CN106134996A - 一种黄精一次成苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种黄精一次成苗的方法，含有以下步骤：a.培养基的配置；b.外植体的选取及灭菌；c.外植体的接种；d.培养：e.移栽炼苗。本发明方便快捷一种黄精一次成苗的方法，与传统的方法选取地下根茎进行组织培养相比，选取黄精幼嫩叶片作为外植体进行组织培养，不仅取材容易、不损毁黄精根茎产生的经济效益，而且因为黄精的叶片量大、繁殖系数更高，使得生产方法方便快捷，能在较短的时间内培育出黄精的组培苗；且该方法操作简便，从外植体到幼苗只需要一个步骤，大大减少了人工作业，最大限度的降低了污染的发生；并且通过选择优良的母本来进行黄精种质提纯复壮和优良性状的保持，对于黄精的优良种苗繁育具有较高的应用价值。

Description

一种黄精一次成苗的方法
技术领域
本发明涉及一种黄精一次成苗的方法。
背景技术
黄精(Polygonatum sibiricum)为百合科黄精属，多年生草本植物的总称，是我国传统大宗药材，以根茎入药，具有补气健脾、润肺、益肾等功能。黄精作为集药用、观赏、美容和食用于一身的植物，经济价值巨大，应用前景广阔。随着市场需求量的与日俱增，野生资源已远远不能满足人们的需求，加之过度开采，致使野生资源越来越少。
目前生产上多采用块茎繁殖的方式栽培黄精，但块茎繁殖的方法繁殖系数较低，成本较高，且长期的无性繁殖引起黄精品质退化，病虫害问题日益严重，严重的限制了黄精的生产规模。而黄精种子则存在胚后熟的习性，自然条件下发芽率较低。随着组培技术的日趋成熟，通过组培快繁的方式培育黄精种苗成为一种可行之道。目前，关于黄精组培快繁的研究报道较多，但多为器官发生途径。主要通过愈伤诱导培养基诱导黄精外植体脱分化形成愈伤组织，然后再先后转移到芽诱导培养基和根诱导培养基，诱导愈伤细胞分化形成芽和根，从而形成完整的植株。该途径在组织培养上较为成熟，但存在过程较多，周期较长，操作中易污染等问题，增加了组培苗繁育的周期和成本。而组织培养的另一条途径——胚胎发生途径，则将外植体放在一次成苗培养基上诱导外植体形成胚性愈伤细胞，从而进一步发育成完整植株。通过该途径进行组织培养，具有周期短，操作步骤少，成本较低等优点，是工厂化生产组培苗的首选技术。但目前同过该途径来进行黄精的组织培养尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种黄精一次成苗的方法。
本发明的技术方案是：一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，调节pH并 灭菌，在超净工作台上分装至培养瓶中；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗，去除尘土杂质，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，控制培养室温度、相对湿度和光暗周期；e.移栽炼苗：培养90天后，将大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在营养土中炼苗。
优选的方案中一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，调节pH为5.8～6.0，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒，最后用无菌水冲洗5～8次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，每个培养瓶接种3～4块，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，控制培养室温度和相对湿度，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗。
优选的方案中一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L，调节pH为5.8～6.0，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中，培养基厚2-3cm；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗1～3分钟，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡 6～8分钟，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡20s，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒8～10min，最后用无菌水冲洗5～8次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种3～4块，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度23～27℃，相对湿度70％～80％，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗，移栽后7天及时浇水保持土壤湿度，并遮阴，苗成活后即可撤去荫棚，并适当干燥蹲苗，培育壮苗。
本发明一种黄精一次成苗的方法的有益效果是：与传统的方法选取地下根茎进行组织培养相比，选取黄精幼嫩叶片作为外植体进行组织培养，不仅取材容易、不损毁黄精根茎产生的经济效益，而且因为黄精的叶片量大、繁殖系数更高，使得生产方法方便快捷，能在较短的时间内培育出黄精的组培苗；且该方法操作简便，从外植体到幼苗只需要一个步骤，大大减少了人工作业，最大限度的降低了污染的发生；并且通过选择优良的母本来进行黄精种质提纯复壮和优良性状的保持，对于黄精的优良种苗繁育具有较高的应用价值；本发明一种黄精一次成苗的方法操作简便，培养周期短，投入少，且技术易掌握，适于推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：本发明一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L，调节pH为5.8，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中，培养基厚2cm；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗1分钟，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡6分钟，用自来水冲 洗干净，再用75％乙醇浸泡20s，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒8min，最后用无菌水冲洗5次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种3块，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度23℃，相对湿度70％，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗，移栽后7天及时浇水保持土壤湿度，并遮阴，苗成活后即可撤去荫棚，并适当干燥蹲苗，培育壮苗。
实施例2：本发明一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L，调节pH为6.0，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中，培养基厚3cm；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗3分钟，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡8分钟，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡20s，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒10min，最后用无菌水冲洗8次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种4块，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度27℃，相对湿度80％，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗，移栽后7天及时浇水保持土壤湿度，并遮阴，苗成活后即可撤去荫棚，并适当干燥蹲苗，培育壮苗。
实施例3：本发明一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L，调节pH为5.9，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装 至培养瓶中，培养基厚3cm；b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗2分钟，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡7分钟，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡20s，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒9min，最后用无菌水冲洗7次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体材料；c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种3块，盖好瓶盖；d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度25℃，相对湿度75％，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗，移栽后7天及时浇水保持土壤湿度，并遮阴，苗成活后即可撤去荫棚，并适当干燥蹲苗，培育壮苗。
实施例4：本发明根据植物细胞的全能性，利用黄精幼嫩叶片细胞分生能力强的特点，将黄精幼嫩叶片充分消毒灭菌并切成约1cm2外植体后接种到诱导培养基中进行成苗诱导，3周后即可分化形成淡黄色或白色致密的愈伤组织，继续培养60天后体细胞胚胎发育形成具有根和芽的完整植株。植株进一步在培养基中生长至约4cm左右时，可以移栽炼苗。
用于诱导黄精外植体一次成苗的培养基配方：
MS基本培养基+2mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D。
a、培养基的配制及灭菌
(1)MS培养基母液的母液配制
有些微量元素和有机成分成分浓度极低，因此，先配制成母液的母液，浓度如下表：
(2)MS培养基母液配制
MS-A(macro)：为工作液浓度的50倍。称取NH4NO3 41.25g、KNO3 47.5g、MgSO4·7H2O 9.25g、KH2PO4 9.25g，蒸馏水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中保存。
MS-B：吸取母液的母液若干，用蒸馏水定容至200ml，使终浓度如下表。4℃的冰箱中保存。
母液终浓度
H3BO3 0.124g/200ml
MnSO4·4H2O 0.338g/200ml
ZnSO4·7H2O 0.172g/200ml
CuSO4·5H2O 0.0005g/200ml
CoCl2·6H2O 0.0005g/200ml
KI 0.0166g/200ml
Na2MoO4·2H2O 0.005g/200ml
MS-C：称取CaCl2·2H2O 22.0g蒸馏水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中保存。
MS-D：吸取母液的母液若干，用蒸馏水定容至200ml，使终浓度如下表。4℃的冰箱中保存。
MS-E：称取Na2-EDTA 3.725g、FeSO4·7H2O 2.875g蒸馏水溶解，容量瓶定容至500ml。4℃的冰箱中避光保存。
(3)MS培养基的配制
①配制1升工作液，烧杯中放入700ml左右的蒸馏水，按顺序分别吸取MS-A母液20ml、MS-B母液10ml、MS-C母液10ml、MS-D母液10ml、MS-E母液10ml。
②加入固体蔗糖30g(根据具体实验调节浓度)，溶解。
③加入6-BA和2,4-D，定容至1000ml，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L。
④使用0.1－1mol/l的HCl或NaOH调整pH值为6.0。
⑤加入7g琼脂粉，使琼脂浓度为0.7％。
⑥配制好的培养基置于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，然后乘热在超净工作台上无菌分装至培养瓶中，瓶内培养基厚3cm，封口消毒备用。
b、外植体的选取及灭菌
选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗几分钟，去除尘土杂质；然后用0.5％洗衣粉水浸泡8分钟，用自来水冲洗干净；再放入75％乙醇中浸泡20s，取出后用无菌水冲洗四次；接着投入0.1％升汞中消毒10min，后用无菌水冲洗6次，最后用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体备用。
c、外植体接种
在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种3块，盖好瓶盖。所有操作环节应严格注意无菌，避免污染。
d、培养
将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度25℃，相对湿度80％，在16h:8h的光暗周期下培养至成苗。
e、移栽炼苗
培养约90天后，将培养瓶中4cm以上的大苗移出，并用清水小心清洗干净根部培养基，后移栽至泥炭土中炼苗。移栽后7天应及时浇水保持土壤湿度，并遮阴。黄精幼苗成活返青后即可撤去荫棚，并追施稀尿素水溶液，起苗前适当干燥蹲苗，培育壮苗。

Claims (3)

1.一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：
a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，调节pH并灭菌，在超净工作台上分装至培养瓶中；
b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗，去除尘土杂质，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成外植体材料；
c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，盖好瓶盖；
d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，控制培养室温度、相对湿度和光暗周期；
e.移栽炼苗：培养90天后，将大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在营养土中炼苗。
2.按照权利要求1所述的一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：
a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，调节pH为5.8～6.0，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中；
b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒，最后用无菌水冲洗5～8次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成外植体材料；
c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，每个培养瓶接种3～4块，盖好瓶盖；
d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，控制培养室温度和相对湿度，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；
e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗。
3.按照权利要求1所述的一种黄精一次成苗的方法，其特征在于含有以下步骤：
a.培养基的配置：在MS基本培养基中加入6-BA和2,4-D，并使其浓度分别达到2mg/L和0.5mg/L，调节pH为5.8～6.0，121℃灭菌20min后，在超净工作台上分装至培养瓶中，培养基厚2-3cm；
b.外植体的选取及灭菌：选取长势良好，生长健壮的黄精植株，摘取未完全展开或刚展开的幼嫩叶片作外植体，用流动的自来水冲洗1～3分钟，去除尘土杂质，然后用0.5％洗衣粉水浸泡6～8分钟，用自来水冲洗干净，再用75％乙醇浸泡20s，无菌水冲洗四次，投入0.1％升汞中消毒8～10min，最后用无菌水冲洗5～8次，用灭菌的剪刀在无菌条件下剪成1cm2外植体材料；
c.外植体的接种：在超净工作台上将外植体接种在培养瓶的培养基中，并使叶背面朝上，每个培养瓶接种3～4块，盖好瓶盖；
d.培养：将接种后的培养瓶放在培养室中培养，培养室温度23～27℃，相对湿度70％～80％，在16h:8h的光暗周期的条件下培养；
e.移栽炼苗：培养90天后，将4cm以上的大苗移出培养瓶，并用清水清洗干净根部培养基，种植在泥炭土营养土中炼苗，移栽后7天及时浇水保持土壤湿度，并遮阴，苗成活后即可撤去荫棚，并适当干燥蹲苗，培育壮苗。
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