CN108739380A - 一种白及组培苗一次性成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白及组培苗一次性成苗的方法，在白及组培苗的增殖培养和生根培养阶段均在无菌播种的培养基上完成，只需配制一次培养基，在培养瓶苗中依次加入增殖诱导剂和生根结鳞茎诱导剂，就可将白及从种子到生根结鳞茎组培苗一次性完成，可出瓶炼苗。在增殖倍数不减少情况下，组培苗生长健壮，根系发达。与常规组培快繁技术相比只需配制一次培养基，增殖和生根环节无需再配制培养基和进行转接，节约了2次以上培养基的成本，节省了大量转瓶接种的时间，简化组培程序，可大大降低白及组培苗生产成本，节约成本一半以上。而且本方法操作简单，生产成本低，可在短时间内生产出大量优质种苗，为白及优质低价的种苗繁育提供技术支持和保障。
Description
技术领域
本发明涉及组培苗，具体是一种白及组培苗一次性成苗的方法。
背景技术
白及（Bletilla striata(Thunb.) Reichb.f.）为兰科多年生草本植物。白及干燥假鳞茎为我国传统中药，具收敛止血、补肺、消肿生肌之功效，外敷治疗创伤出血、痛肿、烫伤和疗疮，内治吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡以及肿瘤等症。由于白及无毒副用，已被列入药食两用的中药。现代研究表明，白及的提取物具有较强的抗氧化和抗衰老作用，添加到化妆品中可以起到消炎、止痒、消退色斑、消除痤疮、防止粗糙、抗冻防裂等作用，兼备保健、护肤及美容之功效。此外，白及在化工和观赏园林等方面应用广泛。
白及原产我国，分布于广西、贵州、云南、安徽和四川等省，野生于荫蔽草丛、林下潮湿地或岩石缝中，产量低。长期以来，白及药用原料以野生为主。随着其药理等方面的研究不断深入，应用领域不断拓宽，市场需求与日俱增。白及野生资源遭到长期掠夺式地采挖、再加上其自身繁殖能力差以及天然生境不断恶化，白及野生蕴藏量大幅减少，分布范围逐年缩小，濒临灭绝边缘，目前已被国家列为重点保护的野生药用植物之一。
随着现代科学技术发展，植物组织培养技术已经应用于白及种苗繁育中，大量组培苗正逐渐代替分株繁殖苗。但由于白及等兰科植物培养周期长，每个环节的培养时间为2个月左右，培养室中花费在光照和空调等费用也不少；多次更换培养基需要的费用、洗瓶费用和接种人工费用都是一笔很大的费用，导致了白及组培苗成本居高不下，严重阻碍了白及组培苗的推广和应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种白及组培苗一次性成苗的方法，在白及组培苗的增殖培养和生根培养阶段均在无菌播种的培养基上完成，也就是说只需配制一次培养基就可让白及从种子到生根结鳞茎阶段完成组培苗生产。
实现本发明目的的技术方案是：
一种白及组培苗一次性成苗的方法，包括以下步骤：
（1)在超净工作台上，将清洗干净的白及蒴果用0.2%升汞进行灭菌处理10 min，用无菌水清洗3次，用无菌纸吸干表面水滴，用手术刀把蒴果切开，将少量种子均匀撒在培养瓶里的MS培养基表面，将培养瓶的瓶盖盖好，放到培养室中培养，7～12d时，种子开始膨大变绿，15～25d时，种子开始萌发出小芽，60d时，长成高为1～3cm的小芽，有部分小芽长有根；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的增殖诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10ml，培养瓶放到培养室中培养，培养45～55d，原小芽上长出3～6个新的小芽，形成丛生芽；
所述增殖诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1900、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 370、KH2PO4 170、KI 0.83、H3BO36.2、MnSO4.4H2O 22.3、ZnSO4 8.6、Na2MoO4.H2O 0.25、CuSO4.5H2O 0.025、CoCl2.6H2O0.025、FeSO4.7H2O 27.8、Na2-EDTA.2H2O 37.3、肌醇100、烟酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2；
植物生长调节剂组成为：6-BA 0.5～2 + CPPU 0.1～1.0 + NAA 0.1～0.5，pH值为6.2；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的长有丛生芽的培养瓶表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的生根结鳞茎诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10ml，培养55～65d，丛生芽上每个小芽的基部都长有假鳞茎，形成丛生假鳞茎，根数为2～8条，可出瓶炼苗；
所述生根结鳞茎诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1000、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 185、KH2PO4 170、KI 0.415、H3BO3 3.1、MnSO4.4H2O 11.15、ZnSO4 4.3、Na2MoO4.H2O 0.125、CuSO4.5H2O 0.0125、CoCl2.6H2O 0.0125、FeSO4.7H2O 13.9、Na2-EDTA.2H2O 18.65、肌醇 50、烟酸0.25、盐酸吡哆醇0.25、盐酸硫胺素0.05、甘氨酸1；
植物生长调节剂组成为：IBA 0.5～2.0 + IAA 0.1～1.0+KT 0.1～0.5，pH值为6.5。
所述增殖诱导剂中植物生长调节剂的优选为： 6-BA 1.0 mg/L+ CPPU 0.5 mg/L+ NAA 0.2 mg/L，pH值为6.2。
所述生根结鳞茎诱导剂中植物生长调节剂优选为： IBA 1.0 mg/L + IAA 0.5mg/L + KT 0.3 mg/L，pH值为6.5。
所述诱导剂中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，CPPU为氯吡苯脲，NAA为萘乙酸，KT为激动素，IBA为吲哚丁酸，IAA为吲哚-3-乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。
所述诱导假鳞茎培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃, 光照时间为14 h/d, 光照强度为2000 lx。
采用本方法可以只需配制一次培养基，在培养瓶苗中依次加入增殖诱导剂和生根结鳞茎诱导剂，就可将白及从种子到生根结鳞茎苗一次性完成，在增殖倍数不减少情况下，组培苗生长健壮，根系发达。该方法操作简单，高效稳定，节省生产环节人力物力，大大减低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的详细说明，但不是对本发明的限定。
实施例1：
一种白及组培苗一次性成苗的方法，包括以下步骤：
（1)在超净工作台上，将清洗干净的白及蒴果用0.2%升汞进行灭菌处理10 min，用无菌水清洗3次，用无菌纸吸干表面水滴，用手术刀把蒴果切开，将少量种子均匀撒在培养瓶的MS培养基表面，将培养瓶盖子盖好，放到培养室中培养，7～12 d时，种子开始膨大变绿，15～25 d时，种子开始萌发出小芽，60 d时，长成高为1～3 cm的小芽，有部分小芽长有根；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的增殖诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养瓶放到培养室中培养，培养55 d，原小芽上长出一些新的小芽，形成丛生芽，增殖系数为3.2，芽较壮；
所述增殖诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1900、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 370、KH2PO4 170、KI 0.83、H3BO36.2、MnSO4.4H2O 22.3、ZnSO4 8.6、Na2MoO4.H2O 0.25、CuSO4.5H2O 0.025、CoCl2.6H2O0.025、FeSO4.7H2O 27.8、Na2-EDTA.2H2O 37.3、肌醇100、烟酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2；
植物生长调节剂组成为；6-BA 0.5 mg/L+ CPPU 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L，pH值为6.2；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的长有丛生芽的培养瓶表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的生根结鳞茎诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养65d，丛生芽上每个小芽的基部都长有假鳞茎，形成丛生假鳞茎，假鳞茎的直径小，为0.1～0.2cm，根数少，为2～4条，苗长势较弱；
所述生根结鳞茎诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1000、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 185、KH2PO4 170、KI 0.415、H3BO3 3.1、MnSO4.4H2O 11.15、ZnSO4 4.3、Na2MoO4.H2O 0.125、CuSO4.5H2O 0.0125、CoCl2.6H2O 0.0125、FeSO4.7H2O 13.9、Na2-EDTA.2H2O 18.65、肌醇 50、烟酸0.25、盐酸吡哆醇0.25、盐酸硫胺素0.05、甘氨酸1；
植物生长调节剂组成为：IBA 0.5 mg/L+ IAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L，pH值为6.5；
所述诱导假鳞茎培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃, 光照时间为14 h/d,光照强度为2000 lx。
实施例2：
一种白及组培苗一次性成苗的方法，包括以下步骤：
（1)在超净工作台上，将清洗干净的白及蒴果用0.2%升汞进行灭菌处理10 min，用无菌水清洗3次，用无菌纸吸干表面水滴，用手术刀把蒴果切开，将少量种子均匀撒在培养瓶的MS培养基表面，将培养瓶盖子盖好，放到培养室中培养，7～12 d时，种子开始膨大变绿，15～25 d时，种子开始萌发出小芽，60 d时，长成高为1～3 cm的小芽，有部分小芽长有根；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的增殖诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养瓶放到培养室中培养，培养45 d，原小芽上长出一些新的小芽，形成丛生芽，增殖系数为5.7，芽较细弱，部分丛生芽长根；
所述增殖诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成，营养液的组成同实施例1；
植物生长调节剂组成为；6-BA 2 mg/L+ CPPU 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L，pH值为6.2；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的长有丛生芽的培养瓶表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的生根结鳞茎诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养55d，丛生芽上每个小芽的基部都长有假鳞茎，形成丛生假鳞茎，每个假鳞茎大小平均为0.33cm，每丛假鳞茎的根数约为5.1条，苗长势一般；
所述生根结鳞茎诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成，营养液的组成同实施例1；
植物生长调节剂组成为：IBA 2.0 mg/L+ IAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L，pH值为6.5；
诱导假鳞茎培养阶段的培养条件同实施例1。
实施例3：
一种白及组培苗一次性成苗的方法，包括以下步骤：
（1)在超净工作台上，将清洗干净的白及蒴果用0.2%升汞进行灭菌处理10 min，用无菌水清洗3次，用无菌纸吸干表面水滴，用手术刀把蒴果切开，将少量种子均匀撒在培养瓶的MS培养基表面，将培养瓶盖子盖好，放到培养室中培养，7～12 d时，种子开始膨大变绿，15～25 d时，种子开始萌发出小芽，60 d时，长成高为1～3 cm的小芽，有部分小芽长有根；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的增殖诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养瓶放到培养室中培养，培养50 d，原小芽上长出一些新的小芽，形成丛生芽，增殖系数为5.0，芽较壮，部分丛生芽长根；
所述增殖诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成，营养液的组成同实施例1；
植物生长调节剂组成为；6-BA 1.0 mg/L+ CPPU 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L，pH值为6.2；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的长有丛生芽的培养瓶表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的生根结鳞茎诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养60d，丛生芽上每个小芽的基部都长有假鳞茎，形成丛生假鳞茎，每个假鳞茎大小平均为0.41cm，每丛假鳞茎的根数约为6.8条，苗长势好；
所述生根结鳞茎诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成，营养液的组成同实施例1；
植物生长调节剂组成为：IBA 1.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L + KT 0.3 mg/L，pH值为6.5；
诱导假鳞茎培养阶段的培养条件同实施例1。
实施例1～3的增殖诱导剂和生根结鳞茎诱导剂中的营养液都是一样的，通过添加不同植物生长调节剂浓度进行诱导，从中筛选出最适合白及组培苗生长的植物生长调节剂的浓度组合。
以下是普通白及快繁技术与本发明方法的成本对比：
采用本发明方法与常规组培快繁技术相比只需配制一次培养基，增殖和生根环节无需再配培养基和进行转接，节约了2次以上培养基的成本，节省了大量转瓶接种的时间，简化组培程序，可大大降低白及组培苗生产成本，可节约成本一半以上。而且本方法操作简单，生产成本低，可在短时间内生产出大量优质种苗，为白及优质低价的种苗繁育提供技术支持和保障。
Claims (4)
1.一种白及组培苗一次性成苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1)在超净工作台上，将清洗干净的白及蒴果用0.2%升汞进行灭菌处理10 min，用无菌水清洗3次，用无菌纸吸干表面水滴，用手术刀把蒴果切开，将少量种子均匀撒在培养瓶的MS培养基表面，将培养瓶盖子盖好，放到培养室中培养，7～12 d时，种子开始膨大变绿，15～25 d时，种子开始萌发出小芽，60 d时，长成高为1～3 cm的小芽，有部分小芽长有根；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中长有小芽的培养瓶的表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的增殖诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养瓶放到培养室中培养，培养45～55 d，原小芽上长出3～6个新的小芽，形成丛生芽；
所述增殖诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1900、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 370、KH2PO4 170、KI 0.83、H3BO36.2、MnSO4.4H2O 22.3、ZnSO4 8.6、Na2MoO4.H2O 0.25、CuSO4.5H2O 0.025、CoCl2.6H2O0.025、FeSO4.7H2O 27.8、Na2-EDTA.2H2O 37.3、肌醇100、烟酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2；
植物生长调节剂组成为：6-BA 0.5～2 + CPPU 0.1～1.0 + NAA 0.1～0.5，pH值为6.2；
（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的长有丛生芽的培养瓶表面用75%的酒精灭菌，打开培养瓶的瓶盖，将灭菌过的生根结鳞茎诱导剂加入培养瓶中，每瓶加入5～10 ml，培养55～65 d，丛生芽上每个小芽的基部都长有假鳞茎，形成丛生假鳞茎，根数为2～8条，可出瓶炼苗；
所述生根结鳞茎诱导剂由营养液和植物生长调节剂（单位为mg/L）两部分组成；
营养液组成为：KNO3 1000、CaCl2.H2O 440、MgSO4.7H2O 185、KH2PO4 170、KI 0.415、H3BO3 3.1、MnSO4.4H2O 11.15、ZnSO4 4.3、Na2MoO4.H2O 0.125、CuSO4.5H2O 0.0125、CoCl2.6H2O 0.0125、FeSO4.7H2O 13.9、Na2-EDTA.2H2O 18.65、肌醇 50、烟酸0.25、盐酸吡哆醇0.25、盐酸硫胺素0.05、甘氨酸1；
植物生长调节剂组成为：IBA 0.5～2.0 + IAA 0.1～1.0+KT 0.1～0.5，pH值为6.5。
2.根据权利要求1所述的白及组培苗一次性成苗的方法，其特征在于：步骤（2）所述增殖诱导剂中植物生长调节剂为：6-BA 1.0 mg/L+ CPPU 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L，pH值为6.2。
3.根据权利要求1所述的白及组培苗一次性成苗的方法，其特征在于：步骤（3）所述生根结鳞茎诱导剂中植物生长调节剂为： IBA 1.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L + KT 0.3 mg/L，pH值为6.5。
4.根据权利要求1所述的白及组培苗一次性成苗的方法，其特征在于：步骤（3）所述诱导假鳞茎培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃, 光照时间为14 h/d, 光照强度为2000 lx。
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