CN106577280B - 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，取驼峰藤幼嫩茎段及叶片作为外植体，消毒后接种到过渡培养基中，外植体在过渡培养基中培养一段时间，取未污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中诱导培养，诱导增殖，用增殖后的愈伤组织诱导不定芽；取未污染茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中诱导培养，再转接于不定芽增殖培养基中诱导增殖，将分化出的不定芽接种于生根壮苗培养基中培养。对不同外源植物生长调节剂种类、浓度、搭配比例进行优化选择，确定对驼峰藤愈伤组织、不定芽诱导及其再分化成苗的影响，筛选出诱导驼峰藤培养基的配方，该组培无性快繁，能保持母株优良遗传性状。这对于驼峰藤资源保存和药物及园林开发利用有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，属于稀有特有植物的组织培养技术，尤其涉及驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗方法。
背景技术
驼峰藤（Merrillanthus hainanensis）是萝藦科驼峰藤属国家二级保护植物，中国特有物种，具有观赏和药用价值。驼峰藤为木质藤本植物，叶对生、膜质、羽状脉，叶柄顶端具丛生小腺体，聚伞状花序，腋生，着花多朵；花梗细，长0.5～1.5 cm，基部着生有卵形的小苞片；花蕾圆球状，花冠裂片的顶端向内粘合；花萼裂片、卵圆形，长2 mm，宽1.5 mm，具缘毛，花萼内有5个小腺体；花冠黄色，辐状或近辐状，有脉纹，5裂至中部，裂片广卵形、钝头，略向右覆盖；副花冠5裂，肉质，着生于合蕊冠上，裂片卵形，背部隆起，腹部贴生在雄蕊上；花药顶端的透明膜片近卵形，覆盖着柱头；花粉块长圆形，下垂，顶端通过花粉块柄与着粉腺连结；子房无毛，柱头平扁，基部盘状；蓇葖单生，纺锤状，长9～112 cm，直径3.5～14 cm，外果皮黄色，无毛；种子近圆形，顶端具白色种毛，种毛长3.5～4 cm；花期3～4月，果期5～6月。驼峰藤生长于低海拔至中海拔山地林谷中，主要分布于高要、保亭、万宁和白沙等地，由于过去大力采伐天然林，致使驼峰藤天然族群量极稀少。
经查阅相关文献表明驼峰藤为中国特有物种，国内对驼峰藤的研究甚少，仅在《中国植物志》、《海南植物志》和《广东植物志》上有简单的形态学描述，除此之外便查阅不到其它研究资料和相关记载，也未查阅到国外的相关研究文献。
经查阅相关文献，目前国内外还未见有关驼峰藤组织培养、扦插等方面的报道。物种资源的保存与开发利用研究，越来越成为全球植物学者重要的课题，而驼峰藤作为中国特有物种，保护其物种资源意义深远。本发明探索出了利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖驼峰藤无菌苗的培养基配方及培养方法，具有一定的独创性和新颖性。
发明内容
本发明的目的是建立了一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗方法，从而不再单纯的依靠种子繁殖、扦插繁殖等传统繁育方式进行栽培。利用组培技术繁殖出的种苗最大限度的保持了母本的特性，同时可在短期内获得大量性状一致、脱毒的驼峰藤无菌苗，为野生驼峰藤资源的保护、群落的恢复和利用驼峰藤进行退耕还林、植树造林等提供了一种新的技术支撑。
本发明可通过以下技术实现：
1）外植体培育
驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理，待需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，作为外植体材料来源，外植体采集宜于在晴天的8:00~10:00进行。
2）无菌苗获取
剪取长势良好的驼峰藤嫩茎和叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm的茎段（仅取茎尖顶端前4节）、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将茎用无菌不锈钢刀片切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0 cm，下端切成楔形）；将消毒后的叶片切割成1 cm2左右，然后将切好的外植体接种到MS培养基中，培养15~20 d后挑取无污染的外植体诱导愈伤组织或不定芽。
3）叶片愈伤组织诱导
将过渡培养基中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，一周后可见米白色或鲜绿色愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中培养。
4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养25 d后，可见愈伤组织大量长出。
5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，15 d后产生两种不定芽，一种是长度大于1.0 cm的单芽，另一种是带有愈伤组织，长度小于1.0 cm的丛生芽；待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖培养基中培养。
6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.0 cm2左右，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养25 d后，可见不定芽大量长出。
5) 生根培养
选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养30 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h。
本发明在接种操作过程中，在进行愈伤组织诱导和增殖培养时，需要先将驼峰藤外植体横放在培养基上，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；在进行不定芽诱导和增殖培养时，需将驼峰藤茎段插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触，避免了因接种材料形状不规则与培养基接触不充分而造成生长不良或者死亡。
本发明的技术方案的有益效果，相对于传统的利用种子播种或扦插繁殖，具有以下优势：繁殖速度快，从外植体到成苗只需4个月左右；繁殖系数高，不定芽成指数增长；不受外界环境影响，四季均可进行种苗繁育；种苗稳定性好，性状分离或衰减的情况发生较少；种苗通过组培，全部为脱毒苗，病虫害少，利于高产；投资少，只需少量的原生外植体就可获得大量的无菌苗，经济效益高，可规模化种植，解决种苗来源这一瓶颈；组培苗的野生驯化栽培有利于野生居群的恢复，可遏制野生资源的掠夺性采挖，增加退耕还林、植树造林、园林绿化树种，可产生良好的经济、社会和生态效益。
具体实施方式
实施例1
本实施案例提供的一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的技术，含以下步骤：
（1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理；
（2）无菌苗获取：于晴天用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm左右的茎段（仅取茎尖顶端前4节）、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，浸泡期间要不时震荡，使外植体与消毒剂充分接触；然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分后用无菌不锈钢刀片将茎切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0 cm，下端切成楔形），然后接入到MS过渡培养基中，接种时茎段下端插入培养基中达0.5～1.0 cm；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的叶片接种到MS过渡培养基中，接种时轻压叶片，使之与培养基充分接触，培养15~20 d后挑取无污染的叶片外植体诱导愈伤组织，选取无污染的茎段诱导不定芽；
（3）叶片愈伤组织诱导：将步骤（2）中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；于温度为24～26℃、湿度为70～80%、光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照培养10～12 h，25天后可见鲜绿色愈伤组织从切口处长出，出愈率为93.3%，所诱导的愈伤组织颜色鲜绿，较紧密且有光泽，长势良好，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖。其中愈伤组织诱导培养基配方为：以MS培养基为基础培养基，在每升MS培养基添加3.0mg的6-BA、0.2 mg的KT、0.1 mg的NAA和30 g蔗糖、7 g卡拉胶，将愈伤组织诱导培养基标记为：MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，其中MS培养基根据教科书中的配方进行配制，每1升MS培养基的基本成分表如下表1所示：
表1每1升MS培养基的基本成分表
（4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入增殖分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，于温度为24～26 ℃，湿度为70～80%，光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照10～12 h，25 d后可见愈伤组织大量长出，且愈伤组织颜色鲜绿，表面颗粒状小球排列紧密，有萌动趋势，增殖率为290%，此时可剔除愈伤组织的褐化和死亡部分并切成1.0 cm2，接入到不定芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，愈伤组织增殖培养基为：每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.10 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，将愈伤组织增殖培养基标记为：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触。培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，无菌茎段培养35 d后可产生两种不定芽，一种是长度大于1.0 cm的单芽，另一种是带有愈伤组织、长度小于1.0 cm的丛生芽，不定芽诱导率为80%；叶片愈伤组织诱导的不定芽则为丛生芽，诱导率为76.8%，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖诱导培养基培养。其中，不定芽诱导培养基为：每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.1 mg的NAA、0.1 mg的GA3和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，将不定芽诱导培养基标记为：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+0.1 mg/L GA3+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.0 cm2左右，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见不定芽大量长出，且不定芽长势良好，粗细均匀，增值率为613%，适合大规模繁殖。其中，不定芽增殖培养基为：每升MS培养基添加3.5 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7g卡拉胶、30 g蔗糖，将不定芽增殖培养基标记为：MS+3.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（7）生根培养：选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养28 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养28天后，即可获得驼峰藤无菌苗，生根率为85.5%。其中，生根诱导培养基为：每升MS培养基添加0.3 mg的NAA和7 g卡拉胶、20 g蔗糖，将生根诱导培养基标记为：MS+ 0.3 mg/L NAA + 20 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶，MS的基本成分与表1中相同。
实施例2
本实施案例提供的一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的技术，含以下步骤：
（1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理；
（2）无菌苗获取：于晴天用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0 cm左右的茎段、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗30 min。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次；冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，浸泡期间要不时震荡，使外植体与消毒剂充分接触；然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分后用无菌不锈钢刀片将茎切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0cm，下端切成楔形），然后接入到MS过渡培养基中，接种时茎段下端插入培养基中达0.5～1.0cm；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的叶片接种到MS过渡培养基中，接种时轻压叶片，使之与培养基充分接触，培养15~20 d后挑取无污染的叶片外植体诱导愈伤组织，选取无污染的茎段诱导不定芽；
（3）叶片愈伤组织诱导：将步骤（2）中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；于温度为24～26℃、湿度为70～80%、光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照培养10～12 h，10天后可见嫩绿色愈伤组织从切口处长出，出愈率为80%，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖。其中愈伤组织诱导培养基配方为：以MS培养基为基础培养基，在每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.15 mg的KT、0.05 mg的NAA和30 g蔗糖、7 g卡拉胶，将愈伤组织诱导培养基标记为：MS+3.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L KT+0.05 mg/L NAA+7g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，其中MS培养基的基本成分见表1；
（4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入增殖分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，于温度为24～26℃，湿度为70～80%，光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照10～12 h，25 d后可见愈伤组织大量长出，且愈伤组织颜色鲜绿，表面颗粒状小球排列紧密，增殖率为250%；此时可剔除褐化和死亡部分并将愈伤组织切成1.0 cm2，接入到不定芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，愈伤组织增殖培养基为：每升MS培养基添加2.5 mg的6-BA、0.10 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，将愈伤组织增殖培养基标记为：MS+2.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触。培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，无菌茎段培养30 d后可产生两种不定芽，一种是长度大于1.0 cm的单芽，另一种是带有愈伤组织，长度小于1.0 cm的丛生芽，不定芽诱导率为66.7 %；叶片愈伤组织诱导的不定芽则为丛生芽，诱导率为66.7%，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖诱导培养基培养。其中，不定芽诱导培养基为：每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，将不定芽诱导培养基标记为：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.5 cm左右长的单芽，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养30d后，可见不定芽大量长出，且不定芽长势良好，粗细均匀，增值率为427%，适合大规模繁殖。其中，不定芽增殖培养基为：每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，将不定芽增殖培养基标记为：MS+3.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（7）生根培养：选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养31 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养28天后，即可获得驼峰藤无菌苗，生根率为80.5%。其中，生根诱导培养基为：每升MS培养基添加0.1 mg的NAA和7 g卡拉胶、20 g蔗糖，将生根诱导培养基标记为：MS+ 0.1 mg/L NAA + 20 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶，MS的基本成分与表1中相同。
实施例3
本实施案例提供的一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的技术，含以下步骤：
（1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理；
（2）无菌苗获取：于晴天用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm左右的茎段、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次；冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，浸泡期间要不时震荡，使外植体与消毒剂充分接触；然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分后用无菌不锈钢刀片将茎切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0cm，下端切成楔形），然后接入到MS过渡培养基中，接种时茎段下端插入培养基中达0.5～1.0 cm；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的叶片接种到MS过渡培养基中，接种时轻压叶片，使之与培养基充分接触，培养15~20 d后挑取无污染的叶片外植体诱导愈伤组织，选取无污染的茎段诱导不定芽；
（3）叶片愈伤组织诱导：将步骤（2）中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；于温度为24～26℃、湿度为70～80%、光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照培养10～12 h，25天后可见鲜绿色愈伤组织从切口处长出，出愈率为86.7%，所诱导的愈伤组织浅绿色，较紧密，长势良好，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖。其中愈伤组织诱导培养基配方为：以MS培养基为基础培养基，在每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.2 mg的KT、0.05 mg的NAA和30 g蔗糖、7 g卡拉胶，其中MS培养基的基本成分见表1；
（4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入增殖分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，于温度为24～26℃，湿度为70～80%，光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照10～12 h，27 d后可见愈伤组织大量长出，且愈伤组织颜色鲜绿，表面颗粒状小球排列紧密，有萌动趋势，增殖率为220%；此时可剔除褐化和死亡部分并将愈伤组织切成1.0 cm2，接入到不定芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，愈伤组织增殖培养基为：每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.10 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触。培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，无菌茎段培养15 d后可产生不定芽，不定芽诱导率为65.2%；叶片愈伤组织诱导的不定芽诱导率为60.8%，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖诱导培养基培养；其中，不定芽诱导培养基为：每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.05 mg的NAA、0.1 mg的GA3和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.5 cm左右长的单芽，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养30d后，可见不定芽大量长出，且不定芽长势良好，增值率为297%，适合大规模繁殖；其中，不定芽增殖培养基为：每升MS培养基添加2.5 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（7）生根培养：选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养30 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养28天后即可获得驼峰藤无菌苗，生根率为74.6%；其中，生根诱导培养基为：每升MS培养基添加0.5 mg的NAA和7 g卡拉胶、20 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同。
实施例4
本实施案例提供的一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的技术，含以下步骤：
（1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理；
（2）无菌苗获取：于晴天用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm左右的茎段、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min；冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，浸泡期间要不时震荡，使外植体与消毒剂充分接触；然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分后用无菌不锈钢刀片将茎切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0cm，下端长1.5～2.0 cm，下端切成楔形），然后接入到MS过渡培养基中，接种时茎段下端插入培养基中达0.5～1.0 cm；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的叶片接种到MS过渡培养基中，接种时轻压叶片，使之与培养基充分接触，培养15~20 d后挑取无污染的叶片外植体诱导愈伤组织，选取无污染的茎段诱导不定芽；
（3）叶片愈伤组织诱导：将步骤（2）中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；于温度为24～26℃、湿度为70～80%、光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照培养10～12 h，25天后可见鲜绿色愈伤组织从切口处长出，出愈率为73.3%，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖。其中愈伤组织诱导培养基配方为：以MS培养基为基础培养基，在每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.1 mg的KT、0.15 mg的NAA和30 g蔗糖、7 g卡拉胶，其中MS培养基的基本成分见表1；
（4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入增殖分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，于温度为24～26℃，湿度为70～80%，光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照10～12 h，25 d后可见愈伤组织大量长出，且愈伤组织颜色鲜绿，长势良好，增殖率为130%，此时可剔除褐化和死亡部分并将愈伤组织切成1.0 cm2，接入到不定芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，愈伤组织增殖培养基为：每升MS培养基添加1.5 mg的6-BA、0.10 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触。培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，无菌茎段培养15 d后可产生不定芽，不定芽诱导率为67.7%；叶片愈伤组织诱导的不定芽诱导率为56.7%，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖诱导培养基培养。其中，不定芽诱导培养基为：每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.15 mg的NAA、0.05mg的GA3和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.5 cm左右长的单芽，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养25d后，可见不定芽大量长出，且不定芽长势良好，增值率为210%。其中，不定芽增殖培养基为：每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（7）生根培养：选取高3~5 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养35 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养28天后，即可获得驼峰藤无菌苗，生根率为85.5%。其中，生根诱导培养基为：每升MS培养基添加0.3 mg的NAA和7 g卡拉胶、20 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同。
实施例5
本实施案例提供的一套利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的技术，含以下步骤：
（1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，并做好水肥和病虫害防治管理；
（2）无菌苗获取：于晴天用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm左右的茎段、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min；冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，浸泡期间要不时震荡，使外植体与消毒剂充分接触；然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分后用无菌不锈钢刀片将茎切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段（以腋芽着生点为基准，上端长约1.0cm，下端长1.5～2.0 cm，下端切成楔形），然后接入到MS过渡培养基中，接种时茎段下端插入培养基中达0.5～1.0 cm；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的叶片接种到MS过渡培养基中，接种时轻压叶片，使之与培养基充分接触，培养15~20 d后挑取无污染的叶片外植体诱导愈伤组织，选取无污染的茎段诱导不定芽；
（3）叶片愈伤组织诱导：将步骤（2）中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；于温度为24～26℃、湿度为70～80%、光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照培养10～12 h，25天后可见鲜绿色愈伤组织从切口处长出，出愈率为70%。其中愈伤组织诱导培养基配方为：以MS培养基为基础培养基，在每升MS培养基添加2 mg的6-BA、0.15 mg的KT、0.15 mg的NAA和30g蔗糖、7 g卡拉胶，其中MS培养基的基本成分见表1；
（4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入增殖分化培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，于温度为24～26℃，湿度为70～80%，光照强度为1800～2200 lx的培养室中每天光照10～12 h，30 d后可见愈伤组织大量长出，且愈伤组织颜色鲜绿，表面颗粒状小球排列紧密，有萌动趋势，增殖率为290%，此时可剔除褐化和死亡部分并将愈伤组织切成1 cm2，接入到不定芽诱导培养基中诱导不定芽。其中，愈伤组织增殖培养基为：每升MS培养基添加2.0 mg的6-BA、0.10 mg的NAA和7 g卡拉胶、30g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，无菌茎段培养15 d后可产生不定芽，不定芽诱导率为56.7%；叶片愈伤组织诱导的不定芽诱导率为76.8%。其中，不定芽诱导培养基为：每升MS培养基添加3.0 mg的6-BA、0.15mg的NAA、0.05mg的GA3和7g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽去除死亡的黑色或褐色组织并切成大小约为1.0 cm2，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中，达0.5～1.0 cm；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见不定芽大量长出，且不定芽长势良好，粗细均匀，增值率为1.8倍。其中，不定芽增殖培养基为：每升MS培养基添加1.5 mg的6-BA、0.15 mg的NAA和7 g卡拉胶、30 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同；
（7）生根培养：选取步骤（6）增殖产生的健康、完整、高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养30 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2200 lx，每天光照时间10～12 h。其中，生根诱导培养基为：每升MS培养基中添加有0.3 mg的NAA和7 g卡拉胶、20 g蔗糖，MS的基本成分与表1中相同。
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于如下步骤：
1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，作为外植体材料来源；
2）外植体的获取及消毒：于晴天剪取长势良好的驼峰藤嫩茎和叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm的茎段即仅取茎尖顶端前4节、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗干净，冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min， 冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将茎用无菌不锈钢刀片切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段，以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0cm，下端切成楔形；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，培养15~20 d后挑取无污染的外植体诱导愈伤组织或不定芽；
3）叶片愈伤组织诱导：将过渡培养基中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，一周后可见米白色或鲜绿色愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖；
4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见愈伤组织大量长出；
5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，15 d后产生两种不定芽，一种是长度大于1.0 cm的单芽，另一种是带有愈伤组织，长度小于1.0 cm的丛生芽，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖培养基中培养；
6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.0 cm2左右，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养15 d后，可见不定芽大量长出；
7）生根培养：选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养30 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h；所述的以下步骤中：
步骤2）中培养基为MS基本培养基，添加7 g/L卡拉胶、20 g/L的蔗糖，
步骤3）中愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.10 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.10~0.20 mg/L的KT、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，
步骤4）中愈伤组织增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.10 mg/L的NAA、1.0～2.5mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉胶，
步骤5）中不定芽诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.15 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.05~0.10 mg/L的GA3、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，
步骤6）中不定芽增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.15 mg/L的NAA、1.5～3.5 mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7g/L卡拉胶，
步骤7）中生根培养基以MS为基本培养基，添加0.1~0.5 mg/L的NAA、20 g/L的蔗糖、7g/L卡拉胶。
2.根据权利要求1所述的利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤2）中培养基为MS基本培养基，添加7 g/L卡拉胶、20 g/L的蔗糖，pH值为5.8，高压灭菌20 min。
3.根据权利要求1所述的一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤3）中愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.10 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.10~0.20 mg/L的KT、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，pH值为5.8，高压灭菌20 min。
4.根据权利要求1所述的一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤4）中愈伤组织增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.10 mg/L的NAA、1.0～2.5 mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉胶，pH值于常温下调整至5.8，高压灭菌20 min，接种时用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触。
5.根据权利要求1所述的一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤5）中不定芽诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.15 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6-BA、0.05~0.10 mg/L的GA3、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，pH值为5.8，高压灭菌20 min，接种时将茎段的下端插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触。
6.根据权利要求1所述的一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤6）中不定芽增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.15 mg/L的NAA、1.5～3.5mg/L的6-BA、30 g/L的蔗糖、7g/L卡拉胶，pH值于常温下调整至5.8，高压灭菌20 min，接种时将茎段的下端插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触。
7.根据权利要求1所述的一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于：步骤7）中生根培养基以MS为基本培养基，添加0.1~0.5 mg/L的NAA、20 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉胶，pH值于常温下调至5.8，高压灭菌20 min，接种时将茎段的下端插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触。
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Granted publication date: 20181228 Termination date: 20191213 |