CN112970589A - 一种川贝母的组织培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种川贝母的组织培养方法及其应用，所述培养方法包括以下步骤：外植体的选择与灭菌处理、愈伤组织的诱导培养、小鳞茎分化培养、增殖培养和生根培养。该培养方法操作简便、费用低廉，在整个培养过程中不使用外源激素，提高了种苗使用的安全性。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种川贝母的组织培养方法及其应用。
背景技术
川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。川贝母植株对生长环境要求苛刻，它喜冷阴气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温的特性。气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低、气温高的地区不能生存，所以川贝母在海拔3500m～4500m的高度才能正常生长。川贝母是重要的治疗咳嗽的良药，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽等症状。由于川贝母价格昂贵，加之近年来无计划盲目的采挖，自然资源日趋枯竭。
组织培养技术生长周期短，繁殖率高，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产，因此应用组织培养的方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法之一。目前，关于川贝母的组织培养已发表相关研究报道，在现有组织培养技术中，均加入了外源激素。外源激素的长期应用，不仅会导致组培苗的优良性状发生退化或变异，而川贝母作为药用植物，外源激素的使用不利于人体健康。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种川贝母的组织培养方法及其应用。该培养方法操作简便、费用低廉，在整个培养过程中不使用外源激素，提高了种苗使用的安全性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种川贝母的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌处理：
选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体，将所述川贝母鳞茎进行灭菌；
（2）愈伤组织的诱导培养：
在无菌环境下，将灭菌后的所述川贝母鳞茎切割成粒径为0.4～0.6cm的小方块，接种到无外源激素愈伤组织诱导培养基中，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+150~250g/L椰子汁+30~50g/L马铃薯汁+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，光强10~15μmo1•m-2•s-1，光照周期10~15h/d培养15~25天；
（3）小鳞茎分化培养：
将诱导后得到的块状愈伤组织接种到无外源激素小鳞茎分化培养基中，所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+80~120g/L椰子汁+100~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强15~25μmo1•m-2•s-1，所述蓝光和所述红光光强的比例为（7~9）:（1~3），光照周期10~15h/d培养20~25天；
（4）增殖培养：
选择分化培养后的生长旺盛的健康的小鳞茎，切下，接种到无外源激素增殖培养基中，所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~150g/L椰子汁+150~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm, 绿光515~535nm，光强20~40μmo1•m-2•s-1，所述红光、所述蓝光和所述绿光光强的比例为1:（7~9）:1，光照周期10~15h/d培养25~30天；
（5）生根培养：
将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入无外源激素生根培养基中，所述无外源激素生根培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~200g/L香蕉泥+50~80g/L苹果汁+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强30~50μmo1•m-2•s-1，所述红光和所述蓝光光强的比例为（2~4）:（6~8），光照周期10~15h/d培养25~35天。
优选的是，在步骤（1）中，于每年3月20~31日，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体。
上述任一方案中优选的是，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素小鳞茎分化培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素增殖培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素生根培养基的pH值为5.5～5.9。
上述任一方案中优选的是，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+200g/L椰子汁+40g/L马铃薯汁+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+100g/L椰子汁+150g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+120g/L椰子汁+180g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸+2g/L活性炭；所述无外源激素生根培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+150g/L香蕉泥+60g/L苹果汁+2g/L活性炭。
上述任一方案中优选的是，在步骤（2）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
上述任一方案中优选的是，在步骤（3）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
上述任一方案中优选的是，在步骤（4）中，所述培养条件还包括：温度为15~20℃，空气相对湿度为70%~80%。
上述任一方案中优选的是，在步骤（5）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
上述任一方案中优选的是，在步骤（1）中，所述灭菌处理包括以下步骤：
选取所述川贝母鳞茎为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取洗洁精稀释溶液清洗所述外植体表面，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，用75%的乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，每次2分钟，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。
本发明优化了川贝母组织培养各个阶段的培养基及光照条件，在保证川贝母正常生长的情况下，有效降低褐化率，在不添加外源激素的基础上，愈伤组织的诱导率和小鳞茎分化率均较高，提高了种苗使用的安全性。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的川贝母的组织培养方法在规模化培育川贝母中的应用。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
第一方面，本发明实施例提供了一种川贝母的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌处理：
选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体，将所述川贝母鳞茎进行灭菌；
（2）愈伤组织的诱导培养：
在无菌环境下，将灭菌后的所述川贝母鳞茎切割成粒径为0.4～0.6cm的小方块，接种到无外源激素愈伤组织诱导培养基中，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+150~250g/L椰子汁+30~50g/L马铃薯汁+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，光强10~15μmo1•m-2•s-1，光照周期10~15h/d培养15~25天；
（3）小鳞茎分化培养：
将诱导后得到的块状愈伤组织接种到无外源激素小鳞茎分化培养基中，所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+80~120g/L椰子汁+100~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强15~25μmo1•m-2•s-1，所述蓝光和所述红光光强的比例为（7~9）:（1~3），光照周期10~15h/d培养20~25天；
（4）增殖培养：
选择分化培养后的生长旺盛的健康的小鳞茎，切下，接种到无外源激素增殖培养基中，所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~150g/L椰子汁+150~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm, 绿光515~535nm，光强20~40μmo1•m-2•s-1，所述红光、所述蓝光和所述绿光光强的比例为1:（7~9）:1，光照周期10~15h/d培养25~30天；
（5）生根培养：
将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入无外源激素生根培养基中，所述无外源激素生根培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~200g/L香蕉泥+50~80g/L苹果汁+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强30~50μmo1•m-2•s-1，所述红光和所述蓝光光强的比例为（2~4）:（6~8），光照周期10~15h/d培养25~35天。
本发明实施例优化了川贝母组织培养各个阶段的培养基及光照条件，在保证川贝母正常生长的情况下，有效降低褐化率，在不添加外源激素的基础上，愈伤组织的诱导率和小鳞茎分化率均较高，提高了种苗使用的安全性，为生产提供大量优质种苗。
本发明实施例中培养基添加了柠檬酸，可以有效地降低褐化率，显著提高愈伤组织的诱导率和小鳞茎分化率。
所述生根培养基中添加苹果汁，可以显著增加生根数和根长。
本发明实施例使用LED灯具作为组织培养光源，可以节省用电资源30-50%，降低了成本，并提高了工厂化生产的效率。
进一步地，在步骤（1）中，于每年3月20~31日，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体。本发明实施例选取川贝母外植体的时间为3月20~31日，可以显著提高小鳞茎分化率和小鳞茎增殖比率。
进一步地，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素小鳞茎分化培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素增殖培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素生根培养基的pH值为5.5～5.9。
进一步地，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+200g/L椰子汁+40g/L马铃薯汁+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+100g/L椰子汁+150g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+120g/L椰子汁+180g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸+2g/L活性炭；所述无外源激素生根培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+150g/L香蕉泥+60g/L苹果汁+2g/L活性炭。
进一步地，在步骤（2）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
进一步地，在步骤（3）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
进一步地，在步骤（4）中，所述培养条件还包括：温度为15~20℃，空气相对湿度为70%~80%。
进一步地，在步骤（5）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
进一步地，在步骤（1）中，所述灭菌处理包括以下步骤：
选取所述川贝母鳞茎为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取洗洁精稀释溶液清洗所述外植体表面，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，用75%的乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，每次2分钟，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。
本发明所述外源激素指人工合成的、作用类似植物激素的化学物质，例如6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）、2,4-D等。
以上各阶段培养基的制作都是按照各自配比将各原料混合后搅拌均匀即可。各阶段培养基的pH值可通过KOH（或NaOH）和HCL调整，调整方法参考如下：以1 升培养基的量为例，将培养基配方中的所有物质加入一起溶解后，将最终的培养基体积用水调整到1升，充分混合后，用浓度为1摩尔/升的KOH（或NaOH）和HCL调整培养基的酸碱度（pH值）到所需值。
以上各阶段培养基均经过121℃灭菌22分钟。
MS培养基组成如表1所示：
表1
第二方面，本发明实施例提供了如第一方面所述的川贝母的组织培养方法在规模化培育川贝母中的应用。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
椰子为新鲜海南椰子；马铃薯为云南黄皮黄心新鲜马铃薯；香蕉为新鲜云南香蕉；苹果为新鲜红富士苹果。
实施例1
（1）外植体的选择与灭菌处理：
于每年3月20~31日，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取少量洗洁精稀释溶液(1g溶于100mL蒸馏水)清洗所述外植体表面，用自来水冲洗干净，约冲洗30分钟，在超净工作台上，用75%的乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，每次2分钟，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。
（2）愈伤组织的诱导培养：
在无菌环境下，将灭菌后的所述川贝母鳞茎切割成粒径为0.5cm的小方块，接种到无外源激素愈伤组织诱导培养基中，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+200g/L椰子汁+40g/L马铃薯汁+60mg/L柠檬酸，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，光强为13μmo1•m-2•s-1，光照周期12h/d，培养20天；愈伤组织诱导率为89%。
（3）小鳞茎分化培养：
将诱导后得到的块状愈伤组织接种到无外源激素小鳞茎分化培养基中，所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+100g/L椰子汁+150g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强20μmo1•m-2•s-1，蓝光和红光光强的比例为7:3，光照周期12h/d，培养22天；愈伤组织团块再生分化率达96%。
（4）增殖培养：
选择分化培养后的生长旺盛的健康的小鳞茎，切下，去掉基部残留物，接种到无外源激素增殖培养基中，所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+ 30g/L蔗糖+6g/L琼脂+120g/L椰子汁+180g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸+2g/L活性炭，pH值为5.6；培养条件如下：
在20℃/白天，18℃/黑夜条件下培养，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，绿光515~535nm，光强30μmo1•m-2•s-1，红光、蓝光和绿光光强的比例为1:8:1，光照周期12h/d，培养27天；获得小鳞茎增殖比率为1:21，增殖比率指原来的个体数与增殖出来的生物个体数的比。
（5）生根培养：
用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入无外源激素生根培养基中，所述无外源激素生根培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+150g/L香蕉泥+60g/L苹果汁+2g/L活性炭，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强40μmo1•m-2•s-1，红光和蓝光光强的比例为3:7，光照周期12h/d，培养30天；完成上述生根培养阶段后，培育出的川贝母平均每株苗生根数为5.4，平均根长为5.1cm，生根率为95.8%，将无菌川贝母接着进行炼苗移栽即可。
实施例2
（1）外植体的选择与灭菌处理：
于每年3月20~31日，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取少量洗洁精稀释溶液(1g溶于100mL蒸馏水)清洗所述外植体表面，用自来水冲洗干净，约冲洗30分钟，在超净工作台上，用75%的乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，每次2分钟，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。
（2）愈伤组织的诱导培养：
在无菌环境下，将灭菌后的所述川贝母鳞茎切割成粒径为0.5cm的小方块，接种到无外源激素愈伤组织诱导培养基中，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+180g/L椰子汁+40g/L马铃薯汁+50mg/L柠檬酸，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，光强为13μmo1•m-2•s-1，光照周期12h/d，培养20天；愈伤组织诱导率为87%。
（3）小鳞茎分化培养：
将诱导后得到的块状愈伤组织接种到无外源激素小鳞茎分化培养基中，所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+100g/L椰子汁+170g/L香蕉泥+50mg/L柠檬酸，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强20μmo1•m-2•s-1，蓝光和红光光强的比例为7:3，光照周期12h/d，培养22天；愈伤组织团块再生分化率达97%。
（4）增殖培养：
选择分化培养后的生长旺盛的健康的小鳞茎，切下，去掉基部残留物，接种到无外源激素增殖培养基中，所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+ 30g/L蔗糖+6g/L琼脂+120g/L椰子汁+150g/L香蕉泥+50mg/L柠檬酸+2g/L活性炭，pH值为5.6；培养条件如下：
在20℃/白天，18℃/黑夜条件下培养，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，绿光515~535nm，光强30μmo1•m-2•s-1，红光、蓝光和绿光光强的比例为1:8:1，光照周期12h/d，培养27天；获得小鳞茎增殖比率为1:19。
（5）生根培养：
用灭菌的镊子和解剖刀将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入无外源激素生根培养基中，所述无外源激素生根培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+200g/L香蕉泥+60g/L苹果汁+2g/L活性炭，pH值为5.6；培养条件如下：
温度为22℃，空气相对湿度为75%，以LED作为组织培养光源，LED培养架采用多层立体结构，培养架高2.38m，每个培养架设4层，每层高0.59m。LED灯管安装在每层间贴有避光纸的玻璃板上，培养架侧面使用遮光布遮挡。红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强40μmo1•m-2•s-1，红光和蓝光光强的比例为3:7，光照周期12h/d，培养30天；完成上述生根培养阶段后，培育出的川贝母平均每株苗生根数为5.7，平均根长为5.3cm，生根率为96.2%，将无菌川贝母接着进行炼苗移栽即可。
对比例1
（1）外植体的选择与灭菌处理：
与实施例1中步骤（1）完全相同。
（2）愈伤组织的诱导培养：
与实施例1中步骤（2）基本相同，不同的是所述无外源激素愈伤组织诱导培养基中不含柠檬酸，愈伤组织诱导率为82%。
（3）小鳞茎分化培养：
与实施例1中步骤（3）基本相同，不同的是所述无外源激素小鳞茎分化培养基中不含柠檬酸，愈伤组织团块再生分化率达91%。
（4）增殖培养：
与实施例1中步骤（4）基本相同，不同的是所述无外源激素增殖培养基中不含柠檬酸，获得小鳞茎增殖比率为1：15。
（5）生根培养：
与实施例1中步骤（5）完全相同。
对比例2
（1）~（4）与实施例1中步骤（1）~（4）完全相同。
（5）生根培养：
与实施例1中步骤（5）基本相同，不同的是所述无外源激素生根培养基中不含苹果汁，培育出的川贝母平均每株苗生根数为3.1，平均根长为3.7cm，生根率为95.3%。
对比例3
（1）~（4）与实施例1中步骤（1）~（4）完全相同。
（5）生根培养：
与实施例1中步骤（5）基本相同，不同的是所述无外源激素生根培养基中苹果汁为20g/L，培育出的川贝母平均每株苗生根数为3.4，平均根长为4.1cm，生根率为95.6%。
对比例4
（1）外植体的选择与灭菌处理：
与实施例1中步骤（1）基本相同，不同的是，于每年6月初，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体。
（2）愈伤组织的诱导培养：
与实施例1中步骤（2）完全相同，愈伤组织诱导率为71%。
（3）小鳞茎分化培养：
与实施例1中步骤（3）完全相同，愈伤组织团块再生分化率达62%。
（4）增殖培养：
与实施例1中步骤（4）完全相同，获得小鳞茎增殖比率为1:10。
（5）生根培养：
与实施例1中步骤（4）完全相同。
对比例5
（1）外植体的选择与灭菌处理：
与实施例1中步骤（1）完全相同。
（2）愈伤组织的诱导培养：
与实施例1中步骤（2）基本相同，不同的是，将“红光620~625nm”替换为“普通荧光灯（白光）”、“蓝光460~465nm”或“绿光515~535nm”。
当光源为普通荧光灯（白光）时，愈伤组织诱导率为81%；当光源为蓝光460~465nm时，愈伤组织诱导率为83%；当光源为绿光515~535nm时，愈伤组织诱导率为78%。
（3）小鳞茎分化培养：
与实施例1中步骤（3）基本相同，不同的是，将“红光620~625nm，蓝光460~465nm”替换为“普通荧光灯（白光）”、“红光620~625nm”、“蓝光460~465nm”、“绿光515~535nm”或将红光和蓝光的比例修改为1:1。
当光源为普通荧光灯（白光）时，愈伤组织团块再生分化率达75%；当光源为红光620~625nm时，愈伤组织团块再生分化率达82%；当光源为蓝光460~465nm时，愈伤组织团块再生分化率达87%；当红光和蓝光的比例为1:1时，愈伤组织团块再生分化率达85%；当光源为绿光515~535nm时，愈伤组织团块再生分化率达61%。
（4）增殖培养：
与实施例1中步骤（4）基本相同，不同的是，将“红光620~625nm，蓝光460~465nm，绿光515~535nm”替换为“普通荧光灯（白光）”、“红光620~625nm”、“蓝光460~465nm”、“绿光515~535nm”或“红光620~625nm，蓝光460~465nm，比例为1:8”。
当光源为普通荧光灯（白光）时，获得小鳞茎增殖比率为1:9；当光源为红光620~625nm时，获得小鳞茎增殖比率为1:11；当光源为蓝光460~465nm时，获得小鳞茎增殖比率为1:14；当光源为红光和蓝光，比例为1:8时，获得小鳞茎增殖比率为1:16；当光源为绿光515~535nm时，获得小鳞茎增殖比率为1:7。
（5）生根培养：
与实施例1中步骤（5）基本相同，不同的是，将“红光620~625nm，蓝光460~465nm”替换为“普通荧光灯（白光）”、“红光620~625nm”、“蓝光460~465nm”、“绿光515~535nm”或将红光和蓝光的比例修改为1:1。
当光源为普通荧光灯（白光）时，平均每株苗生根数为3.5，平均根长为3.1cm，生根率为92.6%；当光源为红光620~625nm时，平均每株苗生根数为3.9，平均根长为3.7cm，生根率为93.2%；当光源为蓝光460~465nm时，平均每株苗生根数为4.2，平均根长为3.9cm，生根率为94.7%；当光源为红光和蓝光，比例为1:1时，平均每株苗生根数为4.5，平均根长为4.2cm，生根率为95.2%；当光源为绿光515~535nm时，平均每株苗生根数为2.4，平均根长为2.5cm，生根率为89.1%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种川贝母的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌处理：
选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体，将所述川贝母鳞茎进行灭菌；
（2）愈伤组织的诱导培养：
在无菌环境下，将灭菌后的所述川贝母鳞茎切割成粒径为0.4～0.6cm的小方块，接种到无外源激素愈伤组织诱导培养基中，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+150~250g/L椰子汁+30~50g/L马铃薯汁+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，光强10~15μmo1•m-2•s-1，光照周期10~15h/d培养15~25天；
（3）小鳞茎分化培养：
将诱导后得到的块状愈伤组织接种到无外源激素小鳞茎分化培养基中，所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+80~120g/L椰子汁+100~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强15~25μmo1•m-2•s-1，所述蓝光和所述红光光强的比例为（7~9）:（1~3），光照周期10~15h/d培养20~25天；
（4）增殖培养：
选择分化培养后的生长旺盛的健康的小鳞茎，切下，接种到无外源激素增殖培养基中，所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~150g/L椰子汁+150~200g/L香蕉泥+50~70mg/L柠檬酸+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm, 绿光515~535nm，光强20~40μmo1•m-2•s-1，所述红光、所述蓝光和所述绿光光强的比例为1:（7~9）:1，光照周期10~15h/d培养25~30天；
（5）生根培养：
将经由增殖培养得到的小鳞茎丛剥落分离成单独的小鳞茎个体，基盘向下轻插入无外源激素生根培养基中，所述无外源激素生根培养基为MS培养基+20~40g/L蔗糖+4~7g/L琼脂+100~200g/L香蕉泥+50~80g/L苹果汁+1~3g/L活性炭；培养条件如下：
以LED作为组织培养光源，红光620~625nm，蓝光460~465nm，光强30~50μmo1•m-2•s-1，所述红光和所述蓝光光强的比例为（2~4）:（6~8），光照周期10~15h/d培养25~35天。
2.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（1）中：
于每年3月20~31日，选取新鲜、健康的川贝母鳞茎为外植体。
3.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素小鳞茎分化培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素增殖培养基的pH值为5.5～5.9；所述无外源激素生根培养基的pH值为5.5～5.9。
4.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，所述无外源激素愈伤组织诱导培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+200g/L椰子汁 +40g/L马铃薯汁+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素小鳞茎分化培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+100g/L椰子汁+150g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸；所述无外源激素增殖培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+120g/L椰子汁+180g/L香蕉泥+60mg/L柠檬酸+2g/L活性炭；所述无外源激素生根培养基为MS培养基+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+150g/L香蕉泥+60g/L苹果汁+2g/L活性炭。
5.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
6.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
7.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述培养条件还包括：温度为15~20℃，空气相对湿度为70%~80%。
8.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述培养条件还包括：温度为15~25℃，空气相对湿度为70%~80%。
9.根据权利要求1所述的川贝母的组织培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述灭菌处理包括以下步骤：
选取所述川贝母鳞茎为外植体，在自来水下，用软毛刷清洗干净泥土，去除鳞茎须根，再蘸取洗洁精稀释溶液清洗所述外植体表面，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，用75%的乙醇浸泡10s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，每次2分钟，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。
10.如权利要求1~9任一项所述的川贝母的组织培养方法在规模化培育川贝母中的应用。
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