CN115812595B - 一种川贝母人工种子制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种川贝母人工种子制备方法。通过优化川贝母外植体诱导成愈伤组织、愈伤组织分化过程使用的最佳培养基、以及胚乳胶液成分和人工种皮成分进行的筛选，最终得到一套系统的、生根率稳定的川贝母人工种子制备方法。本发明的技术方案中，所述胚乳胶液的成分为：3％海藻酸钠+3％蔗糖+MS+6‑BA+NAA+多菌灵+活性炭。所述6‑BA的浓度为1.5‑2mg/L，所述NAA的浓度为0.4‑0.5mg/L，所述多灵菌的浓度为1.0‑1.5g/L，所述活性炭的浓度为1.0‑1.5g/L。通过该方法，能提升川贝母药源的供应，以满足日益增长的生产和临床需要。本发明建立了一个具有稳定、出苗率高、便捷简单经济实用的川贝母人工种子技术体系，对川贝母种源扩大，资源危机缓解有积极作用。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种川贝母人工种子制备方法。
背景技术
川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)多年生草本药用植物，属百合科贝母属。喜冷凉气候条件，气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，因此主产于海拔3500～4500m的高海拔地区。其干燥鳞茎在临床上具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈等功效。自身生理特性及生长环境的限制，自然条件下种群更新缓慢，作为名贵中药材价格昂贵，加之无计划盲目采挖，已致野生资源锐减，不得已以人工栽培方式补充。人工繁育下的川贝母主要以种子及鳞茎繁殖为主，其中，种子生理和形态后熟，存在育苗周期长，萌发率低，出苗不整齐等问题；而以鳞茎为种源，则直接减少了川贝母药源的供应，且繁殖系数偏低，已经难满足日益增长的生产和临床需要。因此，通过离体培养提供大量优质种苗有望成为解决川贝母资源短缺的有效新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的川贝母种子存在育苗周期长，萌发率低，人工种子不易生根的缺陷，提供一种川贝母人工种子制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
步骤1、将川贝母的无菌苗鳞茎作为外植体接种于第一培养基中，诱导形成愈伤组织；
步骤2、将所述愈伤组织转移至第二培养基进行分化诱导得到愈伤组织块；
步骤3、将步骤2得到的所述愈伤组织块用胚乳胶液与CaCl2溶液进行第一次包埋；所述胚乳胶液为质量浓度为3％的海藻酸钠溶胶，所述胚乳胶液还含有MS培养基、至少一种植物生长调节剂和蔗糖；络合反应形成固态人工种子；所述植物生长调节剂为NAA、KT、GA3、6-BA、2，4-D中的任意一种或几种的组合；所述刺激生长物质包括多菌灵、青霉素、活性炭、壳聚糖中的任意一种或几种的组合；
步骤4、将步骤3得到的第一次包埋完成的人工种子再投入外种皮凝胶溶液进行第二次包埋，所述外种皮凝胶为质量浓度为2％的海藻酸钠溶液，所述外种皮凝胶还包括至少一种抗菌剂成分。
人工种子是利用离体培养产生的体细胞胚或能发育成完整植株的器官组织作为人工种胚，再以凝胶基质混合其他影响植物生长发育的物质组成人工胚乳包被固化人工种胚，最后在最外层包裹一至多层具有保护功能的人工种皮制成的可萌发成苗的球状颗粒。通过离体培养方式得到优质的种苗以解决川贝母育苗周期长，萌发率低，出苗不整齐的问题。在进行人工种子研究的过程中，通过对人工种子制备的每个环节中使用的培养基的优化，以及胚乳胶液成分人工种皮的成分的大量筛选，最终形成了一套系统高效的川贝母人工种子制备方法。各个步骤直接相互配合，协同增效，共同实现了高萌芽率的人工川贝母种子制备。
作为本发明的优选技术方案，所述第一培养基的成分包括：MS培养基和1.0mg/LPicloram，于温度为20±2℃，光照强度3000Lx，光照周期为12h/d的培养条件进行培养。
对所述第二培养基的成分进行筛选过程中发现，当分化率最高的时候，达84.62％；但每块愈伤组织中，平均分化芽数为3.22个，随着培养时间的延长，形成的小鳞茎开始生根，但整体长势较弱，只有少许鳞茎抽叶。而分化率次之的培养基中，分化率为77.92％；平均分化芽数可达6.71个，45d后形成芽丛并开始抽叶，更适合用作愈伤组织分化培养。作为本发明的优选技术方案，所述第二培养基的成分包括：MS培养基、1.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA。
作为本发明的优选技术方案，所述第二培养基的成分包括：MS培养基、1.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA，于温度为20±2℃，光照强度3000Lx，光照周期为12h/d的培养条件进行培养。
作为本发明的优选技术方案，步骤1中，将外植体切成0.5cm×0.5cm大小的组织块，在所述第一培养基中培养45d。其中所述第一培养基的配方为愈伤组织诱导率最高的激素配比。其诱导率高达84.93％。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤2中，分化得到的愈伤组织块为直径小于0.6cm的小鳞茎；所述小鳞茎在第二培养基中的生长时间为45d。
作为本发明的优选技术方案，所述胚乳胶液的组成以及相互之间的配比对于后期人工种子的生根影响较明显；通过研究不同的胚乳胶液，添加不同的成分，在人工环境下培养，比较不同的因素对川贝母人工种子萌发率的影响，从而筛选出最佳的种皮基质成分配方；为川贝母人工种子技术的产业化生产提供技术支持和理论依据。
其中，基本包埋材料包括海藻酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素、硝基纤维素和壳聚糖；植物生长调节剂中包括NAA、KT、GA3、6-BA、2，4-D；刺激生长的物质包括：蔗糖，防腐剂，抗菌剂：多菌灵、青霉素；以及营养吸附解析剂：活性炭。
海藻酸钠物质透水及塑性效果好，因而可以将蔗糖、MS和植物生长调节剂等形成固体培养基包裹于川贝母鳞茎外面，提供萌发和生长的基本营养物质；蔗糖用于提供组织培养过程中植物生长的碳源。刺激生长物质在人工种子制备过程中对人工种子萌发、生长有刺激作用的物质。其中，海藻酸钠和蔗糖均采用重量比重单位。当配制1kg的培养基时，需要海藻酸钠的质量为0.03kg。蔗糖的称量原理与海藻酸钠一致。
在第一次包埋过程中，胚乳胶液的制备过程如下：以海藻酸钠为基本包埋材料，通过添加不用用量、浓度的植物生长调节剂、抗菌剂以及营养吸附解析剂，调制成半凝胶态溶液备用，高压蒸汽灭菌冷却后备用。
其中，具体的，所述MS培养基，是目前植物组织培养普遍使用的培养基。该培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养。本申请中所用为MS固体培养基可用于愈伤组织、小鳞茎、根等组织诱导，也可用于胚、茎段、茎尖和花药等植物器官的培养。
作为本发明的优选技术方案，所述胚乳胶液的成分包括：质量浓度为3％的海藻酸钠溶胶、MS培养基、3％蔗糖、1.5-2mg/L 6-BA、0.4-0.5mg/L NAA、1.0-1.5g/L多菌灵和1.0-1.5g/L活性炭。
上述物质中优选的海藻酸钠溶胶为种子发育提供强力支持，优选的MS培养基和蔗糖为萌发提供充足营养，合理配比的激素组合对种子的萌发起到良好的诱导效果，活性炭为种子萌发提供基部黑暗诱导环境，多菌灵限制不利微生物的生长，提供适宜的生长环境，以上所筛选的胚乳胶液成分可有效影响川贝母人工种子的生根。
作为本发明的优选技术方案，所述外种皮凝胶的成分包括：2％的海藻酸钠溶液、1.0-1.5g/L多菌灵。
作为本发明的优选技术方案，所述外种皮凝胶中，还包括菌悬液，所述菌悬液为：对川贝母种子灭菌后，除去种皮对胚乳内所含内生菌进行混合培养48h，超高速离心所得菌体沉淀所制凝胶悬浊液。即1L培养液所得沉淀，定容到100mL，取50mL定容到1L，即得到用于包裹得外种皮凝胶。该凝胶悬浊液用于单次包埋之后，二次包埋过程中进行添加。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤1中，在进行愈伤组织诱导前，需要对外植体进行清洗、消毒工作；具体的，选取表面完整无明显伤口的川贝母鳞茎，用稀释后的洗洁精水浸泡一段时间,去除表面的泥土、腐烂的须根，分成鳞瓣和鳞心，无菌水冲洗多次得到外植体备用。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤3中，高压蒸汽灭菌冷却后的所述胚乳胶液与步骤2中分化的小鳞茎混合3-4min，然后加入2％CaCl2溶液进行离子交换反应10-15min，反应完成后，通过无菌水冲洗多遍，再以无菌滤纸吸干表面的水分，即完成第一次包埋。利用CaCl2作为络合剂使海藻酸钠发生离子交换并形成海藻酸钙胶囊从而完成种皮的包被。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤3中，单次包埋完成后，将包埋完成的种子投入外种皮凝胶溶液中进行第二次包埋8-10min，反应完成后，通过无菌水冲洗多遍，再以无菌滤纸吸干表面的水分，即完成了人工种子的制备。所述步骤3中，所述胚乳胶液和所述外种皮凝胶的组合物最优配比的选择均采取L9(3*4)正交实验得到；以壳聚糖、多菌灵和活性炭分别作为供试因素。
将上述方法得到的人工种子以MS为基本培养基，附加30.0g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，调节pH到5.8～6.0后，121℃，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min。在温度为(20±2)℃，光照强度2000Lx，光照周期为12h/d条件下进行萌发验证。经过一次包埋反应和两次包埋反应；无菌条件下萌发率最高分别为83.77％和61.33％，这充分体现出本发明的技术方案体系在川贝母人工种子制备方面的可靠性。种苗发育要突破两层比单层难，因而对萌发率有一定影响，虽然双层发芽率没有单层包埋的高，但就种子的机械强度，所长出来的幼苗，状态而言，双层包埋筛选后的质量较好。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
人工种子是利用离体培养产生的体细胞胚或能发育成完整植株的器官组织作为人工种胚，再以凝胶基质混合其他影响植物生长发育的物质组成人工胚乳包被固化人工种胚，最后在最外层包裹一至多层具有保护功能的人工种皮制成的可萌发成苗的球状颗粒。通过离体培养方式得到优质的种苗以解决川贝母育苗周期长，萌发率低，出苗不整齐的问题。
以现代植物组织培养技术为依托，构建一个具有体系稳定、出苗率高、便捷简单经济实用的川贝母人工种子技术体系，为川贝母种源扩大，奠定了良好的基础。
附图说明：
图1为本发明所制川贝母人工种子；
图2为川贝母人工种子萌发初期状况；
图3为川贝母人工种子生根状况。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明在研究川贝母人工培育的过程中，为了解决川贝母在人工栽培的过程中，由于川贝母自身种子生理和形态后熟，导致育苗周期长、萌发率低，出苗不整齐等缺陷，从愈伤组织诱导、分化以及人工种子的单层、双层包埋等阶段出发，对可能促进川贝母人工种子生根的因素进行了一系列的研究。
MS固体培养基的具体配制如下表1所示：
表1为MS固体培养基的成分表
其中，植物生长调节剂的原液配制方式如下：
浓度一般为0.5～1.0mg/mL，配制100mL，需用0.000 1g的电子天平准确称取药品，NAA、IAA、IBA、2,4-D等生长素先用95％酒精溶解，KT、BA等细胞分裂素可用1mol/L盐酸溶解，再加少量蒸馏水直接配制。
母液配制完成后，参照以下(a)(b)公式具体配制所用培养基：
(a)
(b)
在配制具体过程中，每升添加20g琼脂，灭菌后分装灭菌即可。
实施例1
愈伤组织诱导
愈伤组织在诱导过程中，最重要的是培养基的选择，本实施例中，分别制备添加有不同的植物生长调节剂的培养基，将无菌苗鳞茎外植体，切成0.5cm×0.5cm大小的组织块后，添加进不同植物调节剂的培养基中，每个培养皿接种6块，每处理5皿，3次重复。45d后统计愈伤组织诱导率，并记录愈伤组织生长状态，以筛选最优愈伤诱导培养基配方。实验结果总结如下表2所示：
表2不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响(％)
从表2中可以看出，当在MS培养基中添加1.0mg·L-1的Picloram培养基得到的愈伤组织的诱导率最高。后续的分化等过程中，均以实施例1-5中的第一培养基配比进行诱导。
实施例2
愈伤组织分化
将通过实施例1-5的第一培养基诱导出的蛋黄色的愈伤组织切成黄豆大小的小块，进一步考查不同的激素组成对愈伤组织分化的影响，以MS为基本培养基，附加30.0g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，再按照如表2的植物生长调节剂进行不同培养基的配制，调pH 5.8～6.0后，121℃，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min。其中，培养温度为(20±2)℃，光照强度2000Lx，光照周期为12h/d培养。每处理25块愈伤组织，3次重复，45d后统计愈伤组织再分化率及再生系数，并对愈伤组织再分化状态进行观察。
表3为不同的植物生长调节剂组合对愈伤组织分化的影响
将诱导出的淡黄色疏松愈伤组织转接到分化培养基上，10d愈伤组织体积呈现增大趋势，且凸出部分颜色转为黄绿色；20d左右开始有少量的不定芽(小鳞茎)产生，45d后长出密集的不定芽丛，且部分芽开始长叶。不同组合和浓度的植物生长调节物质是引起愈伤组织再分化的关键因素。由表3可知，在不同的植物生长调节剂组合中，以添加1.0mg/L NAA+1.0mg/L 2,4-D的MS培养基愈伤组织再分化率最高为84.62％，每块愈伤组织平均分化芽数为3.22个，随着培养时间的延长，形成的小鳞茎开始生根，但整体长势较弱，只有少许鳞茎抽叶。而添加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA的MS培养基，分化率为77.92％，平均分化芽数可达6.71个，45d后形成芽丛并开始抽叶，更适合用作愈伤组织分化培养。故选择该条件下(1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)的MS培养基，进行后续的人工种子的研究。
实施例3
人工胚乳和种皮组分的筛选：
人工胚乳胶液的成分的组成为：(3％海藻酸钠+3％蔗糖+MS+植物生长调节剂+刺激生根物质)
植物生长调节物质中大类主要分为生长素、细胞分裂素等，其中，常用的有IAA、IBA、PAA等，以及人工合成的2，4-D、NAA、NOA等，其中以IAA、NAA、2，4-D应用最广泛，IAA稳定性差，培养基中易被氧化，2，4-D和NAA为常用，两者配合使用在川贝母诱导过程中发现效果最好。细胞分裂素主要用于刺激细胞分裂、诱导愈伤、胚状体形成和促进芽分化，常用的主要有KT、6-BA、ZT等，其中，以6-BA为常用；同时，在川贝诱导过程中，增殖效果最佳。综上所述本专利结合以往研究选择6-BA、NAA和2，4-D为主要植物生长调控剂，同时，为了缩减研究时间，本发明采取了L9正交实验法对刺激生根物质的组成以及最佳浓度进行了优化。
具体的，包括以下物质：
细胞分裂素6-BA(浓度为1.0mg/L、2.0mg/L)
生长素NAA(浓度为0.3mg/L、0.5mg/L)
2，4-D(浓度为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L)
通过单层包埋方法，进行单因素试验，确定适合人工种子萌发生根的植物生长调节剂组成及浓度为2.0mg/L6-BA，0.5mg/L NAA。
以此为基础，分别以壳聚糖、多菌灵、活性炭为供试因素，按照L9(34)正交试验表设计试验，通过单层包埋及双层包埋的方法，考察其对人工种子萌发的影响。如表4所示为正交实验数据表：
表4不同物质添加对人工种子萌发的影响
注：K值为同一水平的平均值，R为极差。
表5为上述三种物质对人工种子萌发影响的正交试验方差分析
实验结果：对不同处理的川贝母人工种子萌发率进行极差分析，表4结果显示参试因素对人工种子萌发的影响顺序为壳聚糖＞多菌灵＞活性炭。由表5的方差分析结果可知，川贝母单层人工种子胚乳中其他物质的最佳组合为A1B1C2，即3％海藻酸钠+3％蔗糖+MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1.0g/L多菌灵+1.0g/L活性炭适合作为单层人工种子的胚乳组分。对于双层包埋的人工种子而言，说明参试因素对人工种子萌发的影响顺序为壳聚糖＞活性炭＞多菌灵。方差分析结果中表明，壳聚糖和活性炭对人工种子萌发的影响存在极显著差异(P＜0.05)，多菌灵对人工种子萌发的影响未达到显著差异水平(P＞0.05)。这说明其他添加物对双层人工种子萌发的影响壳聚糖与活性炭占主导作用，方差分析结果与极差分析结果一致。因此，川贝母双层人工种子外种皮中其他物质的最佳组合为A1B1C1，即海藻酸钠(2％)+多菌灵(1.0g/L)适合构成外种皮凝胶基质。如图1-3所示，为川贝母人工种子以及萌发初期到生根的图片。
实施例4
发明人在研究的过程中，发现，加入一定量的种子内生菌对于人工种子的的萌发具有很好的效果，具体的，将种子内生菌研磨成粉末，并按比例与外种皮凝胶基质混合，用于进行第二次包埋，得到的人工种子以MS为基本培养基，附加30.0g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，调节pH到5.8～6.0后，121℃，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min。在温度为(20±2)℃，光照强度2000Lx，光照周期为12h/d条件下进行萌发验证。经过实施例4方式，通过一次包埋将川贝母种带内生细菌与外植体材料直接接触，考察其对人工种子萌发的影响。无菌环境下，30d后人工种子萌发率均低于30％，且随着培养时间的延长，死亡率逐渐升高，60d后全部死亡。自然环境移栽播种的人工种子，经过低温打破休眠处理，60d后萌发率分别可达到25.1％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种川贝母人工种子制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将川贝母的无菌苗鳞茎作为外植体接种于第一培养基中，诱导形成愈伤组织；所述第一培养基由MS培养基和1.0mg/L Picloram组成，于培养温度为20±2℃，光照强度3000 Lx，光照周期为12h/d的培养条件下进行培养；
步骤2、将所述愈伤组织转移至第二培养基进行分化诱导得到愈伤组织块；所述第二培养基由MS培养基、1.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA组成，于培养温度为20±2℃，光照强度3000 Lx，光照周期为12h/d的培养条件下进行培养；
步骤3、将步骤2得到的所述愈伤组织块用胚乳胶液与CaCl2溶液进行第一次包埋；所述胚乳胶液由质量浓度为3%的海藻酸钠溶胶、MS培养基、3%蔗糖、1.5-2mg/L 6-BA、0.4-0.5mg/L NAA、1.0-1.5 g/L 多菌灵和1.0-1.5 g/L活性炭组成；
步骤4、将步骤3得到的第一次包埋完成的人工种子再投入外种皮凝胶溶液进行第二次包埋；所述外种皮凝胶由2%的海藻酸钠溶液、1.0-1.5 g/L多菌灵和菌悬液组成，所述菌悬液为：对川贝母种子灭菌后，除去种皮对胚乳内所含内生菌进行混合培养48 h，超高速离心所得菌体沉淀所制凝胶悬浊液。
2.根据权利要求1所述的川贝母人工种子制备方法，其特征在于，步骤1中，将外植体切成0.5 cm × 0.5 cm大小的组织块，在所述第一培养基中培养45d。
3.根据权利要求2所述的川贝母人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述愈伤组织块为直径小于0.6cm的小鳞茎；所述小鳞茎在第二培养基中的生长时间为45d。
4.根据权利要求1所述的川贝母人工种子制备方法，其特征在于，所述步骤1中，在进行愈伤组织诱导前，需要对外植体进行清洗、消毒工作：选取表面完整无明显伤口的川贝母鳞茎，用稀释后的洗洁精水浸泡一段时间，去除表面的泥土、腐烂的须根，分成鳞瓣和鳞心，无菌水冲洗多次得到外植体备用。
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