CN103299902B - 一种用于组织培养楝树幼苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于组织培养楝树幼苗的方法。本发明技术方案是采集外殖体，外殖体消毒，初代培养，诱导产生愈伤组织，利用愈伤组织诱导不定芽，增殖培养，生根培养，最后出瓶移栽。本发明解决了过去存在的组织培养方法无针对楝树的培养基，及成活率低，时间长，不具备实用性，无法保证树种遗传特性的基础上进行快速繁殖，从而提供大量廉价的楝树树苗等缺陷。本发明供了一种快速的、产业化培育楝树幼苗的新方法，用材少，不受气候、季节、基质等自然条件的影响，可培育出脱毒苗，抗逆性强、质优、生长旺盛，并且可以减少直至杜绝病毒病的传播。

Description

一种用于组织培养楝树幼苗的方法

技术领域

本发明涉及一种用于楝树组织培养的方法，特别涉及一种用于组织培养楝树幼苗的方法。 

背景技术

楝树的用途很多，印楝素是从印度楝中提取出来的一种化学物质，是生产生物农药的有效成分。楝树的果实中富含不饱和脂肪酸，占干果总重量的20％，其榨出来的油脂可以作为生物柴油使用，亦可作为生产化工用品的原料。果实榨过油之后的渣滓可以用来作为化肥使用。楝树的叶子可以泡茶饮用，在东南亚国家以及日本，都有饮用楝树叶茶的习惯。楝树的木质结实，可以作为家具的材料，具有极高的经济价值。除此之外，楝树具有极高的环境价值，可以净化空气，吸收有害气体。楝树可以释放挥发性化学成分，驱赶蚊虫和杀死细菌，是城市绿化的重要树种。 

楝树的育苗方法主要有播种、插根、插芽等，楝树的种植通常以播种育苗为主。播种育苗有以下缺点： 

种子繁殖变异性大，不能有效地保持母本优良性状，受季节限制，一年只能育苗一次，播种前的种子处理复杂，种子的前期处理复杂，中间的影响环节多，每个环节对种子的发芽率都产生或多或少的影响，发芽所需的时间长，间苗难，成活率低，田间工作量大，育苗空间需要大，种子发芽后直接在外界生长，易被细菌、霉菌感染，增加染病机率，引发病虫害，降低幼苗的成活率。因此播种育苗不具有产业化的优势。 

组织培养育苗的优点： 

变异可能小，有利于保持母本的优良性状，用材少，不受气候、季节、基质等自然条件的影响；解决常规育苗困难的问题，繁殖周期短，繁殖系数大，可大批量生产；培育脱毒苗，使植物减少微生物侵害。因此大规模种植楝树的最佳方式是进行组织培养。 

在本发明之前，楝树育苗的方式主要是育种育苗。育种育苗方法受季节、气候与场地的限制，产量低、无法产业化生产。目前所有的组织培养方法还没有针对楝树的培养基，因此无法培养出楝树本植物幼苗；已有的能够实现的培养木本 植物，例如茶树的组织培养，以及树莓苗木组织培养，红豆杉种苗培养方法等。但由于成活率的原因，这些组织培养的方法都不能用于楝树的组织培养。例如：试验表明，用于茶树组织培养方法在诱导在初代培养楝树外植体的时候会产生大量的死苗，其死亡比例高达87％；而红豆杉种苗虽然在初代培养上效果略微好于茶树组织培养方法，但其在诱导愈伤组织过程中成功率低，时间长，不具备实用性。 

因此，如何解决在保证树种遗传特性的基础上进行快速繁殖，从而提供大量廉价的楝树树苗，成为楝树产业的首要而迫切的问题。 

发明内容

本发明的目的就是克服上述缺陷，提供一种用于组织培养楝树幼苗的方法。 

本发明的技术方案是： 

一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤如下： 

(1)采集外殖体：剪下枝梢半木质化部分； 

(2)外殖体消毒：在无菌的状态下，用消毒试剂进行消毒；所述消毒试剂成分为0.1％～0.2％高锰酸钾m/v，10％～20％次氯酸钠溶液v/v，1mL/100mL吐温水，无菌水，1mL/50mL山农一号I型水，50mg/L链霉素、50mg/L头孢霉素、50mg/L制霉菌素，二甲基亚砜； 

(3)初代培养：将外殖体转接到初代培养基中培养2-3个月；所述培养基为MS基本培养基添加蔗糖20～60g，椰子汁20～100ml，活性炭0.5～2g，细胞分裂素噻重氮苯基脲0.1～0.5mg，山农1号II型1～4mL，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH至5.8～6.2； 

(4)诱导产生愈伤组织：将外殖体转接到新的愈伤组织的培养基中；所述培养基为MS培养基中添加蔗糖20～100g，椰子汁20～100ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5～2mg，萘乙酸0.005～0.02mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调整pH至5.8～6.2； 

(5)利用愈伤组织诱导不定芽：将愈伤组织放入培养基中诱导不定芽；所述培养基是在正常的MS培养基中加入蔗糖(20～100)g，椰子汁20～100ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.2～1mg，萘乙酸0.05～0.2mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH到5.8～6.2； 

(6)增殖培养：转接一次到增殖培养基中；所述增殖培养基为MS培养基中加入蔗糖20～100g，椰子汁50～200ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.2～1mg，萘乙酸0.05～0.2mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH至5.8～6.2； 

(7)生根培养：将枝干切成小段，接种到生根培养基中；所述生根培养基为MS培养基中加入蔗糖40～80g，椰子汁20～100ml，吲哚丁酸0.5～2mg，卡拉胶5～10g，水至1升，调整pH至5.8～6.2：置于20～28℃、1000～3000lux光照条件下培养； 

(8)出瓶移栽：移栽组培苗可用椰糠和土的混合物作为基质，其比例在0～2∶1之间，在植株的根长至3～5cm长时，即可出瓶移栽，移栽前用1‰的多菌灵浸泡，栽入育苗杯中，浇透水后用地膜覆盖，培养。 

本发明的优点和效果在于提供了一种快速的、产业化培育楝树幼苗的新方法。本发明组培育苗是在室内使用培养基进行培养的。因此用材少，不受气候、季节、基质等自然条件的影响。组培室可人工控制温度、湿度、光照时间、光照强度等条件，可让植物一年四季均处于最佳的生长环境下，同时培养基提供了充足的营养，使得植物可不受外界各种条件的影响，一直处理旺盛生长的状态，生长快速。本发明可培育出脱毒苗。脱毒苗抗逆性强、质优、生长旺盛，并且可以减少直至杜绝病毒病的传播。 

使用本发明培养出的楝树幼苗可保持、延续母本的优良性状。本发明的繁殖周期短，组培苗25天就可转接继代。繁殖系数大，半年内可由一株苗木繁殖一百万株新个体。从而实现工厂化育苗，可在两三年内迅速推广。 

本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。 

附图说明

图1——本发明流程示意图。 

具体实施方式

本发明的技术思路是： 

利用楝树的无性繁殖的特性，通过特别配方的培养基，提高楝树组织培养成功率，并且完全保持母本的遗传特性，保证提供的树种的均一、高质量、低成本。 

为了实现本发明的目的，本发明通过外殖体采集、外殖体消毒、初代培养、诱导产生愈伤组织、利用愈伤组织诱导不定芽、增殖培养、生根培养、出瓶移栽等八个步骤来实施。 

下面结合一些具体实施方式对本发明进行进一步的阐述。但不仅限于将次具体实施方式作为上述发明的范围。 

1.外殖体采集 

选择晴朗的天气，在上午叶面无露水时进行采集。挑选健壮、无病虫害的植株，用较锋利的剪刀剪下枝梢半木质化部分，切除顶梢幼嫩段，只保留半木质化段。 

在腋芽上下2～4cm处切下腋芽，并只保留3cm左右的叶柄，切口要求平滑不裂，以利于随后的消毒处理。 

2.外殖体消毒 

将外植体放入5％洗洁精溶液清洗5min，期间不断的摇动或翻动；倒去洗洁精溶液，用自来水冲洗干净。重复清洗3遍之后，放置在已开启的超净工作台一旁，沥干水备用。 

加热100mL无菌水，称量0.1g高锰酸钾，在超净工作台上将高锰酸钾粉末溶于热无菌水，制成0.1％高锰酸钾溶液(m/v)。将外植体放入高锰酸钾溶液，振荡、浸泡30min。然后用无菌水冲洗2～3遍。 

在超净工作台上，倒5mL以上的次氯酸钠原溶液到其中一个空瓶中，用注射器吸取，然后用过滤针头过滤进另一个空瓶中。吸取过滤后的次氯酸钠5mL，加入吐温+水混合液中，制成10％次氯酸钠溶液(v/v)。外植体在次氯酸钠溶液中振荡、浸泡1h。再用无菌水冲洗2～3次。 

分别称取头孢霉素、链霉素、制霉菌素各100mg，再分别溶解于1mL无菌水，1mL无菌水和1mL二甲基亚砜。分别用注射器吸取以上三种抗生素，再分别过滤进另一个无菌离心管中。分别吸取1mL山农一号I型、25μL头孢霉素、25μL链霉素、25μL制霉菌素，加入50mL无菌水中，制成抗生素溶液。外植体在抗生素溶液中振荡、浸泡4h。 

取出外植体，切去每个端头约1cm的小段，直接接种到初代培养基中。在消毒操作中要注意，镊子等工具与玻璃器皿间、瓶口与瓶口间不要相互触碰；手要握瓶子的中下部，不要碰到瓶口。 

3.初代培养： 

每隔14天，将外植体转接到新的初代培养基中，连续转接2～3个月，直至材料形成较明显的芽点后，再转接至增殖培养基中。初代转接时，需小心切去下部褐化组织，以免褐化组织对材料生长产生不良影响。初代培养基优选为MS基 本培养基4.55±0.25g，蔗糖40g，椰子汁50ml，活性炭1g，细胞分裂素噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)0.2mg，山农1号II型2mL，卡拉胶7g，水至1升；pH＝5.8～6.2。灭菌条件为：121℃，20±5min。 

置于25±2℃和2000±500lux光照条件下(日光灯或LED红光灯作为照明光源)培养。每天提供16～24h光照。 

4.诱导产生愈伤组织 

每隔14天，将外植体转接到新的愈伤组织培养基中，连续转接2～3个月，直至材料形成较明显的愈伤组织后，再转接至愈伤组织诱导不定芽培养基中。愈伤组织每2周内继代一次。 

继代转接时，需小心切去下部褐化组织，以免褐化组织对材料生长产生不良影响。愈伤组织培养基优选为MS基本培养基4.55±0.25g，蔗糖40～80g，椰子汁50ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤1.0mg，萘乙酸0.01mg，卡拉胶7g，水至1升；pH＝5.8～6.2愈伤组织培养基灭菌方法，灭菌条件为：121℃，(20±5)min。愈伤组织培养的温度为25±2℃，黑暗处培养至生长出愈伤组织。 

5.利用愈伤组织诱导不定芽 

将诱导的愈伤组织置于灭了菌的滤纸等水分吸干后，用解剖刀将其切成适当的大小，大概0.2-0.5cm³，然后置于到分化培养基上，培养3～14天。直至材料形成较明显的不定芽后，再转接至增殖培养基中。愈伤组织诱导不定茅培养基优选为MS基本培养基4.55±0.25g、蔗糖40～80g、椰子汁50ml、6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.1mg、卡拉胶7g、水至1升、pH＝5.8～6.2。愈伤组织诱导不定茅培养基灭菌方法为：在121℃下灭菌20±5分钟。愈伤组织诱导不定芽培养条件是将愈伤组织置于25±2℃和2000±500lux光照条件下(日光灯或LED红光灯作为照明光源)培养。每天提供16～24h光照。 

6.增殖培养 

20～25天转接一次。转接时，若外植体形成小而密的芽点，则切去底部衰老的组织，并将上部组织分切成2～3小块，然后接种到增殖培养基中。经过5～6代的转接，即可长出粗壮的单一植株。增殖培养基优选为MS基本培养基6.55±0.25g、蔗糖40～80g、椰子汁100ml、6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.1mg、卡拉胶7g、水至1升、pH＝5.8～6.2。增殖培养条件是将组织置于25±2℃的温度下和2000±500lux光照条件下(日光灯或LED红光灯作为照明光源)进行培养。每天提供16～24h光照。 

7.生根培养 

挑选较粗壮的植株，切去叶柄，将枝干切成4～5cm的小段，接种到生根培养基中。生根壮苗培养基优选为MS基本培养基6.55±0.25g、蔗糖40～80g+椰子汁50ml、吲哚丁酸1.0mg、卡拉胶7.5g、水至1升、pH＝5.8～6.2。培养基灭菌条件为：121℃，20±5min。生根培养条件置于25±2℃和2000±500lux光照条件下(日光灯或LED红光灯作为照明光源)培养。每天提供16～24h光照。 

8.出瓶移栽 

移栽组培苗可用椰糠∶土＝1∶1的土壤作为基质。在植株的根长至3～5cm长时，即可出瓶移栽。移栽前用竹筷或镊子将瓶苗轻轻取出，洗净培养基后用1‰的多菌灵浸泡5min，栽入育苗杯中，浇透水后用地膜覆盖、培养。 

实施例1：椰子汁含量对初代培养的影响 

本实验是在其他培养条件一致的情况下，只改变培养基中的椰子汁的含量，研究椰子汁含量变化对初代培养芽苗的影响。试验结果见下述表1： 

表1：椰子汁含量对初代培养的影响 

椰子汁的含量	成功率	0.05水平差异显著性的检验
			0	20％	a
20ml	50％	b
			50ml	85％	c
100ml	87％	c

注：0.05水平差异显著性检验中的不同字母表示差异显著，而相同字母代表两者差异不显著。 

从表1中可以看出，不使用椰子汁和使用椰子汁的效果有显著差异。在培养基中增加20ml的椰子汁可以是成功率增加30％。50ml和100ml的椰子汁没有显著差异。为了节约成本，可以在培养基中使用50ml的椰子汁。 

实施例2：6-(N-苄基)氨基嘌呤对利用愈伤组织诱导不定芽的影响 

本实验是在其他培养条件一致的情况下，只改变培养基中的6-(N-苄基)氨基嘌呤含量，研究其含量变化对利用愈伤组织诱导不定芽的影响。试验结果见下述表2： 

表2：6-(N-苄基)氨基嘌呤对利用愈伤组织诱导不定芽的影响 

6-(N-苄基)氨基嘌呤含量	成功率	0.05水平差异显著性的检验
			0.1mg	10％	a

[0062] 

0.25mg	50％	b
			0.5mg	88％	c
0.75mg	80％	d

从表2中可以看出，当培养基中加入0.5mg的6-(N-苄基)氨基嘌呤诱导不定芽的成功率最高。因此利用愈伤组织诱导不定芽的培养基优选0.5mg6-(N-苄基)氨基嘌呤。 

实施例3：萘乙酸对增值培养的作用 

本实验是在其他培养条件一致的情况下，只改变培养基中的萘乙酸含量，研究其含量变化对增值培养的影响。试验结果见下述表3：萘乙酸对增殖培养的作用 

萘乙酸含量	成功率	0.05水平差异显著性的检验
			0.05mg	30％	a
0.075mg	65％	b
			0.1mg	84％	c
0.2mg	74％	d

从表3中可以看出，当培养基中加入0.1mg的1-naphthylacetic产生的增值培养成功率为最高。 

实施例4：光度对生根培养的影响。 

本实验是在其他培养条件一致的情况下，只改变培养基中的光度，研究其变化对生根培养的影响。试验结果见下述表4： 

表4：光度对生根培养的影响 

光度(Lux)	生根率	0.05水平差异显著性的检验
			1000	17％	a
2000	83％	b
			2500	85％	b
3000	76％	c

从表4可以看出，当光度为2000lux和2500lux，其生根率均达到最高，两者没有显著差异。因此生根培养优选2000-2500lux的光照条件。 

实施例5：椰糠含量对移栽的组培苗根生长影响 

本实验是在其他培养条件一致的情况下，只改变基质中椰糠含量的，研究其变化对组培苗生根的影响。试验结果见下述表5： 

表5：椰糠含量对移栽的组培苗根生长影响 

由表5可以看出，基质中掺椰糠会显著提高根的生长速度。在比例为1∶1以上可以在两周苗即产生3cm以上的根。由于考虑到成本因素，基质最佳比例为1∶1。 

以上仅为本发明专利的具体实施方式，本发明专利中的方法和配方在各种大量实验中均获得一致的效果，在不同时间和地点的重复性试验也获得了相同的结果，因此本发明的保护范围不仅仅局限于此，任何不经过创造性的更改和替换都应该涵盖在本发明保护范围内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书所限定的范围为准。 

Claims (7)

1.一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤如下： 

(1)采集外植体：剪下枝梢半木质化部分； 

(2)外植体消毒：在无菌的状态下，用消毒试剂进行消毒；所述消毒试剂成分为0.1％～0.2％高锰酸钾m/v，10％～20％次氯酸钠溶液v/v，1mL/100mL吐温水，无菌水，1mL/50mL山农一号I型水，50mg/L链霉素、50mg/L头孢霉素、50mg/L制霉菌素，二甲基亚砜； 

(3)初代培养：将外植体转接到初代培养基中培养2-3个月；所述初代培养基为MS基本培养基添加蔗糖20～60g，椰子汁20～100ml，活性炭0.5～2g，细胞分裂素噻重氮苯基脲0.1～0.5mg，山农1号II型1～4mL，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH至5.8～6.2； 

(4)诱导产生愈伤组织：将外植体转接到新的愈伤组织的培养基中；所述愈伤组织的培养基为MS培养基中添加蔗糖20～100g，椰子汁20～100ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5～2mg，萘乙酸0.005～0.02mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调整pH至5.8～6.2； 

(5)利用愈伤组织诱导不定芽：将愈伤组织放入培养基中诱导不定芽；所述培养基是在正常的MS培养基中加入蔗糖20～100g，椰子汁20～100ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.2～1mg，萘乙酸0.05～0.2mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH到5.8～6.2； 

(6)增殖培养：转接一次到增殖培养基中；所述增殖培养基为MS培养基中加入蔗糖20～100g，椰子汁50～200ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.2～1mg，萘乙酸0.05～0.2mg，卡拉胶3～10g，水至1升，调节pH至5.8～6.2； 

(7)生根培养：将枝干切成小段，接种到生根培养基中；所述生根培养基为MS培养基中加入蔗糖40～80g，椰子汁20～100ml，吲哚丁酸0.5～2mg，卡拉胶5～10g，水至1升，调整pH至5.8～6.2；置于20～28℃、1000～3000lux光照条件下培养； 

(8)出瓶移栽：移栽组培苗用椰糠和土的混合物作为基质，其比例在1～2∶1之间，在植株的根长至3～5cm长时，出瓶移栽，移栽前用1‰的多菌灵浸泡，栽入育苗杯中，浇透水后用地膜覆盖，培养。 

2.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(3)所述的初代培养基优选为MS基本培养基中添加蔗糖40g，椰子汁50ml，活性炭1g，细胞分裂素噻重氮苯基脲0.2mg，山农1号II型2mL，卡拉胶7g，水至1升。

3.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(4)所述的愈伤组织的培养基优选为MS培养基中添加了蔗糖40～80g，椰子汁50ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤1.0mg，萘乙酸0.01mg，卡拉胶7g，水至1升。

4.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(5)所述的培养基优选为MS培养基中加入了蔗糖40～80g，椰子汁50ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5mg，萘乙酸0.1mg，卡拉胶7g，水至1升。

5.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(6)所述的增殖培养基优选为MS培养基中加入蔗糖40～80g，椰子汁100ml，6-(N-苄基)氨基嘌呤0.5mg，萘乙酸0.1mg，卡拉胶7g，水至1升。

6.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(7)所述的生根培养基优选为MS培养基中加入了蔗糖40～80g，椰子汁50ml，吲哚丁酸1.0mg，卡拉胶7.5g，水至1升，置于25±2℃、2000±500lux光照条件下。

7.根据权利要求1所述的一种用于组织培养楝树幼苗的方法，其特征在于步骤(8)中的基质为椰糠∶土＝1∶1的土壤。