CN106550875B - 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106550875B
CN106550875B CN201611037075.2A CN201611037075A CN106550875B CN 106550875 B CN106550875 B CN 106550875B CN 201611037075 A CN201611037075 A CN 201611037075A CN 106550875 B CN106550875 B CN 106550875B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
seedling
rouge radish
medium
illumination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201611037075.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106550875A (zh
Inventor
陈发波
刘毅
杨柳
杨帆
汪继华
陈平
徐利婷
李春柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangtze Normal University
Original Assignee
Yangtze Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangtze Normal University filed Critical Yangtze Normal University
Priority to CN201611037075.2A priority Critical patent/CN106550875B/zh
Publication of CN106550875A publication Critical patent/CN106550875A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106550875B publication Critical patent/CN106550875B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供用于胭脂萝卜组织培养的MS培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，MS培养基的组分包括NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H2BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·5H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2‑EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、甘氨酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。丛生芽培养基在MS培养基的基础上组分还包括6‑BA、NAA、2,4‑D、TDZ、KT、蔗糖和琼脂。所述方法步骤包括无菌外植体的获取、初代培养、继代培养、壮苗培养、生根培养及炼苗移栽。

Description

用于胭脂萝卜组织培养的MS培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜 的组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及用于胭脂萝卜组织培养的MS培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
胭脂萝卜系十字花科（Brassicaceae）萝卜属（Raphanus）二年生蔬菜作物，又名涪陵红心萝卜，是重庆市涪陵特产，质地致密，心皮全红，以其肉质根为原料提取的天然萝卜红色素含量、品质和溶解性均优于其它红萝卜，色价远高于国家标准水平，在食品、酒类、饮料和化妆品领域有着广阔的应用前景。
当前胭脂萝卜以有性繁殖为主，内生病菌感染严重，产量低，品种退化，导致萝卜红色素生产供应不足，而目前胭脂萝卜红色素合成分子机理尚不清楚。因此，需要寻找一种保持优良性状、快速而适合于胭脂萝卜繁殖的方法。然而当前还未见有对胭脂萝卜组织培养相关的研究报道。与此同时，现有的组织培养用培养基并不适用于胭脂萝卜的组织培养，不能诱导萝卜产生愈伤组织和丛生芽，在萝卜组织培养方面存在着繁殖系数低、生根率低、叶片再生困难等问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：针对现有胭脂萝卜以有性繁殖为主，萝卜组织培养方面存在着繁殖系数低、生根率低、叶片再生困难的不足之处，而提供一种繁殖速度快、变异率低、能保持胭脂萝卜优良性状的用于胭脂萝卜组织培养的MS培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于胭脂萝卜组织培养的MS培养基，所述MS培养基的溶剂为水，溶质的组分包括MS无机物和MS有机添加物；每升所述MS培养基中包括如下组分含量的MS无机物：NH4NO3 1320~1980mg、KNO3 1520~2280mg、CaCl2·2H2O 352~528mg、MgSO4·7H2O 298~442mg、KH2PO4 136~204mg、KI 0.664~0.996mg、H2BO3 4.96 ~6.4mg、MnSO4·4H2O 17.84~26.76mg、ZnSO4·7H2O 6.88 ~10.32mg、Na2MoO4·5H2O0.20~0.30mg、CuSO4·5H2O 0.02 0~0.030mg、CoCl2·6H2O 0.025 ~0.030mg、FeSO4·7H2O 22.24~33.40mg和Na2-EDTA·2H2O 29.84~44.76mg；每升所述MS培养基中包括如下组分含量的MS有机添加物：肌醇80 ~120mg、烟酸0.4 ~0.6mg、甘氨酸1.6~2.4mg、盐酸吡哆醇0.4~0.6mg和盐酸硫胺素0.08~0.12mg。本发明针对萝卜组织培养难以形成愈伤组织，不容易生芽，现有的MS培养基中成分和各成分的浓度难以诱导萝卜产生愈伤组织、诱导出芽率较低的技术问题，而提供了一种胭脂萝卜组织培养用MS培养基，具体地，本发明MS培养基中矿质营养元素的种类选择更加适合于胭脂萝卜生长，更能保证萝卜组织生长需求，且本发明MS培养基中通过氮、磷、钾、钴、维生素之间的协同配伍作用，能够满足胭脂萝卜在营养上和生理上对细胞脱分化的要求，为胭脂萝卜愈伤组织产生提供能量，能够促进加速胭脂萝卜愈伤组织的生长，采用本发明MS培养基对多种分类的胭脂萝卜都具有愈伤组织诱导效果，解决了现有MS培养基不能够使胭脂萝卜产生愈伤组织的技术问题。
进一步，每升所述MS培养基中包括如下组分含量的MS无机物：NH4NO3 1650 mg、KNO3 1900 mg、CaCl2·2H2O 440 mg、MgSO4·7H2O 370 mg、KH2PO4 170 mg、KI 0.83 mg、H2BO3 6.2 mg、MnSO4·4H2O 22.3 mg、ZnSO4·7H2O 8.6 mg、Na2MoO4·5H2O 0.25 mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025 mg、FeSO4·7H2O 27.8 mg和Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg；每升所述MS培养基中包括如下组分含量的MS有机添加物：肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、甘氨酸2 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.4 mg。采用这样优选方案的MS培养基，能够更加满足胭脂萝卜生长所需要的营养元素要求，能够更加促进愈伤组织的产生，使产生的愈伤组织更容易被诱导产生丛生芽，保证了胭脂萝卜的后续组织培养顺利进行。
一种胭脂萝卜组织培养用丛生芽诱导培养基，所述丛生芽诱导培养基为所述MS培养基+2~6 mg/L 6-BA+0.05~0.2 mg/L NAA+0.05~0.2 mg/L 2,4-D+0.5~3 mg/L TDZ+0.05~0.2 mg/L KT+20~30 g/L 蔗糖+6~8 g/L 琼脂，培养基pH值为5.8~6.2。本发明采用上述MS培养基作为基本培养基，并辅以其他细胞分裂素、生长类物质或营养物质的作用，特别是通过6-BA、NAA和TDZ成分含量之间的协同配伍作用，诱导愈伤组织产生丛生芽，诱导时间短，仅2~4周即可从茎尖诱导形成丛生芽，诱导效率高达95%。
一种胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，先将预处理并灭菌后的胭脂萝卜种子接种于无菌苗培养基上诱导培养获得无菌苗，取无菌苗的茎尖接种于上述丛生芽诱导培养基上进行初代培养诱导产生丛生芽，对丛生芽接种于继代增殖培养基上进行继代培养获得增殖苗，将增殖苗壮苗分离成单苗后转接于壮苗培养基上壮苗培养得到健壮苗，将健壮苗转移到生根培养基上培养获得生根幼苗，对生根幼苗进行练苗处理后，将幼苗移栽到土壤中进行繁殖，获得胭脂萝卜；其中，所述无菌苗培养基、继代增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基的组分中均包括上述MS培养基。
本发明采用丛生芽途径进行胭脂萝卜的组织培养，先以预处理和灭菌后的胭脂萝卜种子作为组织培养的原材料，然后将种子接种于以上述MS培养基为主要组分的无菌苗培养基上，使胭脂萝卜在该培养基上脱分化诱导产生愈伤组织无菌苗，随后将无菌苗的茎尖接种于上述丛生芽诱导培养基上，在丛生芽诱导培养基中生长素和细胞分裂素的协同配伍作用下诱导产生丛生芽，继而将丛生芽接种于继代增殖培养基上继代增殖培养产生大量增殖苗，为了避免多代增殖后苗短小、细弱，生根培养成活率不高的问题，本发明选取增殖苗中生长较好的壮苗接种于壮苗培养基上进行壮苗处理，将得到的健壮苗转移到生根培养基上在培养基上诱导生根，扩大根系的吸收面积，增强根系的吸收能力，减少试管苗对异养条件的依赖提高后续移栽成活率，对生根后的苗进行练苗处理，增强试管苗对外界生长环境的适应能力和抵抗能力，而后将练苗后的苗移栽到土壤中进行繁殖，完成对胭脂萝卜的组织培养快速繁殖。本发明胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法繁殖系数高，繁殖速度快，能够保证胭脂萝卜的优良性状，变异率低。
进一步，所述预处理为将胭脂萝卜种子在20~25℃下浸泡12~24 h；所述灭菌为将预处理后的胭脂萝卜种子置于超净工作台上，先用体积浓度为70~75%的乙醇水溶液处理20~30s，然后用无菌水清洗至少2次，再用质量浓度为0.1~2%的升汞溶液灭菌处理10~15 min，最后用无菌水洗涤至少4次。本发明采用这样的预处理方法，可以使胭脂萝卜种子全部浸透，促进种子发芽整齐，提高种子的发芽率，采用这样的灭菌方法对胭脂萝卜种子进行灭菌处理，避免了种子因染菌而导致的后期无法培养，影响培养效果的问题。
作为优化，所述继代增殖培养基为上述MS培养基+2~4mg/L 6-BA+0.2~10mg/L NAA+0.05~0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20~30g/L 蔗糖+6~8g/L 琼脂，培养基pH值为5.8~6.2。采用这样的继代增殖培养基能够促进丛生芽快速繁殖，培养基增殖率可达100%，平均增殖系数为8，繁殖系数高，繁殖速度快。
作为又一优化，所述无菌苗培养基为1/2 上述MS培养基+6~8g/L琼脂，pH值调至5.8~6.2；所述壮苗培养基为上述MS培养基+0.5~1.5g/L AC+2~6mg/L 6-BA +0.1~0.2mg/LNAA+0.05~0.1mg/L 2,4-D+0.5~3mg/L TDZ+0.05~0.2mg/L KT+20~30g/L蔗糖+6~8g/L琼脂，培养基pH值为5.8~6.2；所述生根培养基为上述MS培养基+0.5~1.5g/L活性炭+0.1~0.5mg/LNAA+6~8g/L琼脂+20~30g/L蔗糖。采用这样优选的无菌苗培养基、壮苗培养集和生根培养基可以更好地促进种子诱导产生无菌苗，得到的更优良的健壮苗，使健壮苗生根效果更好，可以使生根率达90%，使生根后的健壮苗移栽后移栽效果更好。
作为再一优化，接种于无菌苗培养基上诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度2000~4000Lx，光照时间为12~16h/d的条件下培养4~8d；所述初代诱导培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度2000~4000Lx，光照时间为14~18h/d的条件下培养2~4周；所述继代培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下培养；所述壮苗培养为在培养温度为25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度2000~3000Lx，光照时间为14~16h/d的条件下培养2~3周；所述生根培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000~4000Lx，光照时间为14~16h/d的条件下培养2-4周。分别采用这样的培养条件，可以综合保证胭脂萝卜的组织培养效果更佳，组织培养繁殖周期短，仅30天就可以获得大量的丛生芽，以该方法扩繁出的胭脂萝卜小植株生长健壮、生长能力强。
进一步，所述练苗处理为移栽到土壤中繁殖2周前将生根幼苗置于光照培养箱上，在环境温度为25±2℃，湿度为70％~90％，光照强度3000~4000Lx，光照时间为14~16h/d条件下进行过渡锻炼，移栽到土壤中繁殖1周前，对生根幼苗进行开瓶锻炼，首先松盖1~2d，然后开盖1~2d，最后将盖揭去，让瓶苗逐步适应外界的光照和湿度。采用这样的放风、控制湿度、控制温度的练苗处理方法对幼苗进行锻炼，可以使试管苗幼苗逐步适应外界生长环境，使其定植后能够迅速适应陆地土壤的不良环境条件，缩短缓苗时间，增强对低温、大风等抵抗能力。
再进一步，将幼苗移栽到土壤中进行繁殖为先用清水清洗去除练苗处理后幼苗根部的培养基，再用质量浓度为0.1~1%的高锰酸钾溶液浸根处理3~5 min，待根部表面水分晾干后，将幼苗移栽到消毒的营养土中环境适应培养1~2周，再将环境适用后的幼苗定植于大田或栽植盆的土壤中进行繁殖。采用这样的移栽方法，可以使移栽后的幼苗生长状况更好，扩繁出的胭脂萝卜小植株生长健壮、生长能力强。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：采用本发明培养基和组织培养方法，解决了胭脂萝卜组织培养过程中难以产生愈伤组织，难以诱导愈伤组织生成丛生芽的技术问题，本发明培养基能够满足胭脂萝卜在营养上和生理上对细胞脱分化的要求，促进胭脂萝卜愈伤组织的生长，诱导愈伤组织产生丛生芽，诱导率达95%，增殖率达100%，平均增殖系数为8，生根率为90%。采用本发明方法组织培养繁殖周期短，仅30天就可以获得大量的丛生芽，以该方法扩繁出的胭脂萝卜小植株生长健壮、生长能力强。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法包括步骤：无菌外植体的获取、初代培养、继代培养、壮苗培养、生根培养及炼苗移栽。本发明以胭脂萝卜茎尖为外植体，具有材料易得、操作简便、变异率低、繁殖快速的特点，其突出优势在于丛生芽诱导快速且诱导率高、外植体幼嫩少病毒、操作简单、易行。
具体地，本实施例选用‘红心1号’、‘红心2号’、‘胭脂红1号’胭脂萝卜进行组织培养，下述实施例所述胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法的主要仪器设备、培养基配制及操作步骤如下：
1、仪器设备：
蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯、电子天平、超净工作台、冰箱、天平、电磁炉、培养瓶、不锈钢接种盘、手术接种剪、直镊、枪型接种镊、手术刀柄等。
2、试剂配制：
（1）75%的酒精：75ml的95%的酒精加水定容至95ml。
（2）0.1％的升汞溶液：称取1克HgCl2，加蒸馏水至1000ml。
（3）1mol/L HCI：取8.25ml的浓盐酸，加蒸馏水定容至100ml。
（4）1mol/L NaOH：称8g NaOH，用蒸馏水定容至200ml。
3、培养基配制：
（1）组织培养的基本培养基(MS)
MS无机物：每升培养基含NH4NO3 1650mg,KNO3 1900mg,CaCl2·2H2O 440mg,MgSO4·7H2O 370mg，KH2PO4 170mg，KI 0.83mg，H2BO3 6.2mg，MnSO4·4H20 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·5H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg。
MS有机添加物：每升培养基含肌醇100mg，烟酸0.5mg，甘氨酸2mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5mg，盐酸硫胺素（维生素B1）0.4mg。
表1 MS培养基
成分 1L培养基含量/mg
无机物成分：
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 120
KI 0.83
H2BO3 6.2
MnSO4·4H20 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·5H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
铁盐（200×）
FeSO4·7H2O 27.8
Na2-EDTA·2H2O 37.3
有机物成分：
肌醇 100
烟酸 0.5
甘氨酸 2
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
（2）植物生长激素
生长素类：萘乙酸 (1-Naphthylacetic acid，NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4－D）；
细胞分裂素类：6—苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、6-糖基氨基嘌呤（6-Furfurylaminopurine，KT）、1-苯基-3-（1,2,3-噻二唑-5-基）脲（Thidiazuron，TDZ）；
（3）蔗糖
每升培养基含蔗糖20-30g/L。
（4）琼脂
每升培养基含琼脂6-8g。
（5）活性炭（AC）
活性炭用于生根及壮苗培养，每升培养基含活性炭（AC）0.5-1.5g/L。
（6）pH调节
pH调节：滴加1mol的HC1或NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.2。
（7）培养基配方
无菌苗培养基：1/2MS+6g琼脂，pH值调至5.8-6.2。
丛生芽诱导培养基：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05-0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/LTDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L 蔗糖+6-8g/L 琼脂。
继代增殖培养基：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05-0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/LTDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L 蔗糖+6-8g/L 琼脂。
壮苗培养基：MS+0.5-1.5g/L AC+2mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+0.05-0.1mg/L 2,4-D+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L 蔗糖+6-8g/L 琼脂。
生根培养基：MS+0.5-1.5g/L AC+0.1-0.5mg/L NAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖。
（8）培养基灭菌
配置好的培养基分装至培养瓶，然后将分装好的培养基用蒸汽压力灭菌锅在121℃高温下灭菌30min后，放在无菌环境中存放待用；
4、操作步骤
（1）无菌苗的获取
首先将分别取‘红心1号’、‘红心2号’、‘胭脂红1号’胭脂萝卜种子进行预处理，即将胭脂萝卜种子在20-25℃条件下浸泡12-24 h；然后将预处理的种子置于超净工作台进行灭菌，获得胭脂萝卜无菌种子。灭菌方法为：先用75%酒精处理20-30 s，紧接着用无菌水清洗2-3次，再用上述配制的0.1%升汞灭菌10-15 min，最后用无菌水洗涤4-5次（每次用无菌水洗涤的时间为2-3 min）。
将灭菌的胭脂萝卜种子接种于培养无菌苗的培养基上，置于培养温度为25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为12 h/d的条件下培养4-8 d，获得无菌苗。其中培养无菌苗的培养基配方为：1/2MS+6g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.2。
（2）初代培养
以步骤（1）得到的无菌苗的茎尖作为初代培养诱导丛生芽的外植体，接种于丛生芽诱导的培养基上，在培养温度为25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下培养。初代培养1-2周后，基部产生愈伤组织，培养2-4周后，从茎尖诱导形成丛生芽。
丛生芽诱导的培养基为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05-0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L 蔗糖+6-8g/L 琼脂，培养基pH值为5.8-6.2。具体地，本实施例丛生芽诱导的培养基优选配方为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.2，采用优选的培养基诱导率可达95%。
（3）继代培养
将步骤（2）初代培养中诱导获得长势较好丛生芽分割成单芽，接到继代培养基上，在培养温度为25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下进行继代增殖培养，每3-5周继代增殖1次，获得大量增殖芽苗。
继代增殖培养基为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.05-0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/LTDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L蔗糖+6-8g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.2。具体地，本实施例继代增殖培养基优选为：MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.2，采用优选的培养基增殖率可达100%，平均增殖系数为8。
（4）壮苗培养
将步骤（3）得到的增殖苗分离成单苗，转接于壮苗培养基上，在培养温度为25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下培养2-3周得到健壮苗。其中壮苗培养基的配方为：MS+0.5-1.5g/L AC+2mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+0.05-0.1mg/L2,4-D+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L KT+20-30g/L蔗糖+6-8g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.2。具体地，本实施例壮苗培养基优选为：MS+0.5g/L AC+2mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+0.05mg/LTDZ+0.05mg/L KT+20g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8-6.2。
（5）生根培养
将步骤（4）得到的健壮苗置于生根培养基上，在培养温度为25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下培养2-4周后，幼苗形成粗壮的不定根及较多的毛细根。其中生根培养基的配方为：MS+0.5-1.5g/L活性炭+0.1-0.5mg/L NAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖。具体地，本实施例生根培养基优选为：1/2MS+1g/L活性炭+1mg/L NAA+8g/L琼脂+20g/L蔗糖，采用优选的生根培养基可以使生根率达90%。
（6）炼苗与移栽
出瓶前2周将组培试管苗置于光照培养箱上，在环境温度25±2℃，湿度70％-80％，光照强度为3000-4000Lx，光照时间为14h/d条件下进行过渡锻炼，以增强瓶苗对外界环境的适应能力。用镊子将幼苗从培养瓶中钳出，然后将苗放入清水中洗净根部附着的培养基。用 0.1%的高锰酸钾溶液浸根 3～5min，待根部表面水分稍晾干后，移栽到消毒的营养土中。经过1-2周的环境适应后，再将苗定植到田地或装土的塑料盆中。
结论：上述实施例采用本发明方法分别对‘红心1号’、‘红心2号’、‘胭脂红1号’胭脂萝卜进行组织培养快速繁殖，诱导率达95%，增殖率达100%，平均增殖系数为8，生根率为90%。组织培养繁殖周期短，仅30天就可以获得大量的丛生芽，以该方法扩繁出的红心1号’、‘红心2号’、‘胭脂红1号’胭脂萝卜小植株生长健壮、生长能力强。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：先将预处理并灭菌后的胭脂萝卜种子接种于无菌苗培养基上诱导培养获得无菌苗，取无菌苗的茎尖接种于丛生芽诱导培养基上进行初代培养诱导产生丛生芽，将丛生芽接种于继代增殖培养基上进行继代培养获得增殖苗，将增殖苗分离成单苗后转接于壮苗培养基上壮苗培养得到健壮苗，将健壮苗转移到生根培养基上培养获得生根幼苗，对生根幼苗进行炼苗处理后，将幼苗移栽到土壤中进行繁殖，获得胭脂萝卜；
所述无菌苗培养基由1/2MS培养基和6~8 g/L琼脂组成，pH值调至5.8~6.2；
所述丛生芽诱导培养基由MS培养基、2~6 mg/L 6-BA、0.05~0.2 mg/L NAA、0.05~0.2mg/L 2,4-D、0.5~3 mg/L TDZ、0.05~0.2 mg/L KT、20~30 g/L 蔗糖和6~8 g/L 琼脂组成，培养基pH值为5.8~6.2；
所述继代增殖培养基由MS培养基、2~4 mg/L 6-BA、0.2~10 mg/L NAA、0.05~0.2 mg/L2,4-D、0.2 mg/L TDZ、0.05 mg/L KT、20~30 g/L 蔗糖和6~8 g/L 琼脂组成，培养基pH值为5.8~6.2；
所述壮苗培养基由MS培养基、0.5~1.5 g/L AC、2~6 mg/L 6-BA 、0.1~0.2 mg/L NAA、0.05~0.1 mg/L 2,4-D、0.5~3 mg/L TDZ、0.05~0.2 mg/L KT、20~30g/L蔗糖和6~8g/L琼脂组成，培养基pH值为5.8~6.2；
所述生根培养基由MS培养基、0.5~1.5 g/L活性炭、0.1~0.5 mg/L NAA、6~8 g/L琼脂和20~30 g/L蔗糖组成；
所述MS培养基的溶剂为水，溶质的组分包括MS无机物和MS有机添加物；每升所述MS培养基中MS无机物由NH4NO3 1320~1980mg、KNO3 1520~2280mg、CaCl2·2H2O 352~528mg、MgSO4·7H2O 298~442mg、KH2PO4 136~204mg、KI 0.664~0.996mg、H2BO3 4.96 ~6.4mg、MnSO4·4H2O 17.84~26.76mg、ZnSO4·7H2O 6.88 ~10.32mg、Na2MoO4·5H2O 0.20~0.30mg、CuSO4·5H2O 0.020~0.030mg、CoCl2·6H2O 0.025~0.030mg、FeSO4·7H2O 22.24~33.40mg和Na2-EDTA·2H2O 29.84~44.76mg组成；每升所述MS培养基中MS有机添加物由肌醇80~120mg、烟酸0.4~0.6mg、甘氨酸1.6~2.4mg、盐酸吡哆醇0.4~0.6mg和盐酸硫胺素0.08~0.12mg组成。
2.根据权利要求1所述胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述预处理为将胭脂萝卜种子在20~25℃下浸泡12~24h；所述灭菌为将预处理后的胭脂萝卜种子置于超净工作台上，先用体积浓度为70~75%的乙醇水溶液处理20~30s，然后用无菌水清洗至少2次，再用质量浓度为0.1~0.5%的升汞溶液灭菌处理10~15min，最后用无菌水洗涤至少4次。
3.根据权利要求1所述胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，接种于无菌苗培养基上诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度2000~4000Lx，光照时间为12~16 h/d的条件下培养4~8d；所述初代培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度3000~4000 Lx，光照时间为14~18 h/d的条件下培养2~4周；所述继代培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000Lx，光照时间为14h/d的条件下培养；所述壮苗培养为在培养温度为25±2℃，湿度为60％~70％，光照强度2000~3000Lx，光照时间为14~16 h/d的条件下培养2~3周；所述生根培养为在培养温度25±2℃，湿度为60％-70％，光照强度2000~4000 Lx，光照时间为14~16 h/d的条件下培养2-4周。
4.根据权利要求1所述胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述炼苗处理为移栽到土壤中繁殖2周前将生根幼苗置于光照培养箱内，在环境温度为25±2℃，湿度为70％~90％，光照强度3000~4000Lx，光照时间为14~16h/d条件下进行过渡锻炼，移栽到土壤中繁殖1周前，对生根幼苗进行开瓶锻炼，首先松盖1~2d，然后开盖1~2d，最后将盖揭去，让瓶苗逐步适应外界的光照和湿度。
5.根据权利要求1所述胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，将幼苗移栽到土壤中进行繁殖为先用清水清洗去除炼苗处理后幼苗根部的培养基，再用质量浓度为0.1~0.5%的高锰酸钾溶液浸根处理3~5 min，待根部表面水分晾干后，将幼苗移栽到消毒的营养土中环境适应培养1~2周，再将环境适应后的幼苗定植于大田或栽植盆的土壤中进行繁殖。
CN201611037075.2A 2016-11-23 2016-11-23 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法 Expired - Fee Related CN106550875B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611037075.2A CN106550875B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611037075.2A CN106550875B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106550875A CN106550875A (zh) 2017-04-05
CN106550875B true CN106550875B (zh) 2018-09-28

Family

ID=58444560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611037075.2A Expired - Fee Related CN106550875B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106550875B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109380118A (zh) * 2018-11-25 2019-02-26 钟天路 一种莱菔子的组织培养快繁方法
CN114946661B (zh) * 2022-06-21 2023-10-17 华盛农业集团股份有限公司 一种萝卜未成熟种子组培成苗的培养基及培养方法
CN116711641B (zh) * 2023-07-12 2024-04-26 北京市农林科学院 一种茶菊组培苗快速繁殖的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102613074B (zh) * 2012-02-28 2013-10-30 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种四倍体萝卜的育种方法
CN104542271A (zh) * 2013-10-28 2015-04-29 雷晓琳 一种芥菜无土栽培方法
CN103734016B (zh) * 2014-01-21 2016-06-08 南京农业大学 一种离体诱导同源四倍体青花菜的育种方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106550875A (zh) 2017-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101647393B (zh) 毛花猕猴桃组培快速繁殖方法
CN109006473B (zh) 一种猕猴桃组培快速繁殖培养基及方法
CN106069790B (zh) 一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法
CN105494103A (zh) 一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法
CN104285813B (zh) 一种金花茶组培繁殖方法
CN101933455B (zh) 一种普陀樟的离体繁殖方法
CN107047320A (zh) 一种大花胡麻草组织培养方法
CN102823503B (zh) 红掌以芽繁芽组织培养培养基
CN110604058A (zh) 一种红花油茶幼胚的组培育苗方法
CN103444522B (zh) 一种丰水梨试管苗生根的制备方法
CN106550875B (zh) 用于胭脂萝卜组织培养的ms培养基、丛生芽培养基及胭脂萝卜的组织培养快速繁殖方法
CN107047319A (zh) 一种银杏的组织培养方法及生根培养基
CN108077071B (zh) 穗花牡荆组织培养用培养基及快速繁殖方法
CN103430854A (zh) 铁线莲奶油的组织培养方法
CN103947548A (zh) 一种百子莲高频再生体系建立的方法
CN103461131A (zh) 铁线莲贝蒂·里斯登的组织培养方法
CN103314862A (zh) 一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法
CN102893866B (zh) 一种草莓根尖脱毒与组培方法
CN106069784B (zh) 一种大花栀子花苞的组织培养方法
CN107711515A (zh) 一种木槿组培再生的方法
CN112167058A (zh) 一种改良植物组培的快繁方法
CN105379621B (zh) 一种大岛樱成年优良单株“小乔”樱的高效离体植株再生方法
CN108077066A (zh) 一种彩叶芋体细胞胚发生途径组培快繁方法
CN105010123B (zh) 通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基
CN106305430A (zh) 一种红山樱粉彩组培快速繁殖方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180928

Termination date: 20201123

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee