CN111504967A - 一种测定植物细胞保存再生率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速、高效测定植物细胞超低温保存后再生率的方法，涉及细胞存活率检测技术领域，所述方法可以快速的判断超低温保存方案的优劣，确定最佳的处理时间及强度；在本发明中，可以通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光的检测，从而有效扩展激光共聚焦扫描显微镜的功能，同时也为设计植物超低温保存方案提供理论支持，对发展新一代的超低温保存技术具有重要的意义。在本发明实施例中，对比激光共聚焦扫描显微镜检测的死细胞和活细胞的比例与胚性细胞的超低温再生率相吻合，因此可利用激光共聚焦扫描显微镜检测死细胞和活细胞的比例，以此提前确定最佳的超低温保存方案。

Description

一种测定植物细胞保存再生率的方法
技术领域
本发明属于细胞存活率检测技术领域，具体涉及一种测定植物细胞保存再生率的方法。
背景技术
超低温保存一般是指使用液氮(-196℃)或液氮蒸汽保存生物材料的技术和方法。在液氮温度下，细胞中所有的生化反应都被暂时停止，从而可以使细胞在理论上进行无限期保存。超低温保存技术广泛应用于微生物、动物和植物种质资源的长期保存。植物的超低温保存技术相比于其他现有的原地建立保护区保存、迁地保存，具有永久保存性，不受自然环境变化的影响，保存效率高，方便管理。植物的超低温保存技术相比于现有的组织培养保存，遗传稳定性高，保存效率高，快速简便，再生后可以快速进行增殖和分化，分化的体细胞胚直接发育成植株，且转化率高，无需进行生根培养。但是该方法操作流程复杂，且超低温保存后植物需2周以上时间恢复培养才能判断超低温保存方法是否成功，因此不能及时对超低温方案进行优化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速测定植物细胞保存再生率的方法，应用激光共聚焦扫描显微镜来检测超低温保存后细胞中死细胞和活细胞的比例判定经保存后细胞的再生率，同时还可以确定最佳的保存方案。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种快速、高效测定植物细胞保存再生率的方法，包括以下步骤：利用荧光染料与经过保存后的细胞结合，测定荧光强度，根据荧光的颜色和强度判断所述经过保存后的细胞的再生率；所述荧光染料包括荧光素双醋酸酯或荧光素双醋酸酯与碘化丙啶的混合物。
优选的，所述植物细胞保存的方法包括超低温保存。
优选的，所述超低温保存的方法，包括以下步骤：(1)将植物胚性愈伤组织与装载溶液混合进行加载处理，得加载愈伤组织；所述装载溶液由WPM基础培养基、184g/L甘油和136.8g/L蔗糖组成；
(2)将所述加载愈伤组织与玻璃化溶液2溶液混合进行玻璃化处理，得玻璃化愈伤组织；所述玻璃化溶液2溶液由WPM基础培养基、300g/L甘油、150g/L乙二醇、150g/L二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖组成；
(3)将所述玻璃化愈伤组织置于液氮中保存。
优选的，步骤(1)所述植物胚性愈伤组织的制备方法，包括将植物种子在诱导培养基中诱导培养2周；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括以下组分：2,4D 1mg/L、聚乙烯吡咯烷酮1g/L、干酪素1g/L、活性炭1g/L、质量体积百分比为3％的蔗糖和质量体积百分比为0.3％的琼脂。
优选的，所述诱导培养为暗培养，所述诱导培养的温度为25℃。
优选的，步骤(1)所述混合时，所述植物胚性愈伤组织与装载溶液的体积比为1:8。
优选的，步骤(2)所述混合前，还包括吸弃装载溶液；步骤(2)所述混合时，所述加载愈伤组织与玻璃化溶液2溶液的体积比为1:8。
优选的，步骤(2)所述玻璃化处理为在冰上进行，所述玻璃化处理的时间为30min。
优选的，所述荧光素双醋酸酯经与活细胞结合后，在波长为488nm的光下激发绿色荧光。
优选的，所述碘化丙啶经与死细胞结合后，在波长为545nm的光下激发红色荧光。
本发明的有益效果：本发明所述方法可以快速的判断超低温保存方案的优劣，确定最佳的处理时间及强度；在本发明中，可以通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光的检测，从而有效扩展激光共聚焦扫描显微镜的功能，同时也为设计植物超低温保存方案提供理论支持，对发展新一代的超低温保存技术具有重要的意义。在本发明实施例中，对比激光共聚焦扫描显微镜检测的死细胞和活细胞的比例与胚性细胞的超低温保存后细胞再生能力相吻合，因此应用激光共聚焦扫描显微镜来检测植物细胞超低温保存后死细胞和活细胞的比例来提前确定细胞活力，进而快速确定超低温保存方案的成败；另外，应用激光共聚焦扫描显微镜来检测植物细胞超低温保存后的细胞活力来快速确定加载处理/玻璃化处理的最佳时间，进而确定最佳的超低温保存方案。
附图说明
图1为超低温保存后恢复培养阶段细胞活力变化图；
图2为超低温保存后恢复培养阶段细胞活力统计图；
图3为玻璃化处理时间对细胞活性的变化图；
图4为玻璃化处理时间对细胞活力统计图；
图5为玻璃化处理时间对植物再生率的影响；
图6为玻璃化处理时间对植物胚性细胞超低温保存后生物量的增长能力的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种测定植物细胞保存再生率的方法，包括以下步骤：利用荧光染料与经过保存后的细胞结合，测定荧光强度，根据荧光的颜色和强度判断所述经过保存后的细胞的再生率；所述荧光染料包括荧光素双醋酸酯或荧光素双醋酸酯与碘化丙啶的混合物。
本发明所述荧光素双醋酸酯(FDA)可以与活细胞结合，在488nm被激发发出绿色荧光，而且荧光越强说明细胞活力越强。本发明所述碘化丙啶(PI)可以与死细胞结合，在545nm下被激发，发出红色荧光，且荧光越强说明细胞活力越弱。在本发明中，荧光可通过激光共聚焦扫描显微镜检测。在本发明中所述荧光素双醋酸酯(FDA)的工作浓度优选为10μg/mL；所述碘化丙啶(PI)的工作浓度优选为10μg/mL。本发明对所述荧光素双醋酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明将所述荧光染料与经过保存后的细胞结合，所述荧光染料的配制方法优选包括称取10mg染料粉末溶于1mL二甲基亚砜中，充分溶解，用滤纸包裹以避光，得染料母液，待使用时进行相应倍数的稀释即可。
本发明对所述植物细胞保存的方法并没有特殊限定，优选包括超低温保存。在本发明中，所述超低温保存的方法，优选包括以下步骤：(1)将植物胚性愈伤组织与装载溶液(loading solution)混合进行加载处理，得加载愈伤组织；所述loading solution由WPM基础培养基、184g/L甘油和136.8g/L蔗糖组成；
(2)将所述加载愈伤组织与玻璃化溶液2溶液(PVS2 solution)混合进行玻璃化处理，得玻璃化愈伤组织；所述PVS2 solution由WPM基础培养基、300g/L甘油、150g/L乙二醇、150g/L二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖组成；
(3)将所述玻璃化愈伤组织置于液氮中保存。
在本发明中，步骤(1)所述植物胚性愈伤组织的制备方法，优选包括将植物种子的合子胚在诱导培养基中诱导培养2周；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括以下组分：2,4D 1mg/L、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1g/L、干酪素(ch)1g/L、活性炭(AC)1g/L、质量体积百分比为3％的蔗糖(SUC)和质量体积百分比为0.3％的琼脂。本发明对所述植物种子的合子胚的来源并没有特殊限定，优选以成熟种子的合子胚为材料进行愈伤组织的诱导。本发明所述诱导培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为25℃。本发明对所述诱导培养基的制备方法并没有特殊限定，将所述组分混合后，121℃下灭菌，调节pH为5.8即可。
本发明进行所述混合时，优选的还包括量取定量的所述胚性愈伤组织，以0.25mL为例，优选的在灭菌1.5mL离心管中，加入1mLWPM液体培养基，量取体积为0.25mL的植物胚性愈伤组织。
本发明所述混合时，所述植物胚性愈伤组织与loading solution的体积比优选为1:8。本发明在所述混合后进行加载处理，所述加载处理的温度优选为0℃；所述加载处理的时间优选为20min。
本发明在步骤(2)所述混合前，优选还包括吸弃loading solution。本发明所述混合时，所述加载愈伤组织与PVS2 solution的体积比优选为1:8。本发明所述玻璃化处理为在冰上进行，所述玻璃化处理的时间优选为30min。本发明步骤(1)和步骤(2)中所述WPM基础培养基的组成优选如表1所示：
表1 WPM基础培养基构成
Figure BDA0002465752780000041
Figure BDA0002465752780000051
本发明在步骤(3)所述保存时，优选的将所述玻璃化愈伤组织和PVS2solution的混合液置于冻存管中，并固定在冻存管支架上，放入液氮罐保存。
在本发明中，所述方法还可以通过活细胞的荧光值来确定超低温保存后植物胚性愈伤组织成活率测定的最准确时间点，以及通过检测死细胞和活细胞的比例来确定最佳玻璃化溶液处理时间。
下面结合实施例对本发明提供的测定植物细胞保存再生率的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、厚朴胚性细胞系的超低温保存过程：
通过厚朴成熟种子合子胚诱导出的厚朴胚性愈伤组织；在超净工作台内，在灭过菌的1.5ml离心管中，加入1ml WPM(含3％蔗糖，pH 5.8)液体培养基，此时刻度与1ml凹液面最低处相平。用镊子挑生长状态良好的厚朴胚性愈伤组织，转到1.5ml离心管中，直到凹液面最低处与刻度1.25ml刻度相平，量取体积为0.25ml的厚朴胚性愈伤组织；经加载处理、玻璃化处理、超低温保存、40℃水浴解冻、卸载处理、清洗及恢复培养。
2、通过应用激光共聚焦扫描显微镜来检测活细胞的荧光值来确定超低温保存后厚朴胚性愈伤组织成活率测定的最准确时间点。
FDA可以与活细胞结合，在488nm被激发发出绿色荧光，而且荧光越强说明细胞活力越强。分别用FDA(10μg/mL)来标记活细胞，应用激光共聚焦显微镜对厚朴胚性愈伤组织恢复时间0小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天荧光变化进行观察，结果如图1和图2所示，在恢复培养过程中细胞活力先下降，48小时细胞活力最低，随后开始增加，6天的时候活力值，已接近对照，因此48小时为厚朴胚性愈伤组织成活率测定最准确时间点。
实施例2
通过激光共聚焦扫描显微镜来检测厚朴胚性细胞死细胞和活细胞的比例来确定最佳玻璃化溶液(PVS2)处理时间。
FDA可以与活细胞结合，在488nm被激发发出绿色荧光，而且荧光越强说明细胞活力越强。碘化丙啶(PI)可以与死细胞结合，在545nm下被激发，发出红色荧光。应用这两种荧光染料的特性，分别用FDA(10μg/mL)来标记活细胞，用PI(10μg/mL)来标记死细胞。
同时量取体积为0.25ml的厚朴胚性愈伤组织2批，同时进行如下操作：经加载处理、玻璃化处理时间0分钟，5分钟、10分钟，30分钟，50分钟，70分钟，90分钟时间梯度下、超低温保存、40℃水浴解冻、卸载处理、清洗及恢复培养。其中一批在恢复培养48小时后来应用激光共聚焦扫描显微镜来检测FDA和PI的荧光强度。结果如图3和图4所示，恢复48小时，PVS2玻璃化溶液处理30分钟获得最高的绿色荧光强度，即活力最高。另一批细胞继续培养14天后统计超低温胚性愈伤组织的再生率。再生率即每个处理中有细胞重新生长形成克隆为标准，发现在PVS2处理10分钟，30分钟，50分钟，70分钟，90分钟时间梯度下，厚朴胚性细胞系的再生率均达到100％(图5，视野中只有绿色荧光)。但是进一步研究分析了厚朴胚性细胞超低温保存后的生长趋势，在恢复培养阶段生物量增加的越多说明细胞的增殖能力越强。结果表明，厚朴胚性细胞在PVS2 solution处理30min后经超低温保存保持了最强的增殖能力(图6)。这与激光共聚焦扫描显微镜观测的细胞活力的结果一致，确定了PVS2处理30分钟为厚朴胚性愈伤组织最佳玻璃化处理时间。超低温保存后细胞的增殖能力，这是评价超低温保存方案的技术关键。超低温保存后细胞的增殖能力越强，说明超低温保存方案越优。因此应用激光共聚焦显微镜来快速判断细胞超低温保存后细胞增殖能力是可靠的，此方法也可有效的指导超低温保存方案的改进。
所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速、高效测定植物细胞超低温保存后再生率的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用荧光染料与经过保存后的细胞结合，测定荧光强度，根据荧光的颜色和强度判断所述经过保存后的细胞的再生率；所述荧光染料包括荧光素双醋酸酯或荧光素双醋酸酯与碘化丙啶的混合物。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述植物细胞保存的方法包括超低温保存。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述超低温保存的方法，包括以下步骤：(1)将植物胚性愈伤组织与装载溶液混合进行加载处理，得加载愈伤组织；所述装载溶液由WPM基础培养基、184g/L甘油和136.8g/L蔗糖组成；
(2)将所述加载愈伤组织与玻璃化溶液2溶液混合进行玻璃化处理，得玻璃化愈伤组织；所述玻璃化溶液2溶液由WPM基础培养基、300g/L甘油、150g/L乙二醇、150g/L二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖组成；
(3)将所述玻璃化愈伤组织置于液氮中保存。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述植物胚性愈伤组织的制备方法，包括将植物种子在诱导培养基中诱导培养2周；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括以下组分：2,4D 1mg/L、聚乙烯吡咯烷酮1g/L、干酪素1g/L、活性炭1g/L、质量体积百分比为3％的蔗糖和质量体积百分比为0.3％的琼脂。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述诱导培养为暗培养，所述诱导培养的温度为25℃。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述混合时，所述植物胚性愈伤组织与装载溶液的体积比为1:8。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)所述混合前，还包括吸弃装载溶液；步骤(2)所述混合时，所述加载愈伤组织与玻璃化溶液2溶液的体积比为1:8。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)所述玻璃化处理为在冰上进行，所述玻璃化处理的时间为30min。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光素双醋酸酯经与活细胞结合后，在波长为488nm的光下激发绿色荧光。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述碘化丙啶经与死细胞结合后，在波长为545nm的光下激发红色荧光。
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