CN106171970A - 一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法 - Google Patents

一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法，以液体二氧化氯作为消毒剂在室温下实现对低酚类含量植物培养基营养成分和激素表面微生物的彻底灭活、消毒，快速获得无菌培养基。所述的低酚类含量植物包括半夏、白芨、瓜蒌、水稻、酸浆、烟草等。本发明可缩短培养基配制时间、大幅降低能耗费用、对培养容器材质无特殊需求，培养基容器中消毒剂二氧化氯的消毒作用可持续3周左右，消毒时间由传统高温高压灭菌的20～30分钟延长至约20天，适用于低酚类含量植物的组织培养尤其是大规模快速繁殖产业。

Description

一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养技术领域，更确切地说涉及一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法。
背景技术：
自20世纪30年代美国植物生理学家White建立第一个已知成分的人工合成培养基以来，植物组织培养技术迅速发展并广泛应用于植物快速繁殖、基因功能验证及分子育种等领域。组织培养技术是利用细胞的全能性，将细胞或器官培育成完整植株的过程。在离体条件下，细胞或器官的培养必须在无菌环境下进行。因此，培养基必须经过严格的消毒以保持无菌环境。
目前，培养基消毒主要通过高温高压灭菌法(压力102.9kPa，温度121～126℃，维持20～30分钟)完成。该灭菌方法依然存在如下弊端：(1)高温高压灭菌消耗电能占整个培养基配制成本(包括试剂、耗能和人员费)的50％左右；(2)大幅增加了培养基制备时长，整个灭菌时间从升温开始至降到安全温度需1～2小时，大型灭菌器所耗时间更长；(3)灭菌后容器内壁和培养基表面存在蒸汽冷凝水，通常需在无菌通风条件下1～2天以上待水分挥发至干；(4)高温高压灭菌过程中某些培养基成分可能发生反应或降解，导致某些元素含量不足甚至缺乏，同时可能生产一些无益甚至有害的物质，如FeNa-EDTA在高温灭菌过程中可能催化蔗糖产生醛类或酚类物质，影响植物生长；(5)该灭菌方法对培养基容器材质选择性较强，并且经过几次灭菌后容器透光度会显著降低，影响培养效果，而透光性较好的PVC-聚氯乙烯等材质通常不能进行高温高压灭菌，需采用环氧乙烷灭菌，一次性用后扔弃，致使价格昂贵且造成巨大浪费。此外，在不具备灭菌锅等仪器设备及条件的基层机构，尤其是大规模组织培养脱毒领域，难以实现无菌培养基的配制与操作。
探索其他灭菌方法替代高温高压灭菌法成为植物组织培养领域的研究热点之一。Thepsithar等(2013)以植物精油对菊花培养基进行灭菌并成功用于组织培养研究。专利CN104307007A公布了一种工厂化生产组培苗培养基快速灭菌的方法，以通过在培养基中添加臭氧达到灭活微生物的目的。然而，至今尚无一种方法能取代高温高压灭菌的效果。
二氧化氯是一种新型的对环境无害的消毒剂，在使用过程中不会产生毒性物质。二氧化氯已被广泛应用于自来水消毒、农产品保鲜和空气消毒等诸多领域。发明人评价了液体二氧化氯在植物外植体消毒上的应用，发现二氧化氯能有效杀灭植物外植体表面的微生物，但灭菌处理后外植体活性与植物内源酚类物质含量有关；二氧化氯消毒处理外植体后，低酚含量植物外植体生长良好，而高酚含量植物外植体迅速死亡。上述二氧化氯的广泛应用表明了其杀灭不同来源和种类微生物的有效性，也揭示了其应用于组成成分较为复杂的低酚类含量植物培养基灭菌的可能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法，缩短培养基配制时间、大幅降低能耗费用。
本发明所采用的技术方案是：以液体二氧化氯作为消毒剂在室温下实现对低酚类含量植物培养基营养成分和激素表面微生物的彻底灭活、消毒，快速获得无菌培养基。
其包括如下步骤：
(1)制备二氧化氯溶液：
采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应实现二氧化氯的快速制备，不需要二氧化氯发生器。称取1.5g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50mL去离子水，待其完全溶解后，加入5mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450mL去离子水，混匀即获得1000mg/L二氧化氯水溶液。使用前根据需要将其稀释10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍至所需浓度。
(2)称取适量植物MS培养基成分及激素置于步骤(1)所制备的1～100mg/L二氧化氯水溶液，加入1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，同时加热10分钟至培养基温度为50～60℃。
(3)将凝固剂琼脂或植物凝胶于微波炉或电炉加热至完全溶解清澈。
(4)将步骤(2)的培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH至5.8～6.0，用培养基分装容器分装冷却后即可使用。
所述的低酚类含量植物包括半夏、白芨、瓜蒌、水稻、酸浆、烟草等对二氧化氯有较好耐受性的植物。
所述的培养基分装容器可为不耐高温高压灭菌但透光性好材质的器皿。培养基配制完成后容器及培养基表面不会产生蒸汽水，可立即使用。
所述的MS培养基包括1900mg/L硝酸钾、1，650mg/L硝酸铵、170mg/L磷酸二氢钾、370mg/L七水硫酸镁、440mg/L二水氯化钙、27.85mg/L七水硫酸铁、37.25mg/L乙二胺四乙酸二钠、22.3mg/L四水合硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.025mg/L五水硫酸铜、0.25mg/L二水合钼酸钠、0.025mg/L六水氯化钴、2.0mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：不需要高温高压灭菌锅、缩短培养基配制时间、大幅降低能耗费用、对培养容器材质无特殊需求，培养基容器中消毒剂二氧化氯的消毒作用可持续3周左右，消毒时间由传统高温高压灭菌的20～30分钟延长至约20天，长势优于高温高压灭菌培养基，适用于低酚类含量植物的组织培养尤其是大规模快速繁殖产业。
附图说明
图1是三种培养基对照照片，均为配制10天后拍摄。图1中A为传统高温高压灭菌培养基；B为10mg/L二氧化氯消毒配制培养基；C为去离子水配制培养基。
图2是二氧化氯消毒培养基诱导半夏离体块茎照片。
图3是二氧化氯消毒培养基诱导半夏再生芽照片。
图4是二氧化氯消毒培养基对半夏生根的影响照片。
图5是二氧化氯消毒培养基再生后移栽成活的半夏植株照片。
图6是二氧化氯消毒培养基诱导白芨离体块茎照片。
图7是二氧化氯消毒培养基诱导白芨再生芽照片。
图8是二氧化氯消毒培养基诱导瓜蒌愈伤组织照片。
图9是二氧化氯消毒培养基诱导瓜蒌再生芽照片。
图10是二氧化氯消毒培养基诱导瓜蒌再生芽生根照片。
图11、12是二氧化氯消毒培养基培养瓜蒌再生植株移栽成活照片。
具体实施方式
实施例一 二氧化氯制备及其对培养基的消毒效果
采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应实现二氧化氯的快速制备。适用化学方程式为：5NaClO+4HCl＝4ClO2+5NaCl+2H2O。
称取1.5g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50mL去离子水，待其完全溶解后，加入5mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450mL去离子水，混匀即获得1000mg/L二氧化氯水溶液。临用前将其稀释10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍等供试浓度即可。
称取适量植物MS培养基成分、激素置于所配制培养基体积60％的1～100mg/L二氧化氯水溶液，加入1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，同时加热10分钟至培养基温度为50～60℃。将凝固剂琼脂或植物凝胶溶于所配制培养基体积40％的相应浓度二氧化氯水溶液，微波炉或电炉加热至完全溶解清澈，调节pH值至5.8～6.0。将培养基成分与溶解的凝固剂混匀，分装冷却后即可使用。同时制备不含二氧化氯的高温高压消毒的培养基和未经二氧化氯消毒也不经高温高压消毒培养基。
结果发现，如图1所示，室温条件7天后，1～100mg/L二氧化氯消毒培养基即图1的B和高温高压灭菌消毒培养基即图1的A未出现污染情况，而未经灭菌培养基即图1的C则严重污染。同时，如图1的A所示高温高压灭菌培养瓶壁有大量蒸汽水分，而如图1的B所示二氧化氯消毒培养基瓶壁和表面均较为干燥。表明1～100mg/L二氧化氯能较好实现培养基的测定消毒。
实施例二 半夏再生培养基配制及培养
取室外种植半夏叶柄，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后剪成约1cm长，插入实施例一配制的培养基。在25±1℃条件下培养，15天后成功诱导离体块茎(图2)，诱导率为100％。在超净台内将离体块茎，接种至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即长出嫩芽(图3)，出芽率为100％。将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根(图4)，生根率为100％。待根长至约3cm长时即可移栽(图5)。
实施例三 白芨再生培养基配制及培养
取室外种植白芨幼苗，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后接种至实施例一配制的培养基。在25±1℃条件下培养，15天后长出丛生芽(图6)，诱导率为100％。在超净台内将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根(图7)，生根率为100％。
实施例四 瓜蒌再生培养基配制及培养
取室外种植瓜蒌幼茎，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10～25mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后剪成约1cm长段，接入实施例一配制的培养基。在25±1℃条件下培养，15天后成功诱导愈伤组织(图8)，诱导率为100％。在超净台内将愈伤组织接种至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L呋喃甲基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养15天后即长出嫩芽(图9)，出芽率为46％。将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根(图10)，生根率为100％。待根长至约5cm长时即可移栽(图11，图12)。

Claims (6)

1.一种低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于：以液体二氧化氯作为消毒剂在室温下实现对低酚类含量植物培养基营养成分和激素表面微生物的彻底灭活、消毒，快速获得无菌培养基。
2.如权利要求1所述的低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备二氧化氯溶液：称取1.5g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50mL去离子水，待其完全溶解后，加入5mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450mL去离子水，混匀即获得1000mg/L二氧化氯水溶液；使用前根据需要将其稀释10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍至所需浓度；
(2)称取适量植物MS培养基成分及激素置于步骤(1)所制备的1～100mg/L二氧化氯水溶液，加入1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，同时加热10分钟至培养基温度为50～60℃；
(3)将凝固剂琼脂或植物凝胶于微波炉或电炉加热至完全溶解清澈；
(4)将步骤(2)的培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH至5.8～6.0，用培养基分装容器分装冷却后即可使用。
3.如权利要求1所述的低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于：所述的低酚类含量植物包括半夏、白芨、瓜蒌、水稻、酸浆、烟草。
4.如权利要求3所述的低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于：取室外种植半夏叶柄，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后剪成约1cm长，插入权利要求1或2配制的培养基；在25±1℃条件下培养，15天后成功诱导离体块茎，诱导率为100％；在超净台内将离体块茎，接种至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即长出嫩芽，出芽率为100％；将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根，生根率为100％。
5.如权利要求3所述的低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于：取室外种植白芨幼苗，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后接种至权利要求1或2配制的培养基；在25±1℃条件下培养，15天后长出丛生芽，诱导率为100％；在超净台内将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根，生根率为100％。
6.如权利要求3所述的低酚类含量植物培养基的快速制备方法，其特征在于：取室外种植瓜蒌幼茎，自来水冲洗1小时后于超净工作台内用10～25mg/L二氧化氯消毒20分钟，吸干水分后剪成约1cm长段，接入权利要求1或2配制的培养基；在25±1℃条件下培养，15天后成功诱导愈伤组织，诱导率为100％；在超净台内将愈伤组织接种至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L呋喃甲基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养15天后即长出嫩芽，出芽率为46％；将嫩芽转至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，25±1℃条件下培养10天后即可生根，生根率为100％。
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