CN117136842A - 一种柘树的微体组织培养快繁方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种柘树的微体组织培养快繁方法，属于生物技术领域。该柘树的微体组织培养快繁方法，包括以下步骤：(1)外植体的选取；(2)外植体的消毒；(3)无菌体系的建立；(4)丛生芽的诱导；(5)生根诱导；(6)练苗与移栽。柘树的微体组织培养快繁方法，需要的母本材料少，1～2个茎段即可大批量繁殖，增殖系数高达5，生根率可达96％，将生根幼苗锻炼移栽后的成活率可达94％，从瓶苗到移栽成活率为90.24％，该方法能够最大限度的保持母本的优良性状，繁殖速度快、苗木质量好、出苗率高。

Description

一种柘树的微体组织培养快繁方法

技术领域

本申请涉及一种柘树的微体组织培养快繁方法，属于生物技术领域。

背景技术

柘树(Cudrania tricuspidata(Caar.)Bur)是桑科柘属落叶灌木或者小乔木，喜光、喜湿、抗冻、耐干旱瘠薄，萌蘖力强，为良好的水土保持树种，分布广泛，国内外均有优良的栽培品种。柘树比较有价值的应用有，第一，柘树的材质黄色坚硬致密，是制作工艺品的上等材料，有可能成为即黄花梨之后的优良用材，也可做黄色染料；第二，柘树皮可造纸，也可入药，药理研究证明，其提取物具有清热凉血，清肝明目，止咳化痰，祛风利湿，化瘀止血、舒筋活络等作用，临床多用于治疗风湿痛、跌打损伤、脾虚泄泻及黄疽等症，现代临床试验证明：柘树黄酮与化疗药物中的环磷酰胺、顺铂及5-氟尿嘧啶等化疗药物具有协同效应，用于治疗胃癌等消化系统肿瘤疾病，其活性成分对于肺癌、肺结核也有奇特的疗效。

通常，柘树通过嫁接和扦插来繁殖：嫁接繁殖需培育大量砧木且嫁接苗抗风性差、基部砧木易形成萌芽，增加管理成本；扦插繁殖对环境要求较高且扦插成活率低，繁殖速度较慢，短期内难以获得大量的优质种苗来满足市场需要；从国外直接购买种苗价格昂贵。

因此如果能使用柘树的微体组织进行快速繁殖，将能够有效解决上述技术问题。

发明内容

为了解决上述问题，提供了一种柘树的微体组织培养快繁方法。与扦插或者嫁接繁殖方法相比，该柘树的微体组织培养快繁方法需要的母本材料少，仅使用几个优良的柘树茎段即可大量繁殖，增殖系数高达5，瓶苗生根率可达96％，练苗成活率94％，从瓶苗到练苗成活率90.24％；该方法能更好地保持母本的优良性状，具有繁殖速度快、出苗率高、苗木根系发达、苗木质量好的优点。

所述柘树的微体组织培养快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选取

柘树的萌生芽长至20cm以上时，剪取幼嫩的柘树茎段，去掉叶柄，得柘树外植体；

(2)外植体的消毒

将外植体置于浓度为1％-3％的洗衣粉溶液中，用软毛刷轻轻擦洗，自来水冲洗干净；

把冲洗干净的外植体置于超净工作台中的无菌瓶中，将0.1％氯化汞消毒液注入无菌瓶中，不断摇动，消毒完成后，倒掉消毒液，用无菌水将消毒后的外植体冲洗干净；

(3)无菌体系的建立

将消毒后冲洗干净的外植体接入到启动培养基，并置于培养室中，培养一段时间后，保留无污染的外植体，即初步建立起无菌体系；

启动培养基为MS+6-BA 0.5～0.8mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(4)丛生芽的诱导

当无菌体系的外植体腋芽生长到4～8cm时，从外植体基部切下幼嫩的茎段，接种到分化培养基中，诱导丛生芽；

分化培养基为MS+6-BA 2.0～2.5mg/L+IBA 0.3～0.4mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(5)生根诱导

当诱导的丛生芽长到2～4cm时，将诱导的丛生芽茎段从基部切下，并接种到生根培养基中，进行生根培养；

生根培养基为1/2MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5～1.0mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 6mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(6)练苗与移栽

当诱导的新生根长到1～3cm时，将幼苗置于室外室外透光率为30％的遮阳网下练苗一周，开启装载幼苗的瓶盖，放置一周，然后进行移栽。

优选的，步骤(1)中的柘树小苗在深秋或者早春栽植于花盆中，在早春二月将栽有柘树小苗的花盆移入温室大棚或者室内，进行催芽处理。

可选的，柘树的萌生芽的生长温度为25～35℃。

可选的，步骤(2)中将外植体置于1％洗衣粉溶液中。

可选的，步骤(2)中的外植体用自来水冲洗干净后，置于紫外灯消毒30分钟后的无菌操作接种台上。

可选的，步骤(2)中外植体在0.1％氯化汞消毒液中消毒的时间为5分钟。

可选的，步骤(2)中用无菌水将消毒后的外植体冲洗3～5遍后进行步骤(3)。

可选的，步骤(3)中培养室的培养条件为：温度25℃，光照强度2500～3500Lx，每天光照时间10-12h。

优选的，步骤(3)中培养室的培养条件为：光照强度2500～3000Lx，每天光照时间12h。

优选的，步骤(3)中培养时间为30天。

优选的，步骤(4)中在分化培养基中培养的时间为30天。

可选地，步骤(6)中：

将幼苗置于遮阳网下练苗一周，开启装载幼苗的瓶盖，放置一周，然后进行移栽。

优选的，步骤(3)中遮阳网的透过率为30％。

优选的，步骤(6)的移栽包括：

将生根柘树小苗从培养瓶中取出，放入38-42℃的清水中，洗掉培养基，然后植入蛭石与珍珠岩的混合基质中，于拱棚中培养至长出新叶，进行大田移栽。

可选的，步骤(6)中的蛭石与珍珠岩的重量比为1:1。

可选的，拱棚的条件为：

湿度在90％以上，温度25℃，且每天早晨、中午和傍晚，打开拱棚的两端，通风30分钟。

本申请的有益效果包括但不限于：

本申请所提供的柘树的微体组织培养快繁方法，需要的母本材料少，1～2个茎段即可大批量繁殖，增殖系数高达5，生根率可达96％以上，将生根幼苗移栽后的练苗成活率可达94％以上，小苗移栽成活率90.24％以上，且能保持母本的优良性状，具有繁殖速度快、苗木质量好、出苗率高的优点；该方法使用的外植体获得容易，组培操作简单，具有培养周期短、繁殖系数高、种苗无病虫害、品质好、抗性强、生长健壮、生长快等特点，有利于为实现工业化生产奠定基础。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为柘树小苗萌发芽后剪取的幼嫩的柘树茎段的图片；

图2为外植体在启动培养基上萌发的图片；

图3为外植体在分化培养基上丛生芽的萌发的图片；

图4为丛生芽茎段在生根培养基上的生根的图片；

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的试剂均通过商业途径购买。

本申请提供的柘树的微体组织培养快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选取

在上年深秋或者来年早春，将柘树小苗移栽于花盆中，于早春2月将栽有柘树小苗的花盆移入温室大棚或者室内，温室大棚或者室内的温度控制在20℃～35℃，进行催芽处理，当柘树的萌生芽长至20cm以上时，在晴朗的天气里，于下午2.30分左右，剪取幼嫩的柘树茎段，去掉叶柄，得拓树外植体，详见图1；

(2)外植体的消毒

将外植体置于浓度为1％的洗衣粉溶液中，用软毛刷轻轻擦洗枝条和腋芽，自来水冲洗干净后，置于紫外灯消毒30分钟后的无菌操作接种台内；于消毒的无菌瓶中，将0.1％的氯化汞消毒液倒入无菌瓶中，不断摇动，消毒5分钟后，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3～5遍消毒后的外植体；

(3)无菌体系的建立

把消毒后冲洗干净的外植体接入到启动培养基中，并置于培养室中培养，参考图2，保留无污染的外植体，即为初步建立的无菌体系；

启动培养基为MS+6-BA 0.5～0.8mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

通风透光的培养室的条件为：

温度25℃，光强2500Lx-3500Lx，光照时间12小时；培养30天；

(4)丛生芽的诱导

在无菌条件下，当无菌体系的外植体的腋芽生长到2～4cm时，从基部切下幼嫩的茎段，植入到分化培养基中，诱导丛生芽，参考图3；

分化培养基为MS+6-BA 2.0～2.5mg/L+IBA 0.3～0.4mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

培养30天后，检查丛生芽的分化增殖系数，统计为5.0；

(5)生根诱导

无菌条件下，当诱导的丛生芽长到2～4cm时，将诱导的丛生芽茎段从基部切下，并接种到生根培养基中，进行生根培养，参考图4；

生根培养基为1/2MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5～1.0mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(6)练苗与移栽

当诱导的新生根长到1～3cm时，将组培瓶内的柘树幼苗，置于室外透光率30％的遮阳网下，7天后，打开组培瓶盖；再放置7天后，将组培苗从组培瓶中取出；

将取出后的组培苗放入40℃的温水中，洗净培养基，栽入蛭石与珍珠岩的混合基质中穴盘中，蛭石与珍珠岩的重量比为1:1，放置塑料拱棚内练苗培养，待苗长出新根后，进行大田移栽；

塑料拱棚内的条件：湿度在90％以上，温度为25℃；

每天早、中、傍晚，打开拱棚两端，通风30分钟。

实施例1-3和对比例1-2

启动培养基对外植体的影响见表1。

表1

实施例4-6和对比例3-4

分化培养基对外植体丛生芽的分化增殖系数的影响见表2。

表2

实施例7-9和对比例5-6

生根培养基对生根率的影响见表3。

表3

本申请通过调节MS培养基中特定激素的种类与浓度，成功建立了柘树组织培养快繁体系。该方法获得外植体容易，组培操作简单，具有培养周期短、繁殖系数高等特点，能快速大量繁殖试管种苗，而且种苗无病虫害、生长健壮、品质好、抗性强、生长快。

与其他繁殖方法相比，本发明需要的母本材料少，有1～2个茎段即可大批量繁殖，增殖系数高达5，生根率可达到96％以上，且更好地保持母本的优良性状，将幼苗移栽室外，成活率能达到94％以上，繁殖速度快，苗木质量好，出苗率高。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体的选取

柘树的萌生芽长至20cm以上时，剪取幼嫩的柘树茎段，去掉叶柄，得柘树外植体；

(2)外植体的消毒

将外植体置于浓度为1％-3％的洗衣粉溶液中，用软毛刷轻轻擦洗，自来水冲洗干净；

把冲洗干净的外植体置于超净工作台中的无菌瓶中，将0.1％氯化汞消毒液注入无菌瓶中，不断摇动，消毒完成后，倒掉消毒液，用无菌水将消毒后的外植体冲洗干净；

(3)无菌体系的建立

将消毒冲洗干净的外植体接入到启动培养基，并置于培养室中，培养20～30天后，保留无污染的外植体，即为初步建立的无菌体系；

启动培养基为MS+6-BA 0.5～0.8mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(4)丛生芽的诱导

当外植体的腋芽生长到4～8cm时，从外植体基部切下幼嫩的茎段，接种到分化培养基中培养，诱导丛生芽；

分化培养基为MS+6-BA 2.0～2.5mg/L+IBA 0.3～0.4mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C 3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(5)生根诱导

当诱导的丛生芽长到2～4cm时，将诱导的丛生芽茎段从基部切下，并接种到生根培养基中，进行生根培养；

生根培养基为1/2MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5～1.0mg/L+Sugar 30～45mg/L+活性炭C3mg/L+琼脂粉3～6mg/L；

(6)练苗与移栽

当诱导的新生根长到1～3cm时，将幼苗置于遮阳网下练苗5～9d，开启装载幼苗的瓶盖，放置5～9d，然后进行移栽。

2.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，柘树的萌生芽的生长温度为25～35℃。

3.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(2)中的外植体用自来水冲洗干净后，置于紫外灯消毒30分钟后再置于超净工作台中的无菌瓶中。

4.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(3)中培养室的培养条件为：温度25℃，光照强度2500～3500Lx，每天光照时间10-12h。

5.根据权利要求4所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(3)中培养室的培养条件为：

光照强度2500～3000Lx，每天光照时间12h。

6.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(6)中：

将幼苗置于遮阳网下练苗一周，开启装载幼苗的瓶盖，放置一周，然后进行移栽。

7.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(3)中遮阳网的透过率为30％。

8.根据权利要求1所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(6)的移栽包括：

将生根柘树小苗自培养瓶中取出，放入38-42℃的温水中，洗掉培养基，然后植入蛭石与珍珠岩的混合基质中，于拱棚中培养至长出新叶，进行大田移栽。

9.根据权利要求8所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，步骤(6)中的蛭石与珍珠岩的重量比为1:1。

10.根据权利要求8所述的柘树的微体组织培养快繁方法，其特征在于，拱棚的条件为：

湿度在90％以上，温度25℃，且每天早晨、中午和傍晚，打开拱棚的两端，通风30分钟。