CN108541593A - 白艿的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白艿的组织培养方法，包括：1）将白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌，接着置于抗生素溶液中进行二次灭菌，然后置于初代培养基中进行诱导培养、于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗；2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；3）将组织培养苗炼苗；其中，步骤1）‑2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；初代培养基为含有吲哚乙酸IAA、6‑苄基腺嘌呤6‑BA和核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有赤霉素、抗坏血酸、2,4‑D和香蕉泥的MS培养基；生根培养基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和苹果汁的1/2MS培养基。该白艿的组织培养方法具有优异的成活率以及繁殖率。

Description

白艿的组织培养方法
技术领域
本发明涉及组织培养，具体地，涉及一种白艿的组织培养方法。
背景技术
白艿是皮用于肤方面的中药，此药甘平，为外用中药；一般用于消肿生肌的像皮肤烧伤皮肤伤口组织流脓，胃内外出血及痈肿、烫伤、手足皲裂、肛裂、青春豆消炎等外用的。
白艿用种子播种较难，一般采用分块茎繁殖，但是分块茎进行繁殖往往会出现发芽率低和成活率低的缺陷，进而限制了白艿的繁殖。
发明内容
本发明的目的是提供一种白艿的组织培养方法，该白艿的组织培养方法具有优异的成活率以及繁殖率。
为了实现上述目的，本发明提供了一种白艿的组织培养方法，包括：
1）将白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌，接着置于抗生素溶液中进行二次灭菌，然后置于初代培养基中进行诱导培养、于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗；
2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
3）将组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；初代培养基为含有吲哚乙酸IAA、6-苄基腺嘌呤6-BA和核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有赤霉素、抗坏血酸、2,4-D和香蕉泥的MS培养基；生根培养基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和苹果汁的1/2MS培养基。
在上述技术方案中，本发明以白艿幼茎作为外植体，然后依次经过诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗以得到成熟的白艿苗，在各个培养工序中采用特定的培养基进而使得得到的白艿苗具有优异的成活率和高产率，在此基础上能够大面积的进行培育白艿，从而为白艿的组织培养的推广奠定了坚实的基础。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种白艿的组织培养方法，包括：
1）将白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌，接着置于抗生素溶液中进行二次灭菌，然后置于初代培养基中进行诱导培养、于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗；
2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
3）将组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；初代培养基为含有吲哚乙酸IAA、6-苄基腺嘌呤6-BA和核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有赤霉素、抗坏血酸、2,4-D和香蕉泥的MS培养基；生根培养基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和苹果汁的1/2MS培养基。
在上述组织培养方法中，各个培养基中的组分浓度可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的的成活率和繁殖效率，优选地，在初代培养基中，IAA的浓度为0.02-0.1mg/L，6-BA的浓度为0.3-0.7mg/L，核黄素的浓度为0.2-0.4mg/L；在增殖培养基中，赤霉素的浓度为0.1-0.17mg/L，抗坏血酸的浓度为0.25-0.5mg/L，2,4-D的浓度为0.15-0.35mg/L，香蕉泥的浓度为2-4mg/L；在生根培养基中，多效唑的浓度为0.08-0.12mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L，苹果汁的浓度为2.5-4g/L。
在本发明的各种培养基中，为了更好地为各个组织提供优异的养分以及适宜的培养条件，优选地，初代培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有8-10g/L的琼脂和15-20g/L的蔗糖，且pH值为6.0-7.0。
在本发明中，热处理脱菌的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高灭菌效果，优选地，热处理脱菌满足以下条件：脱菌温度为42-48℃，脱菌时间为3-6min。
在本发明中，二次灭菌的条件以及抗生素溶液中各组分的浓度也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高灭菌效果，优选地，二次灭菌满足以下条件：灭菌时间为15-25min，灭菌温度为15-35℃；抗生素溶液含有0.5-1g/L卡那霉素和0.6-0.9g/L庆大霉素。
在本发明中，外植体的大小可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，外植体的长度为0.25-0.35cm。
在本发明中，诱导培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，诱导培养满足以下条件：先暗培养1-2天，接着转入光暗交替的条件下培养4-6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为1400-1600lux，培养温度为25-30℃，相对湿度为50-60%。
在本发明中，增殖培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，增殖培养于光暗交替条件下培养8-10天，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为1700-1900lux，培养温度为20-25℃，相对湿度为50-60%。
在本发明中，生根培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，生根培养于光暗交替条件下培养10-15天，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为2000-2200lux，培养温度为20-25℃，相对湿度为50-60%。
在本发明中，无菌且透气条件的获取可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，步骤1）-2）中的无菌且透气条件通过以下操作获得：培养环境为带防菌透气膜的组培瓶；其中，透气膜的具体条件也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率，更优选地，透气膜至少满足以下条件：孔隙为0.2-0.3um，开孔率80-90﹪。
在本发明中，炼苗的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高白艿的成活率和繁殖效率，优选地，炼苗的条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，温度为21-23℃，相对湿度为75-85%，时间为5-7天。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。在以下实施例中，MS培养基以及1/2MS培养基的基本组分参见表1和2；其中，表1中为MS培养基以及1/2MS培养基中不同浓度组分的统计表，表2中为MS培养基以及1/2MS培养基中相同浓度组分的统计表。
表1
表2
实施例1
1）将长度为0.3cm的白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌（脱菌温度为46℃，脱菌时间为5min），接着置于抗生素溶液（含有0.8g/L卡那霉素和0.7g/L庆大霉素）中进行二次灭菌（灭菌时间为20min，灭菌温度为20℃），然后置于初代培养基中进行诱导培养（先暗培养1.5天，接着转入光暗交替的条件下培养5天；其中，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，光照强度为1500lux，培养温度为28℃，相对湿度为55%）、于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替条件下培养9天，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，光照强度为1800lux，培养温度为22℃，相对湿度为55%）得到分化幼苗；
2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替条件下培养13天，光暗交替条件为：光照时间为13h/天，光照强度为2100lux，培养温度为23℃，相对湿度为55%）以得到组织培养苗；
3）将组织培养苗炼苗得到白艿幼苗（光照时间为13h/天，黑暗时间为11h/天，光照强度为1900lux，温度为22℃，相对湿度为79%，时间为6天）；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.25um，开孔率85﹪；初代培养基为含有0.08mg/L IAA、0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有0.15mg/L 赤霉素、0.4mg/L抗坏血酸、0.25mg/L 2,4-D的浓度为、3mg/L香蕉泥的MS培养基；在生根培养基中，0.09mg/L多效唑、0.2mg/L IBA的浓度、3g/L苹果汁的1/2MS培养基；初代培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有9g/L的琼脂和18g/L的蔗糖，且pH值为6.5。
实施例2
1）将长度为0.25cm的白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌（脱菌温度为42℃，脱菌时间为6min），接着置于抗生素溶液（含有0.5g/L卡那霉素和0.6g/L庆大霉素）中进行二次灭菌（灭菌时间为15min，灭菌温度为35℃），然后置于初代培养基中进行诱导培养（先暗培养1天，接着转入光暗交替的条件下培养4天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，光照强度为1400lux，培养温度为25℃，相对湿度为50%）、于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替条件下培养8天，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，光照强度为1700lux，培养温度为20℃，相对湿度为50%）得到分化幼苗；
2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替条件下培养10天，光暗交替条件为：光照时间为12h/天，光照强度为2000lux，培养温度为20℃，相对湿度为50%）以得到组织培养苗；
3）将组织培养苗炼苗得到白艿幼苗（光照时间为12h/天，黑暗时间为10h/天，光照强度为1800lux，温度为21℃，相对湿度为75%，时间为5天）；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.25um，开孔率85﹪；初代培养基为含有0.02mg/L IAA、0.3mg/L 6-BA、0.2mg/L核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有0.1mg/L 赤霉素、0.25mg/L抗坏血酸、0.15mg/L 2,4-D的浓度为、2mg/L香蕉泥的MS培养基；在生根培养基中，0.08mg/L多效唑、0.1mg/L IBA的浓度、2.5g/L苹果汁的1/2MS培养基；初代培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有8g/L的琼脂和15g/L的蔗糖，且pH值为6.0。
实施例3
1）将长度为0.35cm的白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌（脱菌温度为48℃，脱菌时间为3min），接着置于抗生素溶液（含有1g/L卡那霉素和0.9g/L庆大霉素）中进行二次灭菌（灭菌时间为25min，灭菌温度为35℃），然后置于初代培养基中进行诱导培养（先暗培养2天，接着转入光暗交替的条件下培养6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，光照强度为1600lux，培养温度为30℃，相对湿度为60%）、于增殖培养基中进行增殖培养（于光暗交替条件下培养10天，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，光照强度为1900lux，培养温度为25℃，相对湿度为60%）得到分化幼苗；
2）将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养（于光暗交替条件下培养15天，光暗交替条件为：光照时间为14h/天，光照强度为2200lux，培养温度为25℃，相对湿度为60%）以得到组织培养苗；
3）将组织培养苗炼苗得到白艿幼苗（光照时间为14h/天，黑暗时间为12h/天，光照强度为2000lux，温度为23℃，相对湿度为85%，时间为7天）；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气，于带防菌透气膜的组培瓶中进行，透气膜满足以下条件：孔隙为0.25um，开孔率85﹪；初代培养基为含有0.1mg/LIAA、0.7mg/L 6-BA、0.4mg/L核黄素的MS培养基；增殖培养基为含有0.17mg/L 赤霉素、0.5mg/L抗坏血酸、0.35mg/L 2,4-D的浓度为、4mg/L香蕉泥的MS培养基；在生根培养基中，0.12mg/L多效唑、0.3mg/L IBA的浓度、4g/L苹果汁的1/2MS培养基；初代培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有10g/L的琼脂和20g/L的蔗糖，且pH值为7.0。
应用例1
取上述各实施例中100株的炼苗后的幼苗于基质中进行培养直至50%以上的植株生长出5个叶片，然后统计幼苗的成活率（W），同时计算10个3cm的白艿幼茎在一个组织培养周期后能够获取的成活白艿的数量（N），具体结果如表3所示。
表3
W/% N/棵
实施例1 96 65
实施例2 93 70
实施例3 94 61
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种白艿的组织培养方法，其特征在于，包括：
1）将白艿幼茎作为外植体进行热处理脱菌，接着置于抗生素溶液中进行二次灭菌，然后置于初代培养基中进行诱导培养、于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗；
2）将所述分化幼苗于生根培养基中进行生根培养以得到组织培养苗；
3）将所述组织培养苗炼苗；
其中，步骤1）-2）的培养条件均至少符合以下条件：无菌且透气；所述初代培养基为含有吲哚乙酸IAA、6-苄基腺嘌呤6-BA和核黄素的MS培养基；所述增殖培养基为含有赤霉素、抗坏血酸、2,4-D和香蕉泥的MS培养基；所述生根培养基含有多效唑、吲哚丁酸IBA和苹果汁的1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，在所述初代培养基中，所述IAA的浓度为0.02-0.1mg/L，所述6-BA的浓度为0.3-0.7mg/L，所述核黄素的浓度为0.2-0.4mg/L；
在所述增殖培养基中，所述赤霉素的浓度为0.1-0.17mg/L，所述抗坏血酸的浓度为0.25-0.5mg/L，所述2,4-D的浓度为0.15-0.35mg/L，所述香蕉泥的浓度为2-4mg/L；
在所述生根培养基中，所述多效唑的浓度为0.08-0.12mg/L，所述IBA的浓度为0.1-0.3mg/L，所述苹果汁的浓度为2.5-4g/L。
3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养基、增殖培养基以及生根培养基均含有8-10g/L的琼脂和15-20g/L的蔗糖，且pH值为6.0-7.0。
4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述热处理脱菌满足以下条件：脱菌温度为42-48℃，脱菌时间为3-6min。
5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述二次灭菌满足以下条件：灭菌时间为15-25min，灭菌温度为15-35℃；
所述抗生素溶液含有0.5-1g/L卡那霉素和0.6-0.9g/L庆大霉素。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，所述外植体的长度为0.25-0.35cm。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，所述诱导培养满足以下条件：先暗培养1-2天，接着转入光暗交替的条件下培养4-6天；其中，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为1400-1600lux，培养温度为25-30℃，相对湿度为50-60%。
8.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，所述增殖培养于光暗交替条件下培养8-10天，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为1700-1900lux，培养温度为20-25℃，相对湿度为50-60%。
9.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养于光暗交替条件下培养10-15天，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，光照强度为2000-2200lux，培养温度为20-25℃，相对湿度为50-60%。
10.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法，其特征在于，步骤1）-2）中的无菌且透气条件通过以下操作获得：培养环境为带防菌透气膜的组培瓶；
优选地，透气膜至少满足以下条件：孔隙为0.2-0.3um，开孔率80-90﹪；
更优选地，所述炼苗的条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为1800-2000lux，温度为21-23℃，相对湿度为75-85%，时间为5-7天。
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