CN112931222A - 一种柘木组培苗继代培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物培植领域,涉及一种植物组织培养的方法,具体涉及一种柘木组培苗继代培养方法,属于生物技术领域。包括如下步骤:1)外植体的选择:选择健壮的柘木幼苗,用带腋芽的茎段作为外植体;2)外植体的消毒:采用消毒剂对外植体进行消毒,消毒后晾干接种于启动培养基上;3)启动培养:将处理好的外植体,在超净工作台上接种于启动培养基上,每只试管接入1个外植体茎段。培养28天后,即可得无菌苗。4)增殖/继代培养:取无菌苗的顶芽,基部芽丛,以及茎段用于继代增殖。本发明方法增殖系数可达1:4‑4.5,株高3.5cm左右。成活率合格率>98%。
Description
技术领域
本发明属于植物培植领域,涉及一种植物组织培养的方法,具体涉及一种柘木组培苗继代培养方法,属于生物技术领域。
背景技术
柘木(学名:Cudrania tricuspidata),又名桑柘木,属桑科植物,广泛分布于我国华东、中南、西南至河北南部,为我国历史上著名名贵木料,大多历史文献都有记载。其木材细致,光滑沉重,材质坚硬,抗压强度大,抗腐性、耐磨性高;韧皮纤维为优质造纸原料;柘树的根、树皮或根皮、茎叶、果实等均可入药,具有祛风利湿、活血通经、止咳化痰之功效,可治疗风湿关节疼痛、黄疸、淋浊、闭经、跌打损伤以及疔疮痈肿等症,近年来又用于治疗食管癌、胃癌、肠癌等消化系统肿瘤;柘树药材中的主要化学成分为黄酮类、酮类化合物,但其资源有限。实现柘木资源的可持续性利用,建立柘木的高效快繁体系,实现柘木种苗大规模快速繁殖,并且能保持柘木品种的优良特性,是目前急需解决的问题。
上海雷允上科技发展有限公司、上海市中药研究所共同提出一种柘木提取物、其制备及应用,专利号CN101375937A。完善柘木提取物的制备方法工艺,健全工艺指标,制得的柘木提取物及其各类制剂活性成分可控,抗肿瘤效果显著,为打开柘木的广阔应用市场提供了技术支持。
伽蓝(集团)股份有限公司的发明专利——柘木提取物及其应用,专利号CN104758197A,所述柘木提取物具有很好的美白和抗衰老的功效,可用于化妆品、保健食品和医药领域,尤其是可应用于化妆品中
青岛农业大学提出了一种柘木硬枝扦插的繁育方法,申请号CN201911325077.5,提供一种柘木硬枝扦插的繁育方法,但是扦插需要大量的枝条,切受季节的限制,快繁的效率有限。
柘木具有广泛的应用价值,具有很高的经济价值。但是其自然资源有限,如果不能人工大量繁殖,资源必将枯竭。目前还未见柘木组织培养的报道。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中柘木无法大规模人工繁殖的缺陷,利用组织培养技术进行柘木增殖扩繁的问题,快速繁殖优良品种的柘木。利用此项技术,可以大规模快速繁殖柘木种苗,并且能保持品种的优良特性,繁育不受季节限制。
本发明是通过如下技术方案实现上述目的的,一种柘木组培苗继代培养方法,包括如下步骤:
1)外植体的选择:选择健壮的柘木幼苗,用带腋芽的茎段作为外植体;
2)外植体的消毒:采用自来水和消毒剂对外植体进行消毒,消毒后晾干接种于启动培养基上;
3)启动培养:将处理好的外植体,在超净工作台上接种于启动培养基上(培养基ZS01),每只试管接入1个外植体茎段。培养28天后,即可得无菌苗。
4)增殖/继代培养:取无菌苗的顶芽,基部芽丛,以及茎段用于继代增殖。本发明方法增殖系数可达1:4-4.5,株高3.5cm左右。成活率合格率>98%。
优选的,所述增殖/继代培养中的培养基为由下述成分组成水体系:
六水合氯化钴(0.025mg/L);五水硫酸铜(0.25mg/L);EDTA钠铁盐(36.7mg/L);硼酸(6.3mg/L);碘化钾(0.83mg/L);一水合硫酸锰(16.9mg/L);二水合钼酸钠(0.25mg/L);七水合硫酸锌(8.2mg/L);二水合氯化钙(330mg/L);磷酸二氢钾(255mg/L);硝酸钾(825mg/L);七水合硫酸镁(370mg/L);硝酸铵(309mg/L);盐酸硫胺素(0.4mg/L);肌醇(100mg/L);烟酸(0.5mg/L);盐酸吡多辛(0.5mg/L);甘氨酸(2mg/L);蔗糖(30g/L);植物琼脂(5g/L);6-BA(6-苄氨基嘌呤)(0.1-0.5mg/L);IBA(0-0.1mg/L)(吲哚丁酸)。进一步优选为6-BA(6-苄氨基嘌呤)(0.3mg/L);IBA(0.05mg/L)(吲哚丁酸)。
优选的,所述启动培养基为由下述成分组成水体系:
六水合氯化钴0.025mg/L;五水硫酸铜0.25mg/L;EDTA钠铁盐36.7mg/L;硼酸6.3mg/L;碘化钾0.83mg/L;一水合硫酸锰16.9mg/L;二水合钼酸钠0.25mg/L;七水合硫酸锌8.2mg/L;二水合氯化钙330mg/L;磷酸二氢钾255mg/L;硝酸钾825mg/L;七水合硫酸镁370mg/L;硝酸铵309mg/L;0.4mg/L盐酸硫胺素;100mg/L肌醇;0.5mg/L烟酸;0.5mg/L盐酸吡多辛;2mg/L甘氨酸;30g/L蔗糖;5g/L植物琼脂;3mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤);0.1mg/LNAA(萘乙酸)
优选的,所述外植体的消毒过程中采用自来水和消毒剂对外植体进行消毒,消毒后晾干接种于启动培养基上的具体步骤为:先用自来水冲洗外植体5-8min,把表面冲洗干净;将茎段切成2-3cm的小段,用容器盛放再冲洗一遍;用70%的酒精浸泡1min,转移到超净工作台内,然后用3%的次氯酸钠溶液浸泡10min,最后用0.15%的无菌柠檬酸水浸洗3遍,晾干后接种于启动培养基上。
优选的,所述启动培养步骤的培养的条件为:温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养14h/暗培养10h。
优选的,所述增殖/继代培养中无菌苗的顶芽取1.0-1.5cm,基部丛芽取0.5-0.8cm,茎段0.8-1.2cm至少带2个芽点,接种于增殖培养基上。培养条件为,温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养16h/暗培养8h,培养45天后,即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。
本发明提供了一种操作简单、成本低廉、成活率高的柘木组培苗的继代培养方法,从而大规模快速繁殖柘木种苗,为柘木人工种植提供充足的种苗,从技术上为柘木的市场需求提供资源保障。
本发明的培养周期短,增殖系数高,成活率高,节约成本,适合柘木的大规模工厂化育苗。本发明采用的培养基配方,直接使用有机物的高纯度化学试剂,避免了前述研究中直接使用生物组织液的情况(部分植物品种组培培养基配方中,直接使用土豆、椰汁、香蕉等等植物组织器官,利用它们含有的维生素等复杂不确定的成分,达到培养需求。但这样使用的实践证明,在实际讲究效率、质量的工厂化生产中,会带来不稳定性),降低了成分不确定性的风险,更有利于实际生产的管控。
附图说明
图1为本发明柘木组培苗继代培养的流程图。
具体实施方式
一、按如下方法进行柘木组培苗继代培养(方法A):
外植体的选择:选择健壮的柘木两年生幼苗,用带腋芽的茎段作为外植体;
外植体的消毒:先用自来水冲洗外植体5-8min,把表面冲洗干净;将茎段切成2-3cm的小段,用容器盛放再冲洗一遍;用70%的酒精浸泡1min,转移到超净工作台内,然后用3%的次氯酸钠溶液浸泡10min,最后用0.15%的无菌柠檬酸水浸洗3遍,晾干后接种于启动培养基上。
启动培养:将处理好的外植体,在超净工作台上接种于启动培养基上(培养基ZS01),每只试管接入1个外植体茎段。培养28天后,即可得无菌苗。温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养14h/暗培养10h。
增殖培养(继代培养):无菌苗的顶芽,基部芽丛,以及茎段都可以用于继代增殖。顶芽取1.0-1.5cm,基部丛芽取0.5-0.8cm,茎段0.8-1.2cm至少带2个芽点,接种于增殖培养基上(培养基ZS02)。温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养16h/暗培养8h,培养45天后,即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。一般增殖系数可达1:4-4.5,株高3.5cm左右。成活率合格率>98%
二、培养基的迭代研发
各培养基配方如下:
1.基础培养基成分配方(命名为ZS):
2.启动培养基(ZS01)
ZS基础上添加:0.4mg/L盐酸硫胺素+100mg/L肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5mg/L盐酸吡多辛+2mg/L甘氨酸+30g/L蔗糖+5g/L植物琼脂+3mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)
3.增殖/继代培养基(ZS02)
ZS基础上添加:0.4mg/L盐酸硫胺素+100mg/L肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5mg/L盐酸吡多辛+2mg/L甘氨酸+30g/L蔗糖+5g/L植物琼脂+0.3mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.05mg/LIBA(吲哚丁酸)
基础培养基(ZS培养基),是在MS培养基无机盐部分的基础上进行的改良。改良的部分见表1:
表1基础培养基的改良
大量元素 | MS中成分的用量 | ZS中成分的用量 |
硝酸铵 | 1650mg/L | 309mg/L |
硝酸钾 | 1900mg/L | 825mg/L |
二水合氯化钙 | 440mg/L | 330mg/L |
磷酸二氢钾 | 170mg/L | 255mg/L |
微量元素 | ||
五水硫酸铜 | 0.025mg/L | 0.25mg/L |
申请人在基础培养上的创新,传统的基础培养基没有达到预期的效果;根据以往的研发经验逻辑进行了元素的调整。一方面效果提升,一方面节约生产成本。
三、增殖/继代培养基(ZS02)成分对柘木组培苗继代培养的生长状况的影响:
增殖/继代培养基(ZS02)激素实验水平,细胞分裂素使用6-BA0.1mg/L-0.5mg/L;生长素使用NAA0-0.2mg/L和IBA0-0.1mg/L,其因素水平设计表如表2所示:
表2增殖/继代培养基(ZS02)激素实验水平
按照上述的培养方法(方法A),改变增殖/继代培养基(ZS02)成分比例对柘木增殖/继代培养正交实验,各处理结果如下表3(以顶芽生长状况做分析):
表3增殖/继代培养基(ZS02)成分对柘木组培苗继代培养的生长状况的影响
注:增殖系数是指切割接种的符合要求的单株(按要求切取的顶芽、茎段或丛芽中的小芽株),在完成一次继代培养后,从最初那个单株的培养结果上,能切取出符合要求的有效单株的数量。
最终选择处理:0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA;继代培养基平均增殖系数为4.5。
4.增殖培养(继代培养)阶段中接种部位和培养周期的影响
按照上述柘木组培苗继代培养的方法(方法A),分别采用启动培养阶段后得到的无菌苗的顶芽、茎段和基部芽丛作为增殖培养(继代培养),如表4所示:
表4增殖培养(继代培养)阶段中接种部位和培养周期的影响
实验结果表明,各部位接种后的苗况都较好,故在工厂化生产中,各部位都可接种。40天后生长已经很缓慢,50天后几乎不再生长,故45天的增殖周期为最适。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种柘木组培苗继代培养方法,包括如下步骤:
1)外植体的选择:选择健壮的柘木幼苗,用带腋芽的茎段作为外植体;
2)外植体的消毒:采用自来水和消毒剂对外植体进行消毒,消毒后晾干接种于启动培养基上;
3)启动培养:将处理好的外植体,在超净工作台上接种于启动培养基上,接入外植体茎段,培养得无菌苗;
4)增殖/继代培养:取无菌苗的顶芽,基部芽丛,以及茎段用于继代增殖。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述增殖/继代培养中的培养基为由下述成分组成水体系:
六水合氯化钴;五水硫酸铜;EDTA钠铁盐;硼酸;碘化钾;一水合硫酸锰;二水合钼酸钠;七水合硫酸锌;二水合氯化钙;磷酸二氢钾;硝酸钾;七水合硫酸镁;硝酸铵;盐酸硫胺素;肌醇;烟酸;盐酸吡多辛;甘氨酸;蔗糖;植物琼脂;6-BA;IBA。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述增殖/继代培养中的培养基为由下述成分组成水体系:
六水合氯化钴0.025mg/L;五水硫酸铜0.25mg/L;EDTA钠铁盐36.7mg/L;硼酸6.3mg/L;碘化钾0.83mg/L;一水合硫酸锰16.9mg/L;二水合钼酸钠0.25mg/L;七水合硫酸锌8.2mg/L;二水合氯化钙330mg/L;磷酸二氢钾255mg/L;硝酸钾825mg/L;七水合硫酸镁370mg/L;硝酸铵309mg/L;盐酸硫胺素0.4mg/L;肌醇100mg/L;烟酸0.5mg/L;盐酸吡多辛0.5mg/L;甘氨酸2mg/L;蔗糖30g/L;植物琼脂5g/L;6-BA 0.1-0.5mg/L;IBA 0-0.1mg/L。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:6-BA 0.3mg/L;IBA 0.05mg/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述启动培养基为由下述成分组成水体系:
六水合氯化钴0.025mg/L;五水硫酸铜0.25mg/L;EDTA钠铁盐36.7mg/L;硼酸6.3mg/L;碘化钾0.83mg/L;一水合硫酸锰16.9mg/L;二水合钼酸钠0.25mg/L;七水合硫酸锌8.2mg/L;二水合氯化钙330mg/L;磷酸二氢钾255mg/L;硝酸钾825mg/L;七水合硫酸镁370mg/L;硝酸铵309mg/L;0.4mg/L盐酸硫胺素;100mg/L肌醇;0.5mg/L烟酸;0.5mg/L盐酸吡多辛;2mg/L甘氨酸;30g/L蔗糖;5g/L植物琼脂;3mg/L 6-BA;0.1mg/LNAA。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述外植体的消毒过程中采用消毒剂对外植体进行消毒,消毒后晾干接种于启动培养基上的具体步骤为:先用自来水冲洗外植体5-8min,把表面冲洗干净;将茎段切成2-3cm的小段,用容器盛放再冲洗一遍;用70%的酒精浸泡1min,转移到超净工作台内,然后用3%的次氯酸钠溶液浸泡10min,最后用0.15%的无菌柠檬酸水浸洗3遍,晾干后接种于启动培养基上。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述启动培养步骤的培养的条件为:温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养14h/暗培养10h。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于:所述增殖/继代培养中无菌苗的顶芽取1.0-1.5cm,基部丛芽取0.5-0.8cm,茎段0.8-1.2cm至少带2个芽点,接种于增殖培养基上;培养条件为,温度:25±3℃;光照强度:1500±300lux;光照培养16h/暗培养8h,培养45天后,即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。
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