CN108157178A - 一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法 - Google Patents

一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于樟叶越桔栽培技术领域，公开了一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，以樟叶越桔增殖苗为基础，从生根激素种类及用量的比较、生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析；筛选出的基本生根培养基为IBA2.0mg.L‑1+1/4MS+活性炭0.1g.L‑1+白砂糖15g.L‑1+琼脂5g.L‑1。本发明是以樟叶越桔增殖苗为基础，从生根激素种类及用量的比较、基本生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行了进一步的分析，提高其增殖苗生根率及炼苗成活率，为樟叶越桔的工厂化培养提供了一定的科学依据和技术支持。

Description

一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法
技术领域
本发明属于樟叶越桔栽培技术领域，尤其涉及一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法。
背景技术
植物组织培养技术是在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生成细胞或完整植株的技术。其主要作用就是可以实现材料呈几何指数的快速增殖。一般可划分为无菌体系的建立、增殖培养、生根培养、炼苗移栽四个阶段，只有当各个阶段的技术问题得以解决，然后有机地结合才能实现组培苗的快速繁殖。目前樟叶越桔的植物组织培养研究主要停留在增殖培养、生根培养阶段，而进一步的炼苗移栽则未见报道。
樟叶越桔(Vaccinium dunalianum Wight)，为杜鹃花科越桔属常绿灌木。樟叶越桔幼嫩叶芽，因形似雀嘴呈锥状，在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，据记载自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今，具有祛风除湿、舒筋活络等功效[1]。其果实营养丰富，具有较高的药用和保健价值[2]，樟叶越桔是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分可抑制黑色素生成，活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2。由于熊果苷作为次生代谢产物通常以微量形式存在于植物体中，且天然植物来源困难，因此,樟叶越桔有望作为熊果苷天然替代品资源加以应用，具有重要的开发价值。近年来，由于樟叶越桔目前仍处于野生阶段，生长缓慢，而市场对于雀嘴茶及咖啡酰熊果苷的需求量不断，导致野生资源被过度采挖，数量急剧下降。
由此，迫切需要利用现代生物学技术来快速增加樟叶越桔数量，一方面可为植物种质资源提供保护，另一方面也可满足市场需求。
目前为止，国内外对越桔属多种植物的组织培养和快繁技术及育苗炼苗技术都已有报道，且蓝莓等的组织培养技术相对较为成熟，使用快繁技术可使蓝莓茎段成活率高达到85.7％，愈伤组织诱导率可达88％，和加卫、徐中志等人以云南越橘继代培养的芽苗转接于1/2WPM+NAA0.05mg.L-1的生根培养基中，5周后基部可长出2～4条1～1.5cm长的不定根，生根率78％。瓶盖打开，炼苗3d，然后从培养基中取出，洗去根部培养基，移入蛭石和腐殖土(1：2)混合的基质中，保湿遮阴，成活率可达90％以上。孙阳等人对Siem、Bluecrop和Toro3个蓝莓品种叶片离体再生研究，以改良WPM培养基，结果表明，ZT浓度在0.15mg.L-1时对越橘叶片离体再生效果最佳，IBA对越橘叶片离体再生能力影响较小；不同品种之间的叶片生根速率差异十分显着，在相同生长素浓度下，3个品种的生根率由低到高依次是Bluecrop<Sierra<Toro。
而相对于樟叶越桔的组织培养，目前只有罗等人在前期报道了樟叶越桔的组织培养与快速繁殖技术，即以野生樟叶越桔幼嫩带芽茎段为外植体，通过对初代启动培养、增殖及生根培养方案的筛选，建立了樟叶越桔的组织培养和快速繁殖体系，但其未从试管苗的炼苗技术进行研究。目前樟叶越桔的组织培养很好地解决了组培苗的增殖问题，目前关于生根率的报道仅有2例，其中1篇文章报道生根率保持在86.67％(罗旭璐,唐军荣,李娜,等.樟叶越桔的组织培养与快速繁殖.植物生理学报,2014，50(11)：1717-1720)，而发明专利的报道生根率在94％(赵平,唐军荣,罗旭璐,等.一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法:CN 103999773A[P].2014.)，但是关于炼苗移栽则未见相关报道，虽然樟叶越桔的生根率保持在90％左右，但是由于生根苗质量低，如在切口处形成较多的愈伤组织、生根苗的根系弱等问题，使得炼苗不易成活，再加上樟叶越桔移栽后生长缓慢，以及炼苗过程中的基质选择不当，极易造成根系腐烂，使移栽炼苗失败。而对于樟叶越桔的组培快繁，必需是各个环节打通后，在最后的炼苗移栽环节得以解决，才能真正实现其种苗的工厂化生产。
综上所述，现有技术存在的问题是：生根苗质量差，且生根率有待提高，最为核心的一个环节就是未能解决炼苗移栽成活的问题。
现有樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，没有从试管苗的炼苗技术进行分析，没有从生根激素种类及用量的比较、基本生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析，提高其增殖苗生根率及炼苗成活率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法。
本发明是这样实现的，一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，以樟叶越桔增殖苗为基础，首先对增殖苗进行壮苗，然后再从生根激素种类及用量的比较、生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析；筛选出的基本生根培养基为IBA 2.0mg.L-1+1/4MS+活性炭0.1g.L-1+白砂糖15g.L-1。
进一步，将樟叶越桔增殖苗在1/2MS+IAA1.5mg.L-1+活性炭0.1g.L-1+白砂糖20g.L-1+琼脂5g.L-1进行壮苗，然后进行生根配方筛选，筛选不同激素种类及浓度对樟叶越桔组培苗生根的方法包括：
采用单因素方法，设置IBA 1.5mg.L-1、2mg.L-1、2.5mg.L-1、3mg.L-1；设置NAA0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；设置IAA0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；对樟叶越桔组培苗生根处理；每一处理接种7瓶培养基，每瓶培养基接入10株苗，每个处理设置3个重复，培养温度为25℃±2℃，50d后统计生根率；所有处理步骤加入琼脂5g.L-1，活性炭0.1g.L-1，白砂糖15g.L-1，pH值5.8～6.0。
进一步，不同培养基类型对樟叶越桔组培苗生根的筛选方法中，基本生根培养基包括MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基、1/8MS培养基及WPM培养基，对这五组类型的培养基进行对比筛选，从生根率、生根苗的质量进行综合比较，1/4MS的生根率较其他4种基本培养基生根率要高，且生根苗的根系好，从而选出最优生根基本培养基1/4MS。
进一步，生根培养基的筛选中，糖分含量的筛选方法包括：
糖分含量设置5g.L-1、15g.L-1、25g.L-1、35g.L-1四个处理，每个处理接了70株越桔，每个处理均设置3个重复，50d后统计数据，统计指标为生根率；筛选出最优的生根培养基的糖分含量15g.L-1。
进一步，炼苗基质的筛选方法包括：
移栽炼苗基质按质量计设置全腐殖土、红壤:全腐殖土＝1:1、红壤:全腐殖土＝2:1、红壤:全腐殖土＝4:1，共4个处理，每个处理都全面喷洒800倍的多菌灵，浇透水后第二天进行移栽炼苗。每个处理移栽50株樟叶越桔苗，3个月后统计其成活率。
本发明在炼苗移栽后，对组培苗保湿时，采用的水经过pH值调整，使pH值保持在5.8-6.0，从而使移栽后的土壤环境呈酸性，为其创造有利的土壤生长环境。
本发明的优点及积极效果为：
本发明通过改良的生根培养基，使生根率提高到97.22％～100％，较前人报道的94％的生根率提高了3.22％，同时生根苗的质量得以提高，主要表现为生根苗的基部无愈伤组织的产生，使得根系不易折断，同时更有利于移栽后的养分和水分的有效运输。优质的樟叶越桔生根苗，为移栽炼苗提供了强有力的保障，使移栽成活率达到了83.7％，首次解决了樟叶越桔移栽炼苗成活率低的问题。
本发明是以樟叶越桔增殖苗为基础，从生根激素种类及用量的比较、基本生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行了进一步的分析，提高其增殖苗生根率及炼苗成活率，为樟叶越桔的工厂化培养提供了一定的科学依据和技术支持。
本发明比较了基本培养基类型、不同激素与含量及糖分含量三方面对樟叶越橘茎段生根的影响，结果表明：樟叶越橘理想的生根培养基配方为IBA2.0mg.L-1+1/4MS+活性炭0.1g.L-1+白砂糖15g.L-1，越橘属的很多植物都是没有侧根，根系较弱。大量报道指出，越橘在试管中生根效果较差，生根速度慢，生根率低，并且试管苗生长势弱，根较细。在添加IBA的1/2MS培养基中，培养至3周生根率还不到10％，即便延长培养5周生根率也不明显。以往的越橘微体繁殖分析，一般均在试管外生根或在弥雾条件下扦插试管幼枝生根。因此，选择合适的培养基、激素和激素配比及糖分含量是组织培养的关键步骤，植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，培养基的种类、成分等直接影响培养材料的生长发育。
附图说明
图1是本发明实施例提供的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法流程图。
图2是本发明实施例提供的樟叶越桔生根苗(底部)图。
图3是本发明实施例提供的樟叶越桔生根苗(侧面)图。
图4是本发明实施例提供的移栽炼苗成活后的樟叶越桔图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，没有从试管苗的炼苗技术进行分析，没有从生根激素种类及用量的比较、基本生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析，提高其增殖苗生根率及炼苗成活率。
本发明在生根培养基中添加的活性炭，抑制了愈伤组织的产生，从而提高了樟叶越桔生根苗的质量。活性炭为根的生长营造了近似自然生长条件下的黑暗环境，培养过程中可以吸附植物细胞分泌的毒性物质以及培养基中有毒副作用的物质。
在移栽炼苗过程中，不同基质的保湿性、透气性和抗菌性等能力都不相同，因此在选择基质时，要根据植物本身的特点进行选择，而对樟叶越桔来说，采用全腐殖土，组培苗移栽炼苗效果最好，炼苗成活率达83.7％。这因为全腐殖土里面不仅含有比较多的营养物质，且土质疏松比较透气，而樟叶越桔与蓝莓同为杜鹃花科越桔属植物，比较适合生长在疏松多孔、富含有机质、酸性的人工基质中。
而本发明后期管理也同样很重要，刚从培养基中脱离的幼苗，适应能力较弱。首先在初期保湿的水pH值保持在5.8-6.0，从而使移栽后的土壤环境呈酸性；另外采用喷雾形式保持水分在80％左右，以及空气温度处于18～25℃，这些都为移栽成活创造了有利条件。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例提供的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，所述樟叶越桔生根及移栽炼苗方法以樟叶越桔增殖苗为基础，从生根激素种类及用量的比较、生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析；筛选出的基本生根培养基为IBA2.0mg.L-1+1/4MS+活性炭0.1g.L-1+白砂糖15g.L-1+琼脂5g.L-1。
如图1所示，本发明实施例提供的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，包括：
S101：生根前首先将增殖苗转接在1/2MS+IAA1.5mg.L-1+活性炭0.1g.L-1+白砂糖20g.L-1+琼脂5g.L-1的培养基中进行壮苗，获得樟叶越桔的壮苗，并去除分裂素的影响。
S102：筛选不同激素种类及浓度对樟叶越桔组培苗生根的方法包括：采用单因素方法，设置IBA 1.5mg.L-1、2mg.L-1、2.5mg.L-1、3mg.L-1；设置NAA 0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；设置IAA0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；对樟叶越桔组培苗生根处理；每一处理接种7瓶培养基，每瓶培养基接入10株苗，每个处理设置3个重复，培养温度为25℃±2℃，50d后统计生根率；所有处理步骤加入琼脂5g.L-1，活性炭0.1g.L-1，白砂糖15g.L-1，pH值5.8～6.0。
S103：不同培养基类型对樟叶越桔组培苗生根的筛选方法中，基本生根培养基包括MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基、1/8MS培养基及WPM培养基，对这五组类型的培养基进行对比筛选，选出最优生根基本培养基1/4MS。
S104：生根培养基的筛选中，糖分含量的筛选方法包括：糖分含量设置5g.L-1、15g.L-1、25g.L-1、35g.L-1四个处理，每个处理接了70株越桔，每个处理均设置3个重复，50d后统计数据，统计指标为生根率；筛选出最优的生根培养基的糖分含量15g.L-1。
S105：炼苗基质的筛选方法包括：在生根培养基上培养60d后试管苗生出健壮根，放至移栽环境中7d，炼苗前6～7d将培养基密闭在自然光照射下进行木质化处理；将苗从培养瓶拿出，在清水中洗净残留在苗上的培养基，进行移栽炼苗；移栽炼苗基质设置全腐殖土、红壤:全腐殖土＝1:1、红壤:全腐殖土＝2:1、红壤:全腐殖土＝4:1进行处理，每个处理均全面喷洒多菌灵，浇透水后第二天进行移栽炼苗；后期管理时空气温度小于30℃，每个处理移栽50株樟叶越桔苗，3个月后统计成活率。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
1、材料与方法
1.1材料：樟叶越桔组培瓶苗由西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室培育，生根前首先将增殖苗转接在1/2MS+IAA1.5mg.L-1+活性炭0.1g.L-1+白砂糖20g.L-1+琼脂5g.L-1的培养基中进行壮苗，壮苗过程中组培苗即增壮与增殖并存，同时该过程会有效释放前期增殖继代时积累的玉米素。
1.2方法
1.2.1樟叶越桔组培苗生根配方试验
(1)不同激素种类及浓度对樟叶越桔组培苗生根的试验。
采用单因素试验方案，设置了IAA(0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1)，NAA(0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1)，IBA(1.5mg.L-1、2mg.L-1、2.5mg.L-1、3mg.L-1)，并以未添加激素的处理为对照，基本培养基为1/2MS培养基，共13个处理。每一处理接种7瓶培养基，每瓶培养基接入10株苗，每个处理设置3个重复，培养温度为(25±2)℃，50d后统计生根率。所有试验加入琼脂5g.L-1，活性炭0.1g.L-1，白砂糖15g.L-1，pH值5.8～6.0。
(2)不同培养基类型对樟叶越桔组培苗生根的筛选试验
大量元素是植物生长发育的必需元素，其含量直接影响着植物的生长过程，对其进行调整和筛选培养基具有重要的意义。故将基本生根培养基设置为MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基、1/8MS培养基及WPM培养基，对这五组类型的培养基进行对比筛选，选出最优生根基本培养基。
(3)糖分含量的筛选试验
糖分含量设置5g.L-1、15g.L-1、25g.L-1、35g.L-1四个处理，每个处理接了70株越桔材料，每个处理同样设置3个重复，50d后统计数据，统计指标为生根率。进而筛选出最优的生根培养基的糖分含量。
1.2.2炼苗基质的筛选试验
移栽炼苗基质设置全腐殖土、红壤:全腐殖土(1:1)、红壤:全腐殖土(2:1)、红壤:全腐殖土(4:1)4个处理，每个处理都全面喷洒多菌灵，浇透水后第二天进行移栽炼苗。每个处理移栽50株樟叶越桔苗，3个月后统计其成活率。
下面结合结果与分析对本发明作进一步描述。
2结果与分析
2.1不同激素及用量对樟叶越桔的生根影响
通过对IAA、NAA、IBA三种激素对樟叶越桔的生根效果，结果表晨IAA、NAA、IBA三种激素对樟叶越桔的瓶内生根均有促进作用，且不同处理间的生根率存在显著差异。生根率最高的为IBA2.0mg.L-1的处理，生根率为81.67％，此处，该处理与IAA 0.5mg.L-1、NAA1.5mg.L-1、NAA 2.0mg.L-1的生根率之间差异不显著，但是结合生根苗的根系数量，以及基部的愈伤组织情况综合分析，以IBA 2.0mg.L-1的处理樟叶越桔的生根效果最佳。
表1不同激素及其含量对樟叶越桔生根影响
其中，小写字母表示不同处理间差异性显著p<0.05，下同。
2.2不同培养基对樟叶越桔的生根影响
不同培养基处理的樟叶越桔生根率及其生根情况列于表2，从表2可看出，这5组培养基间的显著性差异较为明显。其中MS培养基中不生根，但随着大量元素的减少，生根率开始增加，在1/4MS培养基的生根率达到了最高，而在1/8MS培养基却出现了下降，可能过少的大量元素，无法满足组培苗生根时的营养需求。因此，从生根率的结果可以看出，1/4MS基本培养基最适合樟叶越桔的生根培养。
表2不同培养基对樟叶越桔生根影响
2.3不同糖分含量对樟叶越桔的生根影响
在1/4MS基本培养基上，通过比较白砂糖单因素实验，以观察糖分的变化对樟叶越桔生根的影响。从表3实验结果可以得出不同糖分含量对越桔生根率会存在差异。糖分的过多会抑制生根，过少则会影响生根苗的质量。因此，以15g.L-1是樟叶越桔生根的最佳用量。
表3不同糖分含量对樟叶越桔生根影响
炼苗3个月后，对樟叶越桔苗的存活率统计，从表4可看出，移栽入基质的越桔苗的成活情况随着红土的比值加大则其成活越低，生长越差。最适的基质为全腐殖土，成活率最高为83.7％。在全腐殖土生长的苗叶片非常舒展，生长状况良好，而在不同配比的腐殖土与红土的基质上，苗的长势较弱，生长缓慢。此后，基于全腐殖土的炼苗基质，其成活率仍然保持在83.7％以上。
表4不同基质对樟叶越桔苗成活影响
图2是本发明实施例提供的樟叶越桔生根苗(底部)图。
图3是本发明实施例提供的樟叶越桔生根苗(侧面)图。
图4是本发明实施例提供的移栽炼苗成活后的樟叶越桔图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，其特征在于，所述樟叶越桔生根及移栽炼苗方法为：
首先对增殖苗进行壮苗；
然后再从生根激素种类及用量的比较、生根培养基的筛选、炼苗基质的筛选三方面进行分析；
筛选出的基本生根培养基为IBA 2.0mg.L-1+1/4MS+活性炭0.1g.L-1+白砂糖15g.L-1。
2.如权利要求1所述的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，其特征在于，将樟叶越桔增殖苗在1/2MS+IAA1.5mg.L-1+活性炭0.1g.L-1+白砂糖20g.L-1+琼脂5g.L-1进行壮苗，然后进行生根配方筛选，筛选不同激素种类及浓度对樟叶越桔组培苗生根的方法包括：
采用单因素方法，设置IBA 1.5mg.L-1、2mg.L-1、2.5mg.L-1、3mg.L-1；设置NAA 0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；设置IAA0.5mg.L-1、1.0mg.L-1、1.5mg.L-1、2.0mg.L-1；对樟叶越桔组培苗生根处理；每一处理接种7瓶培养基，每瓶培养基接入10株苗，每个处理设置3个重复，培养温度为25℃±2℃，50d后统计生根率；所有处理步骤加入琼脂5g.L-1，活性炭0.1g.L-1，白砂糖15g.L-1，pH值5.8～6.0。
3.如权利要求1所述的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，其特征在于，
不同培养基类型对樟叶越桔组培苗生根的筛选方法中，基本生根培养基包括MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基、1/8MS培养基及WPM培养基，对这五组类型的培养基进行对比筛选，选出最优生根基本培养基1/4MS。
4.如权利要求1所述的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，其特征在于，生根培养基的筛选中，糖分含量的筛选方法包括：
糖分含量设置5g.L-1、15g.L-1、25g.L-1、35g.L-1四个处理，每个处理接了70株越桔，每个处理均设置3个重复，50d后统计数据，统计指标为生根率；筛选出最优的生根培养基的糖分含量15g.L-1。
5.如权利要求1所述的樟叶越桔生根及移栽炼苗方法，其特征在于，炼苗基质的筛选方法包括：
移栽炼苗基质按质量计设置全腐殖土、红壤:全腐殖土＝1:1、红壤:全腐殖土＝2:1、红壤:全腐殖土＝4:1，共4个处理，每个处理都全面喷洒800倍的多菌灵，浇透水后第二天进行移栽炼苗。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109984043A (zh) * 2019-05-15 2019-07-09 西南林业大学 一种以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法
CN109997698A (zh) * 2019-05-15 2019-07-12 西南林业大学 一种以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法
CN110622862A (zh) * 2019-10-16 2019-12-31 西南林业大学 一种樟叶越桔悬浮细胞培养体系的建立方法

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