
以上实施例表明：采用本发明方法，白及种子播种培养仅50天，不需诱导分化就长出幼苗，壮苗培养50天幼苗即长成3-5片叶片，苗高3cm以上，植株基部膨大呈球形假鳞茎的健壮小苗。生根培养50天，苗高5cm以上、植株根系发达，茎杆粗壮、叶片舒展宽大，假鳞茎在5mm以上，加上大棚自然光晒苗培养20天，整个白及组培苗培养周期仅170天，而现有技术白及组培的培养周期需210～240天，本发明生产周期缩短40～70天，白及组培苗出瓶移栽成活率提高12.5％～28.57％以上，产生了预料不到的技术效果。
表1是在上述实施例步骤(3)生根培养中，采用本发明生根培养所用的壮苗及生根培养基，与对照的生根培养基的对比，培养条件相同。对照的生根培养基与本发明的生根培养所用的壮苗及生根培养基的区别仅在于MS培养基：本发明的生根培养采用的壮苗及生根培养基中是本发明改良的MS培养基，而对照的生根培养基中的MS是现有的MS培养基，表1的调查数据表明：本发明改良的MS培养基增加B族维生素用量对白及胚状体、茎、叶、假鳞茎的发育和增殖起到重要作用。
表1本发明改良的MS与现有的MS对白及组培苗生长的影响

Claims (2)

1.一种改良的白及组培苗生产方法，包括以下步骤：
(1)白及蒴果灭菌及瓶内播种培养
用75％的酒精擦拭成熟的白及蒴果表面，再用3％洗衣粉水清洗白及蒴果表面，然后置超净工作台上用0.2％氯化汞溶液消毒15min，再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌的滤纸吸干白及蒴果表面水分后，用手术刀切去白及蒴果顶部，再从白及蒴果中部纵向剖开，将种子取出均匀撒播到盛有种子播种培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度1500～1800lx，光照时间12小时的条件下培养至幼苗株高为1cm以上；所述种子播种培养基为：改良的MS+柠檬酸100mg/L+AgNO3 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱50mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，pH值5.5～5.8，所述改良的MS由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机物组成：
大量元素为：KNO3 2930mg/L，(NH4)2SO4 463g/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L；
微量元素为：KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐为：Na2·EDTA 37.25mg/L，FeSO4·7H2O 27.85mg/L；
有机物为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素50mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸0.5mg/L；
(2)壮苗培养
转接步骤(1)培养的植株高为1cm以上的幼苗到盛有壮苗及生根培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养，待幼苗长成3～5片叶片，苗高3cm以上，植株基部膨大呈球形假鳞茎的小苗时进行如下生根培养；所述壮苗及生根培养基为：改良的MS+柠檬酸300mg/L+AgNO3 0.2mg/L+6-BA 0.02～0.1mg/L+NAA0.2mg/L～0.5mg/L+复硝酚钠0.1mg/L+氯化胆碱150mg/L+蔗糖30g/L+香蕉30g/L，PH值5.5～5.8，所述改良的MS与步骤(1)中所述的种子播种培养基中所述的改良的MS相同。
(3)生根培养
将步骤(2)培养的小苗转接到盛有新的步骤(2)中所述的壮苗及生根培养基的瓶内，然后将瓶置于28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间12小时的条件下培养培养45～50天，苗高5cm以上、假鳞茎的大小在5mm以上；
(4)晒苗培养
将步骤(3)经过生根培养的组培瓶置入大棚内，在自然光下晒苗培养20天～25天即得出瓶移栽的白及组培苗。
2.根据权利要求1所述的一种改良的白及组培苗生产方法，其特征在于：步骤(1)中将种子取出均匀撒播到盛有种子播种培养基的瓶内采用稀播，每个白及蒴果播种50-80瓶。
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