CN111642401A - 一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，包括以下步骤：制备孔径大小为200‑100μm胚性细胞团诱导材料，用不同浓度秋水仙素处理200‑100μm胚性细胞团，处理后的胚性细胞团的生长与植株的再生，四倍体细胞与植株鉴定，厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。本发明所提供的高效获得无嵌合体多倍体植株与细胞的方法能显著地提高厚朴二倍体的加倍效率，且解决了多倍体育种过程中容易产生嵌合体的这一关键技术难题，从而大大提高了多倍体育种效率，使大规模应用多倍体育种技术产生无嵌合体多倍体植株与细胞成为可能。
Description
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，具体地说，涉及一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法。
背景技术
厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)植物。厚朴的树皮、根皮、枝皮和花果均可入药。厚朴树皮为传统中药，在我国已有两千多年药用历史。厚朴的主要活性成分有厚朴酚、和厚朴酚、厚朴碱、挥发油、β-桉叶醇等，其中主要活性成分厚朴酚(C18H18O2)与和厚朴酚(C18H18O2)具有抗肿瘤，抗菌、抗溃疡、抗抑郁及防龋作用。厚朴不仅具有重要的药用价值，而且也有较高的观赏价值。由于其药用价值野生厚朴被过度砍伐，资源和分布急剧下降，被列为国家二级保护野生植物。
天然状态下的厚朴为二倍体，厚朴体细胞染色体数为2n＝38，其中中部着丝点染色体(m)为16对，近中部着丝点染色体(sm)为2对，近端部着丝点染色体(st)为1对，其核型公式为K(2n)＝19X＝38＝32m+4sm(2SAT)+2st。
嵌合体是目前多倍体育种中普遍遇到的问题，加倍的组织或者细胞无法及时的从嵌合体中分离出来，就会被生长旺盛的正常二倍体细胞包围，最终消失，植株恢复成原有倍性，致使诱导失败。由多细胞的组织作为诱导材料，容易产生嵌合体，如外植体茎尖诱导、叶柄诱导、叶片、顶芽。即使诱导鉴定为多倍体后，后期增值过程中又出现二倍体，需要不断的纯化，由于秋水仙素诱导染色体加倍的前提是细胞处于分裂期，而这些多细胞组织在秋水仙素处理的有限时间内，很难达到所有细胞都处于分裂期，因此未处于分裂期的细胞就未加上倍，也就产生了嵌合体。
因此，有必要提供一种高效获得无嵌合体多倍体植株与细胞的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，是通过以200-100μm胚性细胞团(ECAs)为诱导材料，由于诱导材料胚性细胞团孔径是目前为止染色体加倍报道里面最小的，最接近单细胞起源，因此可以避免嵌合体。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，包括以下步骤：制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料，用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团，处理后的胚性细胞团的生长与植株的再生，四倍体细胞与植株鉴定，厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。
可选地，具体包括以下步骤：
步骤1、制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料；
步骤2、用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团；
步骤3、清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养；
步骤4、四倍体细胞与植株鉴定；
步骤5、厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。
可选地，所述步骤1中的制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料具体为：
挑取于继代培养基(M1)上培养的每隔2周继代一次且发育良好的约500mg厚朴胚性愈伤组织，放入20ml M2液体培养基(不含2,4-D)的50ml三角瓶中；加入用75％酒精清洗过的磁力搅拌子(大小7mm*30mm)，置于IKA C-MAG HS7磁力搅拌器于0℃、1250rpm进行细胞团的打碎分散，10分钟以后取下并分别过200-100μm筛子，得到较为均一的胚性细胞团。
可选地，所述的继代培养基(M1)配方如下：木本植物培养基+1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+1g/L酪蛋白水解物+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+1g/L活性炭，pH 5.8；不含2,4-二氯苯氧乙酸的M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH 5.8。
可选地，所述步骤2中的用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团具体为：称取秋水仙素90mg于含有少量蒸馏水的三角瓶中，并定容至6ml，1.5％w/v，然后进行过滤灭菌；吸取0.5mL-2mL秋水仙素母液分别加入到含有13mL-14.5mL ECAs的50ml三角瓶中，使最终的浓度为0-0.2％(w/v)；然后将其分装到体积为50ml的三角瓶中，每个三角瓶5mL，然后将其置于转速为120rpm，环境温度为25℃的摇床中，黑暗条件下培养72h。
可选地，所述步骤3中的清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养具体为：秋水仙素处理达到一定时间后，取出三角瓶将秋水仙素处理过的胚性细胞团悬浮液倒入倾斜放置的9cm培养皿，静置一段时间，直到细胞团沉于底部为止，弃去上清液，加入不含秋水仙素的M2液体培养基5ml左右，再次静置沉淀，直到细胞团沉于底部为止，再次弃去上清液，如此重复三次；吸取1mL ECAs于三层滤纸上，并将含有ECAs的最上层滤纸转移至含有25ml M2固体培养基9cm培养皿中，置于L:D＝16h:8h，温度为25℃的无菌操作间进行培养；一个月后将M2固体培养基上再生的单克隆转移至新鲜的M2固体培养基。
可选地，M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH 5.8；
M2固体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+1g/L活性碳，pH 5.8。
可选地，所述步骤4中的四倍体细胞与植株鉴定具体为：取生长周期大小为3个月的秋水仙素处理过的小植株/细胞以及对照组小植株/细胞进行倍性鉴定，取200mg左右的叶片/细胞于1ml WPB解离液浸没叶片，并用不锈钢白金刃口双面刀片将叶片切碎，15min后利用CellTrics(30μm)disposable filters对其进行过滤，弃去沉淀；往过滤后的液体中分别加入50μg/mL RNase，50μg/mL PI染色剂，染色30min，避光。
可选地，所述步骤5中的厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽具体为：
步骤5.1、将继代培养2周的厚朴胚性细胞团转入M2固体培养基上进行分化培养；体细胞胚分化和萌发培养基的组成为WPM+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮，pH 5.8；培养条件为恒温25℃暗培养；经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚；
步骤5.2、在体视显微镜下将子叶胚阶段的成熟体细胞胚捡出，转入装有20mL体细胞胚分化和萌发培养基的培养皿上进行萌发培养；培养条件为25℃恒温，光周期16/8h，光照强度60μmol m-2s-1；在体细胞胚根伸出，子叶发育展开时，转入装有50ml M2固体培养基的250ml组培瓶中上继续培养；
步骤5.3、将生根的厚朴组培苗从组培瓶中取出，自来水冲洗，将附着在组培苗上的植物凝胶清洗干净，转入栽培基质中；栽培基质为泥炭土与珍珠岩，并高温灭菌，灭菌后的栽培基质装入到规格为133mm*173mm长方形白色塑料盒保鲜盒中，底层为珍珠岩，厚度为30mm，上层为均匀混合的质量比为3:1的泥炭土与珍珠岩，厚度为50mm，将移入组培苗的保鲜盒转移至高浓度CO2间，800ppm CO2、温度为22℃、相对湿度为60％,，盖上保鲜膜保持湿度，每周浇霍格兰氏液1mL/株，并不定期适当浇水，培养2周后将保鲜膜打孔，并转移至温度为21℃，湿度70％常规土培培养间培养，1周后揭掉保鲜膜。
可选地，霍格兰氏液配方如下：大量元素(100×)10ml/L，铁盐(200×)5ml/L，微量元素(500×)2ml/L；100×表示母液大量元素浓度配制成了100倍；200×表示母液铁盐浓度配制成了200倍，500×表示母液微量元素浓度配制成了500倍；大量元素(100×)中的母液元素及扩大了100倍的浓度包括：Ca(NO3)2·4H2O 23.8512g/L；NH4H2PO4 1.4952g/L；KNO351.561g/L；MgSO4·7H2O 5.9939g/L；铁盐(200×)中的母液元素及扩大了200倍的浓度包括：Na2EDTA 1.6602g/L，FeSO4·7H2O 0.311375g/L；微量元素(500×)中的母液元素及扩大了500倍的浓度包括：H3BO3 0.2993g/L，MnCl2·4H2O 0.201g/L，ZnSO4·7H2O 0.0451g/L，CuSO4·5H2O 0.0262g/L，H2MoO3·H2O 0.0113g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0125g/L NH4NO31.1726g/L。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本方法与传统育种相比，本发明基于组培体系，明显缩短了育种周期。育种不受气候条件影响，能够短时间内获得大量的无嵌合四倍体植株与细胞。
2)本发明选择孔径大小为200-100μm胚性细胞团(ECAs)为诱导材料，与目前报道的以茎段、顶芽、叶柄、叶片、种子等外植体作为诱导材料相比能够避免嵌合体多倍体的产生，它是目前染色体加倍报道里面最接近单细胞起源的诱导材料。
3)本发明通过摸索秋水仙素不同处理浓度以及不同时间梯度，显著地提高厚朴二倍体的加倍效率，最高诱导率达到100％(0.2％，72h)，获得最高诱导率的处理组合。
4)本发明不但获得了四倍体植株还获得了具有再生能力的四倍体细胞、目前没有关于能够获得具有再生能力的多倍体细胞的报道，本发明相比于现有报道的多倍体育种技术，具有高效、快速，无嵌合体的技术特点。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明诱导材料的制备；其中，a代表厚朴胚性愈伤组织，b代表过筛后孔径大小为200-100μm胚性细胞团(ECAs)，c代表200-100μm胚性细胞团(ECAs)于50ml三角瓶中悬浮培养；
图2是本发明步骤3中一个月后秋水仙素处理过的细胞团的再生；
图3是本发明倍性鉴定图；其中，a代表二倍体植株/细胞，b代表四倍体植株/细胞；
图4是本发明诱导率统计表；
图5是本发明四倍体细胞与胚；其中，a代表厚朴四倍体细胞，b代表一个月大小厚朴四倍体体胚；
图6是本发明四倍体厚朴移栽成活。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1、制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料：
如图1所示，挑取于继代培养基(M1)上培养的每隔2周继代一次且发育良好的约500mg厚朴胚性愈伤组织，放入20ml M2液体培养基(不含2,4-D)的50ml三角瓶中；加入用75％酒精清洗过的磁力搅拌子(大小7mm*30mm)，置于IKA C-MAG HS7磁力搅拌器于0℃、1250rpm进行细胞团的打碎分散，10分钟以后取下并分别过200-100μm筛子，得到较为均一的胚性细胞团；
其中，继代培养基(M1)配方如下：木本植物培养基(woody plant medium，WPM)+1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+1g/L酪蛋白水解物(Casein hydrolysate，CH)+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶(Phytagel)+1g/L活性炭(activated charcoal)，pH 5.8；M2液体培养基(不含2,4-D)配方如下：木本植物培养基(woody plant medium，WPM)+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+30g/L蔗糖，pH 5.8；
诱导材料即胚性细胞团的孔径大小的取值范围100-200μm，孔径小，几乎可认为它再生的植株是单细胞起源的，因此就解决了多倍体育种中嵌合体的难题。孔径大于该范围容易导致嵌合体，孔径小于该范围不容易再生，该孔径范围胚胎发生速度以及质量最好，因为孔径过大，胚与胚易粘在一起，更容易生长畸形。
步骤2、用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团：
称取秋水仙素90mg于含有少量蒸馏水的三角瓶中，并定容至6ml(1.5％w/v)，然后进行过滤灭菌。吸取0.5mL,1mL,1.5mL和2mL秋水仙素母液分别加入到含有14.5mL，14mL，13.5mL，13mL ECAs的50ml三角瓶中，使最终的浓度为0，0.05，0.1，0.15，与0.2％(w/v)。然后将其均匀分装到三个(三个处理时间梯度，即24h、48h、72h)体积为50ml的三角瓶中，每个三角瓶5mL，然后将其置于摇床(120rpm 25℃)黑暗条件下培养72h。
步骤3、清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养：
秋水仙素处理达到一定时间(24h、48h、72h)后，取出三角瓶将秋水仙素处理过的胚性细胞团悬浮液倒入倾斜放置的9cm培养皿，静5min，直到细胞团沉于底部为止，弃去上清液，加入不含秋水仙素的M2液体培养基5ml左右，再次静置沉淀，直到细胞团沉于底部为止，再次弃去上清液，如此重复三次；吸取1mL ECAs于三层滤纸上，并将含有ECAs的最上层滤纸转移至含有25ml M2固体培养基9cm培养皿中，置于L:D＝16h:8h，温度为25℃的无菌操作间进行培养；一个月后将M2固体培养基上再生的单克隆(如图2所示)转移至新鲜的M2固体培养基；
其中，M2液体培养基配方如下：木本植物培养基(woody plant medium，WPM)+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+30g/L蔗糖，pH 5.8，该培养基为不含秋水仙素的M2液体培养基。M2固体培养基配方如下：木本植物培养基(woody plant medium，WPM)+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶(Phytagel)+1g/L活性碳，pH 5.8。
秋水仙素浓度的取值范围：0.05％-0.2％，浓度大于0.2％会导致诱导材料直接死亡，浓度低于0.5％，浓度太低无法诱导加倍。
步骤4、四倍体细胞与植株鉴定：
取生长周期大小为3个月的秋水仙素处理过的小植株以及对照组小植株进行倍性鉴定，每个处理选取24株(8个克隆，每个克隆3株)进行倍性鉴定。取200mg左右的叶片于1mlWPB解离液浸没叶片，并用不锈钢白金刃口双面刀片将叶片切碎，15min后利用CellTrics(30μm)disposable filters对其进行过滤，弃去沉淀。往过滤后的液体中分别加入50μg/mLRNase，50μg/mL PI染色剂，避光条件下染色30min，利用流式细胞仪进行分析，倍性鉴定图如图3所示。
基于植株倍性鉴定结果(于0.2％，72h诱导率为100％)挑取处理条件为0.2％，72h的再生细胞团愈伤组织，于装有20ml M2液体培养基的50ml三角瓶中，往装有20ml M2液体培养基的50ml三角瓶中加入用75％酒精清洗过的磁力搅拌子(大小7mm*30mm)置于IKA C-MAG HS7磁力搅拌器于0℃、1250rpm进行细胞团的打碎分散，10分钟以后取下并分别过200-100μm筛子，挑取该孔径大小的细胞团于M1继代培养基上继代培养。
继代到一定量后，分别取200mg左右的细胞以及对照组二倍体细胞于1ml WPB解离液浸没细胞，并用不锈钢白金刃口双面刀片将细胞切碎，15min后利用CellTrics(30μm)disposable filters对其进行过滤，弃去沉淀。往过滤后的液体中分别加入50μg/mLRNase，50μg/mL PI染色剂，染色30min(避光)后利用流式细胞仪进行分析；利用流式细胞仪拍照(图3)并根据流式细胞仪记录四倍体诱导情况即诱导率，如图4和表1所示，图中的X-mean值表示DNA的相对含量，四倍体的X-mean值(83.39)为二倍体(43.60)的2倍，因此四倍体细胞的鉴定结果是四倍体。
表1由秋水仙素处理过的ECAs再生的三个月大小植株的倍性水平
注：中间体指倍性介于二倍与四倍间的植株
步骤5、厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽：
步骤5.1、厚朴四倍体细胞分化胚：
将继代培养2周的厚朴四倍体胚性细胞团转入体细胞胚分化和萌发培养基上进行分化培养。体细胞胚分化和萌发培养基的组成为WPM+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮，pH 5.8。培养条件为恒温25℃暗培养。经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚(如图5所示)。
步骤5.2、四倍体体细胞胚分化成植株：
在体视显微镜下将子叶胚阶段的成熟体细胞胚捡出，转入装有20mL体细胞胚分化和萌发培养基的培养皿上进行萌发培养。培养条件为25℃恒温，光周期16/8h，光照强度60μmol m-2s-1；在体细胞胚根伸出，子叶发育展开时，转入装有50ml M2固体培养基的250ml组培瓶中继续培养。经过2个月的培养可以得到具有良好根系的厚朴组培苗。
步骤5.3、四倍体厚朴组培苗的驯化移栽：
将生根的厚朴组培苗从组培瓶中取出。自来水冲洗，将附着在组培苗上的植物凝胶清洗干净，转入栽培基质中。栽培基质为泥炭土(Jiffy)与珍珠岩,并高温灭菌，灭菌后的栽培基质装入到规格为133mm*173mm长方形白色塑料盒保鲜盒中，底层(约为30mm)为珍珠岩(透气与保湿作用)，上层(约50mm)为均匀混合的泥炭土与珍珠岩(泥炭土：珍珠岩＝3：1)，将移入组培苗的保鲜盒转移至高浓度CO2间(800ppm CO2、温度为22℃、相对湿度为60％)，盖上保鲜膜保持湿度，每周浇霍格兰氏液(Hoagland Standard solution)(1mL/株)并不定期适当浇水。
霍格兰氏液(Hoagland Standard solution)配方如下：大量元素(100×)10ml/L，铁盐(200×)5ml/L，微量元素(500×)2ml/L。100×表示母液大量元素浓度配制成了100倍。200×表示母液铁盐浓度配制成了200倍，500×表示母液微量元素浓度配制成了500倍。具体母液元素及浓度(表中浓度为扩大了相应倍数后的浓度)如下表2所示:
表2霍格兰氏液(Hoagland Standard solution)配方
培养2周后将保鲜膜打孔(透气)，并转移至温度为21℃，湿度70％常规土培培养间培养，1周后揭掉保鲜膜，如图6所示，厚朴四倍体细胞能再生成完整植株。
本发明方法能显著地提高厚朴二倍体的加倍效率，最高诱导率达到100％(0.2％，72h)，远远高于常规多倍体诱导效率。
本发明首次获得具有再生成完整植株能力的多倍体细胞系，现有技术中的四倍体细胞系无再生成完整植株的能力。对于木本植物而言等其开花结果再播种育种年限过长，因此无性繁殖是一个较理想的繁殖方式，使大规模应用多倍体育种技术产生无嵌合体多倍体植株与细胞成为可能。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料，用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团，处理后的胚性细胞团的生长与植株的再生，四倍体细胞与植株鉴定，厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料；
步骤2、用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团；
步骤3、清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养；
步骤4、四倍体细胞与植株鉴定；
步骤5、厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的制备孔径大小为200-100μm胚性细胞团诱导材料具体为：
挑取于继代培养基(M1)上培养的每隔2周继代一次且发育良好的约500mg厚朴胚性愈伤组织，放入20ml不含植物凝胶和活性炭的M2液体培养基的50ml三角瓶中；加入用75％酒精清洗过的磁力搅拌子，磁力搅拌子的大小7mm*30mm，置于IKA C-MAG HS7磁力搅拌器于0℃、1250rpm进行细胞团的打碎分散，10分钟以后取下并分别过200-100μm筛子，得到较为均一的胚性细胞团。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的继代培养基(M1)配方如下：木本植物培养基+1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+1g/L酪蛋白水解物+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH 5.8；不含2,4-二氯苯氧乙酸的M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH 5.8。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的用不同浓度秋水仙素处理200-100μm胚性细胞团具体为：称取秋水仙素90mg于含有少量蒸馏水的三角瓶中，并定容至6ml，1.5％w/v，然后进行过滤灭菌；吸取2mL-0.5mL秋水仙素母液分别加入到含有13mL-14.5mL ECAs的50ml三角瓶中，使最终的浓度为0-0.2％(w/v)；然后将其分装到体积为50ml的三角瓶中，每个三角瓶5mL，然后将其置于转速为120rpm，环境温度为25℃的摇床中，黑暗条件下培养24h、48h、72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养具体为：秋水仙素处理达到一定时间后，取出三角瓶将秋水仙素处理过的胚性细胞团悬浮液倒入倾斜放置的9cm培养皿，静置一段时间，直到细胞团沉于底部为止，弃去上清液，加入不含秋水仙素的M2液体培养基5ml左右，再次静置沉淀，直到细胞团沉于底部为止，再次弃去上清液，如此重复三次；吸取1mL ECAs于三层滤纸上，并将含有ECAs的最上层滤纸转移至含有25ml M2固体培养基9cm培养皿中，置于L:D＝16h:8h，温度为25℃的无菌操作间进行培养；一个月后将M2固体培养基上再生的单克隆转移至新鲜的M2固体培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH 5.8；
M2固体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+1g/L活性碳，pH 5.8。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的四倍体细胞与植株鉴定具体为：取生长周期大小为3个月的秋水仙素处理过的小植株/细胞以及对照组小植株/细胞进行倍性鉴定，取200mg左右的叶片/细胞于1ml WPB解离液浸没叶片，并用不锈钢白金刃口双面刀片将叶片切碎，15min后利用CellTrics(30μm)disposable filters对其进行过滤，弃去沉淀；往过滤后的液体中分别加入50μg/mL RNase，50μg/mL PI染色剂，染色30min，避光。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽具体为：
步骤5.1、将继代培养2周的厚朴胚性细胞团转入M2固体培养基上进行分化培养；体细胞胚分化和萌发培养基的组成为WPM+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮，pH 5.8；培养条件为恒温25℃暗培养；经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚；
步骤5.2、在体视显微镜下将子叶胚阶段的成熟体细胞胚捡出，转入装有20mL体细胞胚分化和萌发培养基的培养皿上进行萌发培养；培养条件为25℃恒温，光周期16/8h，光照强度60μmolm-2s-1；在体细胞胚根伸出，子叶发育展开时，转入装有50ml M2固体培养基的250ml组培瓶中上继续培养；
步骤5.3、将生根的厚朴组培苗从组培瓶中取出，自来水冲洗，将附着在组培苗上的植物凝胶清洗干净，转入栽培基质中；栽培基质为泥炭土与珍珠岩，并高温灭菌，灭菌后的栽培基质装入到规格为133mm*173mm长方形白色塑料盒保鲜盒中，底层为珍珠岩，厚度为30mm，上层为均匀混合的质量比为3:1的泥炭土与珍珠岩，厚度为50mm，将移入组培苗的保鲜盒转移至高浓度CO2间，800ppm CO2、温度为22℃、相对湿度为60％,，盖上保鲜膜保持湿度，每周浇霍格兰氏液1mL/株，并不定期适当浇水，培养2周后将保鲜膜打孔，并转移至温度为21℃，湿度70％常规土培培养间培养，1周后揭掉保鲜膜。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，霍格兰氏液配方如下：大量元素(100×)10ml/L，铁盐(200×)5ml/L，微量元素(500×)2ml/L；100×表示母液大量元素浓度配制成了100倍；200×表示母液铁盐浓度配制成了200倍，500×表示母液微量元素浓度配制成了500倍；大量元素(100×)中的母液元素及扩大了100倍的浓度包括：Ca(NO3)2·4H2O23.8512g/L；NH4H2PO4 1.4952g/L；KNO3 51.561g/L；MgSO4·7H2O 5.9939g/L；铁盐(200×)中的母液元素及扩大了200倍的浓度包括：Na2EDTA 1.6602g/L，FeSO4·7H2O 0.311375g/L；微量元素(500×)中的母液元素及扩大了500倍的浓度包括：H3BO3 0.2993g/L，MnCl2·4H2O0.201g/L，ZnSO4·7H2O 0.0451g/L，CuSO4·5H2O 0.0262g/L，H2MoO3·H2O 0.0113g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0125g/L NH4NO3 1.1726g/L。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008030423A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Arborgen, Llc | A liquid-based method for producing plant embryos |
| CN111387176A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-07-10 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种厚朴胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法 |
| CN111504967A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-07 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种测定植物细胞保存再生率的方法 |
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- 2020-07-07 CN CN202010648937.5A patent/CN111642401B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008030423A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Arborgen, Llc | A liquid-based method for producing plant embryos |
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| CN111504967A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-08-07 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种测定植物细胞保存再生率的方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YANFEN GAO等: "Establishing Tetraploid Embryogenic Cell Lines of Magnolia officinalis to Facilitate Tetraploid Plantlet Production and Phenotyping", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 * |
| 昆明植物研究所: "昆明植物所等建立木兰科植物多倍体高效诱导体系", 《高科技与产业化》 * |
| 高彦粉: "药用植物厚朴四倍体的研发", 《万方学术期刊数据库》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112544444A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-26 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种用于红花木莲的组培培养基、红花木莲胚性愈伤组织培养的方法及红花木莲快繁的方法 |
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| Publication number | Publication date |
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