CN111374055A - 一种翅果油树人工种子的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种翅果油树人工种子的制作方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，外植体的采集及消毒灭菌处理；步骤2，外植体的接种，得到愈伤组织；步骤3，将步骤2所得的愈伤组织接种到诱导愈伤组织的再分化培养基中，诱导形成胚状体；步骤4，在预先配制的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1mg/L青霉素；在预先配制的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L的IBA和7～9mg/L的NAA；将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚；步骤5，采用水凝胶法包埋人工种子。通过在一定浓度及环境的培养基中培养，获得发芽率高，生根能力强的翅果油树人工种子。

Description

一种翅果油树人工种子的制作方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种翅果油树人工种子的制作方法。

背景技术

翅果油树俗名泽绿旦、柴禾、车勾子等，是胡颓子科，胡颓子属落叶直立乔木或灌木，是我国特有的一种优良木本油料树种，并含有丰富的多种不饱和脂酸，且出油率为35％，质量与花生油菜籽相近。翅果油树是一种药用价值、营养价值都很高的资源植物，已被用于生产防治心血管疾病药物的保健品。翅果油树的花含蜜量高，在早春是一种重要的蜜源之一。翅果油树有较高的抗旱能力、耐旱、耐瘠薄，起源于古老的第三纪时期，是经第四世纪冰川作用后残存下来的中国特有的古生物物种，国家二级保护植物，并编入世界自然和自然资源保护国同盟 IUCN植物红皮书。原始种星散分布于山西和陕西局部地区，在陕北地区曾有零星分布。其多生长于海拔800-1500m的山坡，多见于阴坡和半阴坡，阳坡也有分布。具有喜光、抗寒、抗风、耐干旱和贫瘠土壤的特性，适宜在干旱地区生长。翅果油树全身是宝，是特有的优良乡土树种，木材棕褐色，木质坚硬有光泽，纹理细致，是制作上等家具的好材料。翅果油树的叶子还可做饲料。该树种具有适应性强，抗早耐寒、根瘤固氮作用，其生长迅速，根系发达，是保持水土、绿化荒山的先锋树种及早春蜜源植物。据国家重点实验室分析研究，翅果油树翅果种仁含油量达45％以上，翅果油中含有95％以上的不饱和脂肪酸，其中油酸及亚油酸含量极为丰富，88％以上，油酸与亚油酸含量丰富的油脂对预防动脉硬化及对抵御自由基氧化具有重要作用。翅果油还含4％～6％的a亚麻酸，因此它具有降血脂、降胆固醇和促进脂肪代谢、肝细胞再生、促进大脑神经细胞发育等功效。翅果油中维生素E的含量达到1558.1mg/100g，不仅为各种油料之冠，而且为维生E8种异构体中质量最优的。采用高科技生物技术，可从翅果油树的种仁中分离提取出翅果油，具有较高的药用价值和经济价值。特别是依托资源优势，做为产业发展，既挽救了濒危物种，保护了珍稀树种资源，同时对山区农民脱贫致富具有重大的开发意义。翅果油树于1899年在陕西省户县涝峪山首次发现。

翅果油树于1899年在陕西省户县涝峪山首次发现，翅果油树起源于古老的第三纪时期，是第四世纪冰川作用后现存的特有古生物植物。

翅果油树有两种繁殖方式，其一为种子繁殖，但种子发芽率较低，未经任何处理的种子，发芽率为5.93％，发芽后能正常发育成籽苗的仅为 1.69％。经过沙积处理的种子的发芽率为45.76％，但发芽后能正常发育成苗的也仅为11.02％。另外，翅果油树种子的寿命也短，保存一年后其发芽率几乎为零，且自然状态下的种子苗很少；其二是通过植株根蘖苗繁殖，但根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低，而且通过这种营养繁殖方法长成的苗木病害严重。因此利用制作人工种子的方法来进行翅果油树的快速繁殖。

经过研究探索发现对翅果油树人工种子有着比正常种子高的多的发芽率和成功率，并且所得到的人工种子苗有很强的抗病虫害能力，更容易长成一棵成年的翅果油树。因此我们提出一种操作相对简单，成本低廉的人工种子制作方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种翅果油树人工种子的制作方法，解决了现有技术中，种子繁殖时，发芽率低，植株根蘖苗繁殖时，根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低的问题。

本发明所采用的技术方案是一种翅果油树人工种子的制作方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，外植体的采集及处理，采集翅果油树的当年生幼叶或幼芽，将叶片与茎分离，对叶片进行消毒灭菌；

步骤2，外植体的接种，消毒灭菌后的叶片接种至预配制的培养基中培养，得到愈伤组织；

步骤3，愈伤组织的再分化，将步骤3所得的愈伤组织接种到诱导愈伤组织的再分化培养基中，诱导形成胚状体；

步骤4，人工种皮、人工胚乳及人工种胚的制备；

在预先配制的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素，获取氯化钙水溶液；

在预先配制的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L的IBA和 7～9mg/L的NAA，获取半凝胶状态的海藻酸钠溶液；

人工种胚的制备，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚；

步骤5，人工种子的包埋，采用水凝胶法包埋人工种子。

首先采集外植体并接种获得胚状体，再制备氯化钙水溶液和半凝胶状态的海藻酸钠溶液，最后进行人工种子的包埋，获得翅果油树的人工种子；通过在一定浓度及环境的培养基中培养，及将人工种胚添加激素、抗生素及杀菌杀虫剂，获得发芽率高，根蘖苗自生根能力强的翅果油树人工种子。

本发明的特点还在于：

优选地，步骤1中，对采集的翅果油树的当年生幼叶或幼芽进行处理，按照以下步骤进行消毒灭菌处理：

步骤1.1，将外植体使用酒精浸泡；

步骤1.2，浸泡后的外植体再使用无菌水冲洗；

步骤1.3，使用0.1％的升汞溶液浸泡冲洗外植体；

步骤1.4，升汞浸泡消毒完成后，在超净工作台上使用无菌水冲洗。

外植体的消毒灭菌处理，为外植体的接种做良好的准备工作。优

选地，步骤2中培养基为添加有琼脂与蔗糖的MS培养基，培养基成分为MS+0.6～1.0mg/L 6-BA+0.08～0.1mg/LNAA。

MS培养基的无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，植物组织培养能够快速繁殖；细胞分裂素采用0.6～1.0mg/L 6-BA，具有高效、稳定、廉价和易于使用的特点；植物激素生长素采用0.08～0.1mg/L NAA(萘乙酸)，萘乙酸诱导细胞分裂与扩大。优

选地，步骤2中外植体接种至培养基中，光照条件为：前期为暗培养，后期光照为12-14h/天、光照强度为1500-2000lx。

优选地，步骤2中外植体接种至培养基中的培养温度，及步骤3 中愈伤组织在愈伤组织再分化培养基中的培养温度均为25±2℃。

25±2℃更有利于外植体的接种。

优选地，步骤3中诱导愈伤组织的再分化培养基成分为：MS+0.7～0.9mg/L 6-BA+0.03～0.07mg/L IBA。

MS培养基的无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，植物组织培养能够快速繁殖；细胞分裂素采用0.6～1.0mg/L 6-BA，具有高效、稳定、廉价和易于使用的特点；植物生长调节剂采用 0.03～0.07mg/LIBA(吲哚丁酸)，是一种人工合成的具有激素活性的物质，用于促进生根。

优选地，步骤3愈伤组织的再分化，光照条件为：15～17h/天、光照强度为2000-3000lx。

优选地，步骤4人工种子包埋前的准备工作，具体按照以下步骤实施：

步骤4.1，配制3％～4％的海藻酸钠和0.2～0.3mol/L的氯化钙；

步骤4.2，配制1.8～2.0mg/L的IBA、7～9mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L 的青霉素及0.2～0.3％的多菌灵粉剂；

步骤4.3，在配制完成的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素备用；

步骤4.4，在配制完成的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L 的IBA和7～9mg/L的NAA备用；

步骤4.5，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚。

人工种皮作为人工种子的外层保护基质，应该具有一定的强度，能够承受人工胚乳以及种胚的质量，保证种子在贮藏、运输等过程中的完整性；人工种胚生长发育和新陈代谢所需的生长调节物质及营养物质等均需人工胚乳提供。研究发现在人工胚乳中添加合适的激素可以提高人工种子的萌发率，并且在其中加入一些抗生素和一些杀菌杀虫剂可以增强植物对环境的适应性，提高其抗逆能力，并且不影响人工种子的发芽率和生长情况。此步骤4为步骤5水凝胶法获取人工种子做准备。

优选地，步骤4.5将胚状体剪碎至2～4mm，获得人工种胚。

2～4mm的人工种胚有利于采用水凝胶法获取人工种子。

优选地，步骤5采用水凝胶法包埋人工种子，具体按照以下步骤实施：

步骤5.1，将步骤4获取的人工种胚放入半凝胶状态海藻酸钠溶液中，使其悬浮并充分混合；

步骤5.2，吸取与半凝胶状态海藻酸钠溶液充分混合的人工种胚，滴入氯化钙水溶液中进行浸泡10～20min，获取人工种子；

步骤5.3，将步骤5.2获取的人工种子进行无菌水的冲洗，再吸取人工种子表面水分。

采用水凝胶法获取的人工种子具有发芽率高，重要率好的特点。本发明的有益效果：

本发明一种翅果油树人工种子的制作方法，首先采集外植体并接种获得胚状体，再制备氯化钙水溶液和半凝胶状态的海藻酸钠溶液，最后进行人工种子的包埋，获得翅果油树的人工种子；通过在一定浓度及环境的培养基中培养，及将人工种胚添加激素、抗生素及杀菌杀虫剂，获得发芽率高，根蘖苗自生根能力强的翅果油树人工种子。具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明为一种翅果油树人工种子的制作方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，外植体的采集及处理，采集翅果油树的当年生幼叶或幼芽，将叶片与茎分离，对叶片进行消毒灭菌；步骤2，外植体的接种，消毒灭菌后的叶片接种至预配制的培养基中培养，得到愈伤组织；步骤3，愈伤组织的再分化，将步骤2所得的愈伤组织接种到诱导愈伤组织再分化的培养基中，诱导形成胚状体。步骤4，人工种子包埋前的准备工作；在预先配制的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素，获取氯化钙水溶液；在预先配制的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L的IBA和7～9mg/L的NAA，获取半凝胶状态的海藻酸钠溶液；人工种胚的制备，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚；步骤5，人工种子的包埋，采用水凝胶法包埋人工种子。

首先采集外植体并接种获得胚状体，再制备氯化钙水溶液和半凝胶状态的海藻酸钠溶液，最后进行人工种子的包埋，获得翅果油树的人工种子；通过在一定浓度及环境的培养基中培养，及将人工种胚添加激素、抗生素及杀菌杀虫剂，获得发芽率高，根蘖苗自生根能力强的翅果油树人工种子。

在4-5月份去采集当年生的幼嫩的叶片和幼嫩的芽，采集时挑选健康无病虫害、颜色正常、主干长势好、生长活性强的叶片与芽。采集完成后将材料放入自封袋中并尽快进行处理、消毒灭菌、完成接种，防止叶片与芽水分蒸发，影响其分化为愈伤组织的活性。

实验前给实验室紫外消毒30min，用高压锅灭菌培养瓶、镊子、自来水、移液枪头，配制含琼脂和蔗糖的MS培养基和所需的激素母液，母液为1mg/mL 6-BA、1mg/mL IBA、1mg/mLNAA。配制好的培养基在使用前需要进行高压灭菌锅灭菌。配制好的激素需要用水溶性的针管过滤头进行过滤后放于冰箱中冷冻。高压锅的使用条件为121℃、 18min。

外植体采集完成后用剪刀将叶片与茎分开，将有损伤或者干枯变色的叶片丢掉，然后将剩余的叶片放置在流动的水下冲洗2h，冲洗完成后进行常规消毒灭菌。按照以下步骤进行消毒灭菌处理：步骤1.1，将外植体使用酒精浸泡；步骤1.2，浸泡后的外植体再使用无菌水冲洗；步骤1.3，使用0.1％的升汞溶液浸泡冲洗外植体；步骤1.4，升汞浸泡消毒完成后，在超净工作台上使用无菌水冲洗。

优选在步骤1.1中，将外植体使用70％酒精浸泡8min；步骤1.2 中，浸泡后的外植体再使用无菌水冲洗3次；步骤1.3中，使用0.1％的升汞溶液浸泡冲洗过的外植体5min；步骤1.4中，升汞浸泡消毒完成后，在超净工作台上使用无菌水进行冲洗。

按一定顺序且严谨的消毒灭菌，为外植体的接种做良好的准备工作。

在MS培养基中添加琼脂与蔗糖，将配制好的MS培养基放到灭菌锅中进行灭菌，灭菌完成后将培养基放入超净工作台中，待其冷却至 50℃左右时加入所需的激素。培养基成分为MS+0.6～1.0mg/L 6-BA +0.08～0.1mg/LNAA，配制激素的母液为1mg/mL 6-BA、1mg/mLNAA，配制的培养基量为1000ml，所以所需IBA 600～1000微升、NAA 80～100微升。

当培养基成分为MS+0.8mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA时，能够产生的愈伤组织数量最多。

将激素用移液枪量取上述量后加入到培养基中，激素添加完成后将培养基分装到培养瓶中，每瓶约50ml培养基，分装完成后放于超净工作台待其冷却凝固。培养基冷却凝固完成后将上述消毒灭菌完成的外植体接种在培养基中。以上所有操作必须在超净工作台完成，超净工作台在使用前需提前30min开紫外灯进行灭菌，操作时必须关闭紫外灯并打开风扇点燃酒精灯

接种完成后在培养瓶上做好记录，将培养瓶取出，放在25±2℃光照条件为前期暗培养，后期光照条件为12-14h/天、光照强度为 1500-2000lx的条件下进行培养。接种后15-20天就会产生足够数量的愈伤组织。

步骤3，愈伤组织的再分化，将步骤2所得的愈伤组织接种到诱导愈伤组织再分化的培养基中，诱导形成胚状体。

在超净工作台上将得到的愈伤组织用已消毒的镊子轻轻取出，注意不要损伤到愈伤组织。然后在接种到诱导愈伤组织再分化的培养基中，诱导愈伤组织形成胚状体。培养基成分为MS+0.7～0.9mg/L 6-BA +0.03～0.07mg/LIBA，配制激素的母液为6-BA1mg/mL、IBA1mg/mL，配制的培养基量为1000ml，所以所需6-BA 700～900微升、IBA 30～70微升。培养基的配制方式与配制上述诱导愈伤组织培养基的方式相同，只在激素的种类和数量上有区别。诱导愈伤组织再分化为胚状体的培养条件为温度25±2℃，光照条件为光照15～17h/天，光照强度为2000- 3000lx。以上所有操作必须在超净工作台完成，超净工作台在使用前需提前30min开紫外灯进行灭菌，操作时必须关闭紫外灯并打开风扇点燃酒精灯。

当培养基成分为MS+0.8mg/L 6-BA+0.05mg/LNAA时，能够再分化出的胚状体数量最多。

步骤4，步骤4人工种子包埋前的准备工作，具体按照以下步骤实施：

步骤4.1，配制3％～4％的海藻酸钠和0.2～0.3mol/L的氯化钙；

步骤4.2，配制1.8～2.0mg/L的IBA、7～9mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L 的青霉素及0.2～0.3％的多菌灵粉剂；

步骤4.3，在配制完成的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素备用；

步骤4.4，在配制完成的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L 的IBA和7～9mg/L的NAA备用；

步骤4.5，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚。

人工种皮的制备，海藻酸钠和氯化钙反应得到人工种皮，人工种皮作为人工种子的外层保护基质，应该具有一定的强度，能够承受人工胚乳以及种胚的质量，保证种子在贮藏、运输等过程中的完整性。配制 3～4％海藻酸钠溶液和0.2～0.3mol/L CaCl2溶液各1000ml，然后在配制完成的CaCl2溶液中加入2～3g多菌灵粉剂(配制0.2～0.3％多菌灵粉剂)，消毒灭菌完成后放于超净工作台上留待使用。然后配制 0.1～0.2mg/ml青霉素，在超净工作台外配制完成后给其表面进行消毒放入超净工作台中，利用过滤头过滤后留待使用。

人工胚乳的制备，在人工胚乳中添加激素，抗生素及杀菌杀虫剂；人工种胚生长发育和新陈代谢所需的生长调节物质及营养物质等均需人工胚乳提供。研究发现在人工胚乳中添加合适的激素可以提高人工种子的萌发率，并且在其中加入一些抗生素和一些杀菌杀虫剂可以增强植物对环境的适应性，提高其抗逆能力，并且不影响人工种子的发芽率和生长情况。人工胚乳成分为：1.8～2.0mg/L的IBA、7～9mg/L的NAA、 0.1～0.2mg/L的青霉素及0.2～0.3％的多菌灵粉剂。

配制激素的母液为1mg/mLIBA、1mg/mLNAA、1mg/ml青霉素，配制的海藻酸钠溶液和CaCl2溶液的量为1000ml，所以所需IBA 2000 微升、NAA 8000微升、青霉素100微升。按上述量添加激素，用移液枪量取加入到上述配制的海藻酸钠和CaCl2溶液中，IBA、NAA 加入到海藻酸钠溶液中，青霉素加入到CaCl2溶液中。上述操作均在已预先消毒的超净工作台完成，并且所用的所有仪器都需提前高压锅灭菌。

人工种胚的制备，将步骤3所得胚状体剪碎至2～4mm，得到人工种胚；将愈伤组织在步骤3的条件下诱导脱分化10-15天后，可得到胚状体，再在超净工作台将分化形成的胚状体用已消毒的镊子轻轻地放置在已消毒培养皿上，然后用已消毒的剪刀将胚状体剪成大小约2- 4mm作为人工种子的人工种胚。在用剪刀操作时尽量小心轻微，保证胚状体结构受到最小限度的损伤。在制备人工种胚前，需先将人工种皮和人工胚乳制备完成。

步骤5，人工种子的包埋，采用水凝胶法包埋人工种子。是否能够成功的包埋种子，对其萌发、贮藏、生产和应用有重要的基础意义。包埋成功的人工种子应能够正常萌发，具有一定的抗压性，能够经受种子在运输、贮存等过程中产生的碰撞而不会产生营养物质的泄露和种皮的碎裂。

采用水凝胶法包埋人工种子，具体按照以下步骤实施：步骤5.1，将步骤4获取的人工种胚放入半凝胶状态海藻酸钠溶液中，使其悬浮并充分混合；

步骤5.2，吸取与半凝胶状态海藻酸钠溶液充分混合的人工种胚，滴入氯化钙水溶液中进行浸泡10～20min，获取人工种子；

步骤5.3，将步骤5.2获取的人工种子进行无菌水的冲洗，冲洗 2～3次，再置于滤纸上吸取人工种子表面水分。

步骤4配制半凝胶状态的海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液，为步骤 5包埋人工种子做准备，半凝胶状态的海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液配制各成分对发芽率和生根率的对比如下表所示：

由以上六次实验可知，半凝胶状态的海藻酸钠溶液的最佳配制为： 4％海藻酸钠+2mg/L IBA+8mg/L NAA，氯化钙水溶液的最佳配制为： 0.2mol/L氯化钙+0.3g/L多菌灵粉剂+0.1mg/L青霉素，离子交换时间为15分钟，此条件下发芽率和生根率可达90％以上。

综上，本发明一种翅果油树人工种子的制作方法，解决了现有技术中，种子繁殖时，发芽率低，植株根蘖苗繁殖时，根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低的问题。首先采集外植体并接种获得胚状体，再制备氯化钙水溶液和半凝胶状态的海藻酸钠溶液，最后进行人工种子的包埋，获得翅果油树的人工种子；通过在一定浓度及环境的培养基中培养，及将人工种胚添加激素、抗生素及杀菌杀虫剂，获得发芽率高，根蘖苗自生根能力强的翅果油树人工种子。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：具体按照以下步骤实施：

步骤1，外植体的采集及处理，采集翅果油树的当年生幼叶或幼芽，将叶片与茎分离，对叶片进行消毒灭菌；

步骤2，外植体的接种，消毒灭菌后的叶片接种至预配制的培养基中培养，得到愈伤组织；

步骤3，愈伤组织的再分化，将步骤2所得的愈伤组织接种到诱导愈伤组织的再分化培养基中，诱导形成胚状体；

步骤4，人工种子包埋前的准备工作；

在预先配制的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素，获取氯化钙水溶液；

在预先配制的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L的IBA和7～9mg/L的NAA，获取半凝胶状态的海藻酸钠溶液；

所述人工种胚的制备，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚；

步骤5，人工种子的包埋，采用水凝胶法包埋人工种子。

2.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤1中，对采集的翅果油树的当年生幼叶或幼芽进行处理，按照以下步骤进行消毒灭菌处理：

步骤1.1，将外植体使用酒精浸泡；

步骤1.2，浸泡后的外植体再使用无菌水冲洗；

步骤1.3，使用0.1％升汞溶液浸泡冲洗外植体；

步骤1.4，升汞浸泡消毒完成后，在超净工作台上使用无菌水冲洗。

3.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤2中培养基为添加有琼脂与蔗糖的MS培养基，培养基成分为MS+0.6～1.0mg/L 6-BA+0.08～0.1mg/L NAA。

4.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤2中外植体接种至培养基中，光照条件为：前期为暗培养，后期光照为12-14h/天、光照强度为1500-2000lx。

5.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤2中外植体接种至培养基中的培养温度，及步骤3中愈伤组织在愈伤组织再分化培养基中的培养温度均为25±2℃。

6.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤3中诱导愈伤组织的再分化培养基成分为：MS+0.7～0.9mg/L 6-BA+0.03～0.07mg/L IBA。

7.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤3愈伤组织的再分化，光照条件为：15～17h/天、光照强度为2000-3000lx。

8.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤4人工种子包埋前的准备工作，具体按照以下步骤实施：

步骤4.1，配制3％～4％的海藻酸钠和0.2～0.3mol/L的氯化钙；

步骤4.2，配制1.8～2.0mg/L的IBA、7～9mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L的青霉素及0.2～0.3％的多菌灵粉剂；

步骤4.3，在配制完成的0.2～0.3mol/L的氯化钙中加入0.2～0.3％多菌灵粉剂，再加入0.1～0.2mg/L青霉素备用；

步骤4.4，在配制完成的3％～4％的海藻酸钠中加入1.8～2.0mg/L的IBA和7～9mg/L的NAA备用；

步骤4.5，将步骤3所得胚状体剪碎，得到人工种胚。

9.根据权利要求8所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤4.5将胚状体剪碎至2～4mm，获得人工种胚。

10.根据权利要求1所述的翅果油树人工种子的制作方法，其特征在于：所述步骤5采用水凝胶法包埋人工种子，具体按照以下步骤实施：

步骤5.1，将步骤4获取的人工种胚放入半凝胶状态海藻酸钠溶液中，使其悬浮并充分混合；

步骤5.2，吸取与半凝胶状态海藻酸钠溶液充分混合的人工种胚，滴入氯化钙水溶液中进行浸泡10～20min，获取人工种子；

步骤5.3，将步骤5.2获取的人工种子进行无菌水的冲洗，再吸取人工种子表面水分。