CN111011215A - 一种用于沙冬青组织培养的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于沙冬青组织培养的培养基，包括初代诱导培养基、继代培养基和生根培养基，可用于取用沙冬青种子中的胚作为外植体，经过初代诱导培养、继代培养、生根培养和移栽过程，本发明选出的沙冬青整个组织培养过程中各生育期的最佳培养基配方及其组合能充分满足了沙冬青各个时期的营养需要和生长发育，并促进其组培扩繁全过程，可以保证沙冬青组织培养成功实施，为沙冬青规模化生产提供了强有力的支持。本发明的培养基配方简单，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种用于沙冬青组织培养的培养基
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，具体地说，涉及一种沙冬青组织培养中各个阶段的培养基。
背景技术
沙冬青（学名：Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f.），为豆科沙冬青属植物，属于渐危种，主要分布在我国内蒙古、宁夏、甘肃、新疆地区，蒙古国南部、中亚地区也有分布。沙冬青在荒漠地区的生态修复中具有重要的价值，拥有优秀的抗旱、耐寒、抗风、固沙的能力，其根部具有根瘤，结合菌种的施用在改善土壤方面有很好的应用，是荒漠地区防风固沙的优良选择。
但现有沙冬青种子容器育苗技术育苗周期长，出苗率低，一般仅为30~40%，通过组培扩繁技术提高沙冬青育苗成活率是解决沙冬青生态用苗的有效途径。但目前现有技术对沙冬青的组织培养仍处于摸索阶段，在制定技术方案时可以参考的资料不多，都必须通过试验来逐一解决，关键要解决外植体取材部位，在初代诱导和继代增殖时期产生的褐化问题，各培养时期培养基的选择，培养条件以及成苗后快繁技术等。
组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养与生根培养、炼化移栽等几个技术环节。组织培养在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。而掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
发明内容
本发明的目的是筛选出用于沙冬青组织培养中不同时期的最佳培养基，确定了培养基中各激素的配比，按照本发明的配方配制的培养基可满足沙冬青各个时期的营养需要和生长发育。
本发明在进行了信息搜集、汇总与分析的基础上制定了实施方案，全面、多方位的进行组培实验，本发明筛选了从初代诱导→继代增殖→生根培养等不同时期的培养基。使初代、增殖、生根各个时期的培养达到最佳效果，并且组合效果更佳，保障沙冬青在组培扩繁过程中不同阶段的效果不断促进。
本发明的实施方案包含沙冬青整个组织培养过程中各生育期的最佳培养基，它们是经过周密、反复多次试验得出的，是在基本培养基的基础上根据沙冬青各生育期的需要添加了不同类型的植物生长剂和不同的配比。
在本发明提供了一种沙冬青组织培养过程各阶段所需的培养基，其特征在于，该培养基由初代诱导培养基、增殖培养基、生根培养基组成。
这些沙冬青组培各个阶段最佳培养基是经过比较试验筛选出的。本发明提供的培养基适用于沙冬青的组织培养，具体而言，适用于沙冬青的生长点培养。
本发明的实施方案之一是提供一种沙冬青的初代诱导培养基：B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.05-0.1 mg/L+CH 0.5-1g/L；进一步优选为B5+NAA0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L。
研究发现，不同种激素组合均可诱导沙冬青分化丛生芽，但各个组合的分化率不同，WH（无KI）+NAA 0.1~0.5mg/L+6-BA 0.5~1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L是沙冬青外植体胚的最佳诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体胚新增芽数多，分化率最高，其分化率可达233.33~266.67%，并且可以有效减缓甚至消除培养基褐化现象。
本发明的实施方案之一是提供了一种沙冬青的继代培养基：WH（无KI）+NAA0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L。该培养基是沙冬青最佳的继代增殖培养基，不但产生不定芽最多，而且增值倍数可达16.43倍。
本发明的实施方案之一是提供了一种沙冬青的生根培养基：1/2MS+IAA 0.1mg/L+B9 1mg/L。
研究发现，添加B9 农药丁酰肼对沙冬青组织培养后的炼苗有利，可以控制沙冬青组培苗有害物质分泌，阻止过快生长，提高成活率。适宜生根的培养基是1/2MS+IAA 0.1mg/L+B9 1mg/L。。
在本发明实施方案中，在本领域技术人员公知范围内，WH、NAA、6-BA 、GA、赤霉素、IAA、B9分别是怀特培养基、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、丁酰肼。
本发明选出的沙冬青整个组织培养过程中各生育期的最佳培养基能充分满足了沙冬青各个时期的营养需要和生长发育，是保证沙冬青组织培养成功实施，达到流程化生产的关键和核心，此外，在基础培养基的配比上选用卡拉胶代替琼脂作固化剂，食用白糖代替蔗糖作为碳源，自来水代替蒸馏水，有效降低成本，为沙冬青规模化生产提供了强有力的支持。并且，初代诱导、继代培养、生根培养各阶段会相互影响，上述培养基的选择可以使沙冬青在组培扩繁的各个阶段不断促进，能大大提高工厂化沙冬青育苗的产量。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。
一、沙冬青外植体的材料
实验用的沙冬青种子采自内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司抗旱植物研究院实验基地的试验苗圃。将饱满、无病虫害的沙冬青种子流水冲洗，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，每次5min，在无菌滤纸上吸干水分，之后在超净工作台挑出沙冬青的种子胚作为再生的外植体，若种子胚较小，可在解剖镜下处理。将种子胚接种于初代诱导培养基上，建立试管苗无性繁殖系。选取10~20天的丛生芽，丛生芽剪去基部，截取带侧芽(或顶芽)的0.2~0.5cm茎段，作为再生的外植体。
二、筛选统计方法
初代芽诱导率＝(诱导出的丛生芽数/接种的外植体总数)×100％
继代增殖倍数＝(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)×100％
生根率＝(分化根的外植体数/接种的外植体总数)×100％
三、沙冬青组织培养各个阶段最佳培养基的筛选
WH培养基较MS培养基相比，无机盐含量低，有益于组培苗的生长。故选择以WH为基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水，分别添加不同配比的细胞分裂素和生长素进行培养基的筛选。
1、初代诱导培养基的选择
将WH设为有KI微量元素和无KI微量元素，NAA的浓度设0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1mg/L四个浓度梯度，6-BA的浓度设0.3mg/L、0.5mg/L 、0.7mg/L、1mg/L四个浓度梯度，进行不同组配，每组三个重复，每组培养基均含有GA 0.5 mg/L和活性炭 1g/L。接种时每瓶接3个胚，观察生长点在不同培养基上不定芽的发生情况。
初代诱导培养的条件为温度26±1℃，昼夜温差范围7~8℃，湿度50~60%光照强度1500Lx，除白天自然光照外，夜间不用补光。
从表1可见，各个激素组合的分化率不同，18号、19号、20号、22号、23号、24号、26号、27号和28号是沙冬青种子胚的培养基较佳的诱导培养基，即WH（无KI）+NAA 0.1~0.5mg/L+6-BA 0.5~1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达233.33~266.67%。对比WH基础培养基有KI微量元素和无KI微量元素的区别，可以发现，当WH基础培养基存在KI微量元素时，培养基褐化现象严重，而WH基础培养基无KI微量元素时，有效减缓甚至消除培养基褐化现象。
表1：不同培养基和激素浓度对沙冬青生长点丛生芽诱导率的影响
处理编号 培养基成分（含GA 0.5 mg/L和活性炭 1g/L） 接种数（个） 丛生芽诱导率（%）
1 WH+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 11.11
2 WH+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 44.44
3 WH+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 100.00
4 WH+NAA 0.1mg/L+6-BA 1mg/L 3 66.67
5 WH+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 22.22
6 WH+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 55.56
7 WH+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 55.56
8 WH+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L 3 66.67
9 WH+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 0.00
10 WH+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 22.22
11 WH+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 88.89
12 WH+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L 3 100.00
13 WH+NAA 1mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 33.33
14 WH+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 22.22
15 WH+NAA 1mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 33.33
16 WH+NAA 1mg/L+6-BA 1mg/L 3 66.67
17 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 144.44
18 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 266.67
19 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 255.56
20 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 1mg/L 3 233.33
21 WH（无KI）+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 133.33
22 WH（无KI）+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 266.67
23 WH（无KI）+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 244.44
24 WH（无KI）+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L 3 244.44
25 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 155.56
26 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 255.56
27 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 255.56
28 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L 3 244.44
29 WH（无KI）+NAA 1mg/L+6-BA 0.3mg/L 3 166.67
30 WH（无KI）+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L 3 122.22
31 WH（无KI）+NAA 1mg/L+6-BA 0.7mg/L 3 188.89
32 WH（无KI）+NAA 1mg/L+6-BA 1mg/L 3 144.44
2、继代增殖培养基的选择
将上述诱导分化出的不定芽分别接种到继代增殖培养基上，标记好初代培养基编号，NAA设0.1mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，6-BA设0.1mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，共四种培养基，每组重复3次，每瓶接5个单株，观察记录再生不定芽的分化生长情况，15天后统计不同激素组合条件下芽的增殖倍数。
继代培养条件与初代培养条件相同。经诱导培养后，将在诱导培养基中产生的0.2-0.5cm的沙冬青丛生芽生长点，分别移入继代增殖培养基中(见表2)，2-3天后部分材料的芽基部出现芽丛时开始观察记录，15天后统计试验结果，部分数据见表2（其他特征不明显或效果不明显的数据未记入）。
表2：激素浓度及其组合对沙冬青不定芽增殖的影响
处理编号 初代培养基编号 培养基成分（含GA 0.5 mg/L和活性炭 1g/L） 增殖倍数 不定芽生长状况
1 18 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 14.70 强健，新出苗多，产生不定芽多
2 18 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 11.43 强健，新出苗较多，产生玻璃化较少
3 18 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 7.69 较强健，新出苗少，产生玻璃化较少
4 18 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 8.60 较强健，新出苗少，产生玻璃化较少
5 19 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 13.34 强健，新出苗较多，产生玻璃化较少
6 19 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 7.15 较强健，新出苗少，产生玻璃化较少
7 19 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 3.90 较强健，新出苗少，生长慢
8 19 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 7.53 较强健，新出苗少，产生玻璃化较少
9 20 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 13.82 强健，新出苗多，产生不定芽多
10 20 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 5.95 较强健，新出苗少，生长慢
11 20 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 4.55 较强健，新出苗少，生长慢
12 20 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 8.31 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
13 22 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 14.82 强健，新出苗多，产生不定芽多
14 22 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 4.21 较强健，新出苗少，生长慢
15 22 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 4.66 较强健，新出苗少，生长慢
16 22 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 8.02 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
17 23 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 16.43 强健，新出苗多，产生不定芽多
18 23 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 9.40 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
19 23 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 6.81 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
20 23 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 9.04 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
21 24 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 12.87 强健，新出苗多，产生不定芽多
22 24 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 6.02 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
23 24 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 9.44 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
24 24 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 7.55 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
25 26 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 12.44 强健，新出苗多，产生不定芽多
26 26 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 8.84 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
27 26 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 5.15 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
28 26 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 8.15 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
29 27 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 13.80 强健，新出苗多，产生不定芽多
30 27 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 9.27 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
31 27 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 5.66 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
32 27 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 13.01 强健，新出苗多，产生不定芽多
33 28 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L 10.01 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
34 28 WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L 7.45 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
35 28 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L 8.32 较强健，新出苗较多，产生玻璃化较多
36 28 WH（无KI）+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L 4.89 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
试验表明，沙冬青在WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L的继代培养中，对丛生芽的生长有促进作用，相比其他组合更为理想，增值倍数最高可达16.43倍，丛生芽数量多，幼苗较大，移植出苗率效果最佳。但通过对比不同初代培基不定芽的继代增殖倍数，可以发现初代培养基的激素环境会对不定的芽后期增殖阶段的适应性带来影响，综合结果表明：初代培养基WH（无KI）+NAA 0.1~0.5mg/L+6-BA 0.5~1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭 1g/L，和继代培养基WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L的组合效果最佳。
3、生根培养基的选择
将继代培养基中长势较好的苗，分成单株转入生根培养基中，B9分为0 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L三个浓度梯度，共四种培养基，每组重复3次，每瓶接入4株，观察记录不同培养基上苗的生根情况，10天后统计生根率。
生根培养条件为温度26±1℃，昼夜温差范围7~8℃，湿度50~60%光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不用补光。
从生根培养10天的试验结果来看(表3)，两个培养基对根的形成均有诱导作用，其中2号生根培养基生根效果较好，生根率达98.77％。
B9为农药丁酰肼，添加目的是控制有害物质分泌，阻止过快生长，提高组培苗的成活率。
其中MS基本培养基中，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，20g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。
从生根培养10天的试验结果来看(表3)，两个培养基对根的形成均有诱导作用，其中3号生根培养基生根和移栽效果较好，生根率达75％、移栽成活率达55.56%。生根基部可新增带根的丛生芽，平均可达3-4个。因此，适宜生根的培养基是1/2MS+IAA 0.1mg/L+B91mg/L。
表3：不同丁酰肼浓度对幼苗生根和移栽的影响
处理编号 培养基成分 生根率（%） 根系生长状况 移栽成活率（%）
1 1/2MS+IAA 0.5mg/L+B9 0 mg/L 33.33 粗短，数量少 16.67
2 1/2MS+IAA 0.5mg/L+B9 0.5mg/L 50.00 粗短，数量多 38.89
3 1/2MS +IAA 0.5mg/L+B9 1mg/L 75.00 长，数量多 55.56
3 1/2MS +IAA 0.5mg/L+B9 1mg/L 41.67 粗短，数量少 22.22
以上实施例目的是为具体说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (5)

1.一种沙冬青组织培养的培养基，包括初代诱导培养基、继代培养基、生根培养基，其特征在于，初代诱导培养基的组成为WH（无KI）+NAA 0.1~0.5mg/L+6-BA 0.5~1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭 1g/L；。
2.根据权利要求1所述的一种沙冬青组织培养的培养基，其特征在于，所述继代培养基组成为WH（无KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L。
3.根据权利要求1所述的一种沙冬青组织培养的培养基，其特征在于，所述生根培养基组成为1/2MS+IAA 0.1mg/L+B9 1mg/L。
4.根据权利要求1或2任一所述的一种沙冬青组织培养的培养基，其特征在于，WH（无KI）基本培养基中，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，用40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，用自来水代替蒸馏水。
5.根据权利要求3所述的一种沙冬青组织培养的培养基，其特征在于，所述MS基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，用20g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。
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