CN109937878A - 一种翅果油树的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翅果油树的组织培养方法，剪取翅果油树外植体(枝条、芽或叶)，用流动的自来水冲洗，然后进行常规消毒处理；将消毒处理好的外植体用抗生素浸泡，然后接种于诱导愈伤组织培养基中培养，获得无菌苗；以获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于继代培养基中培养，待茎段生长成5‑10cm长的幼苗时，接种于诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。本发明将外植体灭菌为无菌外植体，使得无菌外植体诱导产生愈伤组织，愈伤组织进一步培养发芽，生根，相对于传统育苗方法，具有增殖率高和成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种翅果油树的组织培养方法。
背景技术
植物组织培养概念(广义)又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念(狭义)指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。组织培养技术已经普遍应用于花卉、经济作物、林木的生产、保存、纯化、脱病毒、快速繁殖及新品种选育等过程。
一直以来人们想了很多方法来保存植物，如保留果实，储存种子，储存块根、块茎、种球、鳞茎；用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等，这些方法在一定程度上收到了好的或比较好的效果，但仍存在许多问题。主要问题是付出的代价高，占的空间大，保存时间短，而且易受环境条件的限制。植物组织培养结合超低温保存技术，可以给植物种质保存带来一次大的飞跃。因为保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193℃的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。
翅果油树(拉丁学名Elaeagnus mollis Diels)，被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、胡颓子科、胡颓子属直立乔木或灌木。公元1899年，法国植物学家格德首次在山西发现了这种前所未见的神奇物种；1966年，中国农林科学院院长郑万均教授确定了该树的中文学名——翅果油树，国务院于1999年8月将翅果油树列为国家二级重点保护植物，目前仅分布在我国的陕西和山西两地，为我国特有品种。2018年被列为国家一类保护树种。
翅果油树有两种繁殖方式：其一是种子繁殖，但种子发芽率较低，未经任何处理的种子，发芽率为5.93％，发芽后能正常发育成籽苗的仅为1.69％。经过沙积处理的种子的发芽率为45.76％，但发芽后能正常发育成苗的也仅为11.02％。另外，翅果油树种子的寿命也短，保存一年后其发芽率几乎为零(上官铁梁，张峰，我国特有珍稀植物翅果油树濒危原因分析[J].生态学报，21(3)：502-505，2001)，且自然状态下的种子苗很少；其二是通过植株根蘖苗繁殖，但根蘖苗自生根能力差，繁殖系数低，而且通过这种营养繁殖方法长成的苗木病害严重。因此利用组织培养方法，尤其用种子苗为材料进行快速繁殖生产的翅果油树苗木具有无病毒、无菌，且繁殖系数高等优点。
但目前关于翅果油树组织培养的研究非常少，更没有形成产业规模，这与传统组织培养方法不适应与翅果油树有一定关系。
申请号为201610780875.7的中国专利公开了一种翅果油树定芽增殖与植株再生方法，该方法根据翅果油树腋芽处易萌发新芽的特点，采用成熟翅果油树种子无菌萌发获得实生苗，剪取带有腋芽或顶芽的幼嫩茎段为外植体，通过组织培养的方法促进腋芽萌发、伸长，获得具有一定木质化程度的健壮新枝，从而实现增殖的目的，然后经生根培养实现植株再生。但这种方法有以下缺点：生根率偏低，最大生根率为36.7％。为此，我们提出一种成本低廉，简便快速的组织培养方法以提高翅果油树的生根率。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是根据翅果油树试管苗的建立过程和特点，提供一种成本低廉，简便快速的适用于翅果油树组织培养方法来培育翅果油树苗。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种翅果油树的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)剪取翅果油树外植体，所述外植体用流动的自来水冲洗，然后进行常规消毒处理；
(2)将消毒处理好的外植体用抗生素浸泡；
(3)将步骤(2)中处理好的外植体接种于诱导愈伤组织培养基中培养15-20天，获得无菌苗；
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于继代培养基中培养15-20天；
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5-10cm长的幼苗时，接种于诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量。
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量。
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：所述外植体是枝条、芽或叶，用流动的自来水冲洗40分钟。
所述枝条的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
所述芽的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
所述叶的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
作为本发明再进一步的方案：将所述10％次氯酸钠溶液替换为0.1％HgCl2溶液。
作为本发明再进一步的方案：所述抗生素是60％青霉素G钾溶液或者60％青霉素钠溶液中的一种，浸泡30分钟。
作为本发明再进一步的方案：所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量。
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.15-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量。
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.02mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量。
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.04mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量。
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸5.0mg/L、α-萘乙酸0.01mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L、纯净水补足余量。
作为本发明再进一步的方案：所述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950lx～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养期间用紫外灯消毒。
作为本发明再进一步的方案：翅果油树组织的培养基的制备方法，包括如下步骤：
诱导愈伤组织培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体。
继代培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体。
诱导根培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与α-萘乙酸、吲哚丁酸溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体。
作为本发明再进一步的方案：诱导愈伤组织培养基、继代培养基和诱导根培养基配制过程中所述煮沸琼脂粉的锅中盛有0.7-0.8升纯净水，所述pH值用盐酸和氢氧化钠调整为5.7。
作为本发明再进一步的方案：所述诱导愈伤组织培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶。
所述继代培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶。
所述诱导根培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用常规消毒方法及抗生素对翅果油树外植体(枝条、芽或叶)进行消毒灭菌，即可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢，又能防止外植体中毒，保持外植体的生命力，获取优质的无菌外植体。
(2)本发明将外植体在含有激素的基本培养基中培养，通过诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养，利用激素的促生根和促生长作用，最终获得翅果油树苗，因此，本发明具有安全性高、可持续性好的优点。
(3)本发明在配制培养基时将Vc加入培养基中，据实验证明，加入Vc的培养基培养出的苗的褐化率明显降低，因此本发明能大大提高健康的翅果油的苗生成，减少损失，有效提高翅果油苗的快繁的速率。
(4)本发明的工艺操作简单，成本低廉，重复性好，且能大幅度提高翅果油树种子的发芽率和生根率，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
本发明翅果油树组织培养的方法：(1)取材；(2)消毒、接种及培养；(3)扩大繁殖；(4)根的诱导。
根据以上过程，筛选适应于各个阶段的培养基。本发明其外植体消毒方法、诱导愈伤组织培养基、继代培养基和诱导根培养基的配制及无菌培养的环境条件筛选过程如下：
(1)诱导愈伤组织培养基
翅果油树愈伤组织的培养一般以春季萌发的新的枝条、嫩叶、芽或由根部萌发的新枝条作为外植体来源，根据外植体在不同培养基的存活率、芽分化率等，筛选合适培养基。试验以MS、1/2MS、1/4MS、改良WPM、Read 5种培养基为基本培养基，以茎段为外植体进行预培养。每个处理接种20个材料，试验重复3次。每天观察、记录愈伤组织的生长状，连续观察1个月。以MS培养基为基本培养基，苄氨基嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)为生长素，每个处理接种60个材料，试验重复3次。基本培养基以MS为宜，适合诱导愈伤组织培养基的配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.02mg/L，愈伤组织诱导率为70％。
(2)继代培养基
继代培养以愈伤组织或者外植体长出的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段插入培养基内进行继代培养，根据外植体在不同培养基的存活率、芽诱导率等，筛选合适培养基。试验以MS、1/2MS、1/4MS、改良WPM、Read 5种培养基为基本培养基，以茎段为外植体进行预培养。每个处理接种20个材料，试验重复3次。每天观察、记录愈伤组织的生长状，连续观察3个月。以MS培养基为基本培养基，苄氨基嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)为生长素，每个处理接种60个材料，试验重复3次。基本培养基以MS为宜，适合继代培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.04mg/L，芽诱导率为60.4％。
(3)诱导根培养基
添加生长素的生根率明显高于未添加生长素的。1/2MS+吲哚丁酸(IBA)+α-萘乙酸(NAA)的生根生长效果较好，根较粗壮且基部无愈伤组织；1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA0.01mg/L、1/2MS+IBA 5.0mg/L+NAA0.01mg/L、1/2MS+IBA 7.5mg/L+NAA0.01mg/L的生根率差异显著，其中以1/2MS+IBA 5mg/L+NAA 0.01mg/L的生根率和平均根数最高，分别达到90.1％和3.61条；随着1/2MS+IBA+NAA中IBA浓度的增加，生根率越来越低。
(4)无菌培养的环境条件筛选过程：
A培养温度
一般来说组织培养的温度在18℃-28℃的范围内，所以用MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.02mg/L诱导愈伤组织培养基，MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.04mg/L继代培养基，1/2MS+IBA5mg/L+NAA 0.01mg/L诱导根培养基来进行无菌培养，分别以18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃在光照强度为950lx-1000lx，光照时间为12h/d，湿度40％±2％的培养室内培养。观察记录发芽率及生长情况，选出最佳培养温度。最后在22℃-24℃范围内生长的愈伤组织、继代组织以及生根树苗最健康。
B培养光照时长
诱导根培养和继代培养对光的需求比较高，所以对诱导根培养和继代培养做光照时长对比，用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.04mg/L继代培养基，1/2MS+IBA 5mg/L+NAA 0.01mg/L诱导根培养基来进行无菌培养，设定光照时间，将光照时间设置从6-24小时之间的梯度对照，在光照强度为950lx-1000lx，湿度40％±2％的培养室内培养对苗的发芽率和生长情况进行记录对比，得出最佳光照时间。经实验证明，如果光照时间不够，就会导致苗的黄化，不健康。但是光照时间过长对于能源是一种浪费，所以结合实验，设定合适光周期，在保证光照充足的同时也节约了能源。愈伤组织培养用MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L诱导愈伤组织培养基来培养验证，将光照时间和光强结合验证，验证合适光强下光照时长的愈伤组织合适生长情况。光强根据光照管开的根数来进行，光照时间从0-12小时区间验证。培养温度设置为22℃-24℃即可，湿度为40％±2％，记录生长情况，确定合适的光照时间和光强。最后光照时间为12h/d生长的愈伤组织、继代组织以及生根树苗最健康。
C培养湿度
用MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L诱导愈伤组织培养基，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.04mg/L继代培养基，1/2MS+IBA 5mg/L+NAA 0.01mg/L诱导根培养基来进行无菌培养，根据不同的湿度情况进行培养，湿度以一定范围为一个周期，10％-50％之间以10％为一个梯度进行实验，三种培养基的培养温度和光照时长根据A培养温度和B培养光照时长的结果确定。进行培养时记录生长情况，对比找出最佳的培养适度范围。最后培养湿度为40％±2％时生长的愈伤组织、继代组织以及生根树苗最健康。
本发明提供的MS配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3 1650mg/L、硝酸钾KNO3 1900mg/L、二水氯化钙CaCl2·2H2O 440mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 370mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4170mg/L；
微量元素：碘化钾KI 0.83mg/L、硼酸H3BO3 6.2mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025mg/L、六水氯化钴CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L、二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L；
有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg/L、盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
蔗糖30g/L；
琼脂7g/L。
本发明提供的1/2MS配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3 825mg/L、硝酸钾KNO3950mg/L、二水氯化钙CaCl2·2H2O 220mg/L、七水硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4 85mg/L；
微量元素：碘化钾KI 0.415mg/L、硼酸H3BO3 3.1mg/L、四水硫酸锰MnSO4·4H2O11.15mg/L、七水硫酸锌ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、五水硫酸铜CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、六水氯化钴CoCl2·6H2O 0.0125mg/L；
铁盐：七水硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L、二水乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L；
有机物质：肌醇100mg/L、烟酸VB5或VPP 0.5mg/L、盐酸吡哆醇VB6 0.5mg/L、盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
蔗糖30g/L；
琼脂7g/L。
翅果油树的组织培养的制备方法，包括如下步骤：
(1)剪取翅果油树外植体(枝条、芽或叶)，所述外植体用流动的自来水冲洗40min，然后进行常规消毒处理，其中：
枝条的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
芽的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
叶的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
常规消毒处理过程中，使用次氯酸钠比较方便和安全，但是在条件允许的情况下可以考虑用0.1％HgCl2代替10％次氯酸钠，会获得更好的消毒效果。
(2)将消毒处理好的外植体用抗生素浸泡30分钟，污染率能进一步降低，优选的抗生素为60％青霉素G钾溶液或者60％青霉素钠溶液中的一种。
(3)将步骤(2)中处理好的外植体接种于诱导愈伤组织培养基中培养15-20天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于继代培养基中培养15-20天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5-10cm长的幼苗时，接种于诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量；优选的配方为：每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量；进一步优选的配方为：每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.02mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量。
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量；优选的配方为：每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.15-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量；进一步优选的配方为：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.04mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖10-30g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量。
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量。优选的配方为：每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量；进一步优选的配方为：1/2MS、吲哚丁酸5.0mg/L、α-萘乙酸0.01mg/L、Vc0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L、纯净水补足余量。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
翅果油树组织的培养基的制备方法，包括如下步骤：
诱导愈伤组织培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌(高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟)；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，优选5.7，分装为20瓶后，冷却成固体。
继代培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌(高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟)；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，优选5.7，分装为20瓶后，冷却成固体。
诱导根培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有0.7-0.8升纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与α-萘乙酸、吲哚丁酸溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌(高温120℃，高压0.1MPa，灭菌15分钟)；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，优选5.7，分装为20瓶后，冷却成固体。
表1翅果油树组织培养的设计方案及生根率
注：+，表示进行了此项操作；-，表示没有进行此项操作。
由上述的生根率可以看出，进行正常处理的外植体的生根率远高于某一项未处理的数据，尤其是未灭菌、未消毒处理的外植体。
实施例2：
(1)剪取翅果油树枝条，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(2)将消毒处理好的枝条用60％青霉素G钾溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的枝条接种于配方为MS+0.4mg/L苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.10g/L Vc+15g/L蔗糖+4g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养15天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.4mg/L苄氨基嘌呤+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.10g/L Vc+15g/L蔗糖+4g/L琼脂粉的继代培养基中培养18天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成7cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+4.0mg/L吲哚丁酸+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.10g/L Vc+15g/L蔗糖+4g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例3：
(1)剪取翅果油树芽，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(2)将消毒处理好的芽用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的芽接种于配方为MS+0.6mg/L苄氨基嘌呤+0.04mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养15天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.6mg/L苄氨基嘌呤+0.04mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的继代培养基中培养17天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成8cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+6.0mg/L吲哚丁酸+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例4：
(1)剪取翅果油树叶，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗7遍。
(2)将消毒处理好的叶用60％青霉素G钾溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的叶接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.03mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+25g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的继代培养基中培养15天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+5.0mg/L吲哚丁酸+0.015mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例5：
(1)剪取翅果油树芽，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗7遍。
(2)将消毒处理好的芽用60％青霉素G钾溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的芽接种于配方为MS+0.4mg/L苄氨基嘌呤+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.10g/L Vc+15g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.4mg/L苄氨基嘌呤+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+15g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的继代培养基中培养15天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+4.0mg/L吲哚丁酸+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.10g/L Vc+15g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例6：
(1)剪取翅果油树叶，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗4次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(2)将消毒处理好的叶用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的叶接种于配方为MS+0.6mg/L苄氨基嘌呤+0.04mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+25g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养15天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.6mg/L苄氨基嘌呤+0.04mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的继代培养基中培养17天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成7cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+6.0mg/L吲哚丁酸+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.20g/L Vc+25g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例7：
(1)剪取翅果油树枝条，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗7遍。
(2)将消毒处理好的枝条用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的枝条接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.03mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+7g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养17天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.03mg/Lα-萘乙酸+0.18g/L Vc+25g/L蔗糖+7g/L琼脂粉的继代培养基中培养20天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成10cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+5.0mg/L吲哚丁酸+0.015mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+7g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
实施例8：
(1)剪取翅果油树枝条，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗4次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6遍。
(2)将消毒处理好的枝条用60％青霉素G钾溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的枝条接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.02mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天，获得无菌苗。
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于配方为MS+0.5mg/L苄氨基嘌呤+0.04mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的继代培养基中培养15天。
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5cm长的幼苗时，接种于配方为1/2MS+5.0mg/L吲哚丁酸+0.01mg/Lα-萘乙酸+0.15g/L Vc+20g/L蔗糖+7g/L琼脂粉的诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗。
上述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
对比例：
(1)剪取翅果油树芽，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(2)将消毒处理好的芽用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(3)将步骤(2)中处理好的芽接种于配方为MS+15g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天。没有愈伤组织生成。
(4)剪取翅果油树枝条，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(5)将消毒处理好的枝条用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(6)将步骤(5)中处理好的枝条接种于配方为MS+20g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天，没有愈伤组织生成。
(7)剪取翅果油树叶，用流动的自来水冲洗40min，用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗5次，去除多余水分，浸泡在0.1％HgCl2溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗8遍。
(8)将消毒处理好的叶用60％青霉素钠溶液浸泡30分钟。
(9)将步骤(8)中处理好的叶接种于配方为MS+25g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的诱导愈伤组织培养基中培养20天，没有获得愈伤组织。
上述诱导愈伤组织培养培养条件为温度22℃～24℃、光强950～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养间定期用紫外灯消毒，且工作人员进出培养间要进行严格的消毒。
利用上述实施例2-8和对比例的方法，对翅果油树外植体进行培养，从下表的结果可以看出，实施例的技术指标远超过对比例。
表2实施例2-8设计方案与对比例效果的比较
| 实施例 | 存活率(％) | 愈伤组织诱导率(％) | 发芽率(％) | 生根率(％) |
| 2 | 64 | 65 | 60 | 78 |
| 3 | 58 | 68 | 61 | 80 |
| 4 | 72 | 65 | 58 | 82 |
| 5 | 64 | 66 | 60 | 80 |
| 6 | 68 | 63 | 61 | 84 |
| 7 | 60 | 67 | 58 | 83 |
| 8 | 78 | 70 | 64 | 90 |
| 对比例 | 58 | 0 | 0 | 0 |
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种翅果油树的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)剪取翅果油树外植体，所述外植体用流动的自来水冲洗，然后进行常规消毒处理；
(2)将消毒处理好的外植体用抗生素浸泡；
(3)将步骤(2)中处理好的外植体接种于诱导愈伤组织培养基中培养15-20天，获得无菌苗；
(4)以步骤(3)获得的无菌苗为材料，将萌发的嫩枝条剪成小段接种于继代培养基中培养15-20天；
(5)待步骤(4)中的茎段生长成5-10cm长的幼苗时，接种于诱导根培养基中继续培养，进行生根诱导，最终获得翅果油树苗；
所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量；
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.01-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量；
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉4-8g/L、纯净水补足余量。
2.根据权利要求1所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述外植体是枝条、芽或叶，用流动的自来水冲洗40分钟；
所述枝条的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡8分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中6分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍；
所述芽的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中3分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍；
所述叶的常规消毒处理方法：用70％酒精浸泡4分钟，浸泡过程中不断摇晃，取出，用无菌水冲洗3-5次，去除多余水分，浸泡在10％次氯酸钠溶液中2分钟，振动，取出，在超净工作台用无菌水冲洗6-8遍。
3.根据权利要求2所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，将所述10％次氯酸钠溶液替换为0.1％HgCl2溶液。
4.根据权利要求1所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述抗生素是60％青霉素G钾溶液或者60％青霉素钠溶液中的一种，浸泡30分钟。
5.根据权利要求1所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量；
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、α-萘乙酸0.02-0.04mg/L、Vc 0.15-0.20g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量；
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸4.0-6.0mg/L、α-萘乙酸0.01-0.02mg/L、Vc 0.10-0.20g/L、蔗糖15-25g/L、琼脂粉6-8g/L、纯净水补足余量。
6.根据权利要求1所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述每升诱导愈伤组织培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.02mg/L、Vc0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量；
所述每升继代培养基的组分及各组分的含量如下：MS、苄氨基嘌呤0.5mg/L、α-萘乙酸0.04mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖15-30g/L、琼脂粉8g/L、纯净水补足余量；
所述每升诱导根培养基的组分及各组分的含量如下：1/2MS、吲哚丁酸5.0mg/L、α-萘乙酸0.01mg/L、Vc 0.15g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L、纯净水补足余量。
7.根据权利要求1所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织培养、继代培养和诱导根培养的培养条件为温度22℃～24℃、光强950lx～1000lx、光照时间12h/d、湿度40％±2％，培养期间用紫外灯消毒。
8.基于权利要求1所述的翅果油树组织的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
诱导愈伤组织培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体；
继代培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍MS母液与α-萘乙酸、苄氨基嘌呤溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体；
诱导根培养基：按原料配比称量琼脂粉加入装有纯净水的锅中煮沸；取0.1升10倍1/2MS母液与α-萘乙酸、吲哚丁酸溶解后加入锅中；称量蔗糖加入锅中并让其溶解；纯净水定容到1.0升；进行高温高压灭菌；冷却至80℃以下后加入经过无菌处理的Vc溶液，用经过灭菌处理的盐酸和氢氧化钠调整pH值为5.6-5.9，分装后冷却成固体。
9.根据权利要求8所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，诱导愈伤组织培养基、继代培养基和诱导根培养基配制过程中所述煮沸琼脂粉的锅中盛有0.7-0.8升纯净水，所述pH值用盐酸和氢氧化钠调整为5.7。
10.根据权利要求8所述的翅果油树的组织培养方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶；
所述继代培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.10MPa-0.14MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶；
所述诱导根培养基制备过程中高温高压灭菌条件为高温120℃，高压0.1MPa，灭菌15分钟；制备完成后分装成20瓶。
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| CN1748483A (zh) * | 2005-10-25 | 2006-03-22 | 山西师范大学 | 一种翅果油树试管苗的繁殖方法 |
-
2019
- 2019-03-29 CN CN201910250635.XA patent/CN109937878A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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