CN107183006A

CN107183006A - 美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻保存方法

Info

Publication number: CN107183006A
Application number: CN201710376820.4A
Authority: CN
Inventors: 徐红艳; 朱新平; 吴栩灵
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-09-22

Abstract

本发明公开了一种美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：（1）对雄性美洲鲥进行酒精杀菌处理，然后取出精巢组织，用磷酸盐缓冲液冲洗并浸泡精巢组织，装入试管，冷藏；（2）弃去所述试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液中剪碎精巢组织，转移到冷冻保存液后分装于冻存管中，于程序降温盒中降温至‑80℃，1‑2天后转移到液氮中冷冻保存。该方法步骤少、操作简便、重复性强，能获得高成活率的美洲鲥早期生殖细胞至成熟精子等各期雄性生殖细胞，对物种资源保护，包括对野生资源保护具有非常重要的实践应用意义及价值。

Description

美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及生殖细胞的冷冻保存方法，尤其是涉及美洲鲥雄性生殖细胞的冷冻保存方法。

背景技术

鱼类生殖细胞不同于其他体组织细胞，其携带了生物体的遗传信息并能传递到子代，特别是生殖细胞中的原始生殖细胞和精原干细胞都具有一定的细胞全能性，既能通过细胞培养或种间细胞移植技术进行体内外细胞的增殖，也可进一步分化而产生配子，产生后代。因此，生殖细胞的冷冻保存，一方面是通过细胞工程技术进行生物种质改良的细胞基础，另一方面是水产优良或珍稀种质资源保护的最直接有效的方法。国内外关于鱼类精子保存的研究技术已经日趋完善，已分别建立了鲤科鱼类、鲑科鱼类、斑马鱼、罗非鱼、鲷科鱼类及鲻鱼等淡、海水鱼类的精子冷冻保存技术，并建立了某些淡、海水经济鱼类的冷冻精子库。同时，也有研究进行了鱼类雄性早期生殖细胞的冷冻保存，譬如有学者进行了斑马鱼、虹鳟、西伯利亚鲟、细鳞鲑等鱼类生殖细胞的冻存进行了相关研究。也有学者对各种鲟鱼的精巢细胞和草鱼性腺细胞（CO）进行冷冻保存。目前，最常见的细胞冻存方法都是将分离或培养的游离细胞进行冻存，复苏后再直接用于其它实验；此外精子冷冻保存一般是直接用冷冻剂稀释精液随后冻存。而本方法将性腺组织块直接进行冷冻保存，在解冻复苏后进行细胞分离，能得到各时期的生殖细胞，包括精原干细胞、精母细胞、精子细胞及成熟精子。但是，目前的冷冻保存技术对生殖细胞的发育期有很强的针对性，用于冻存早期生殖细胞和精子的冷冻剂、冷冻方法均有较大差异，而且因为冷冻剂成份复杂，程序繁琐，生殖细胞的存活率受多种因素的影响，包括实验人员的技术经验及统计方法的灵敏性等，导致早期生殖细胞和精子冷冻保存的细胞存活率都比较低而且重复性较差。总之，迄今为止，还没有能同时进行早期生殖细胞和精子的长期冷冻保存的技术方法。现有的研究报道表明，成熟精子的保存和早期精母细胞的保存方法差异极大。然而，物种种质资源的保护研究中，特别是野生资源的采集过程中，获得的样品非常随机，性成熟或性未成熟个体是无法人为选择的，如果能研发一种操作步骤简单且能同时保存精原干细胞和精子的冷冻保存技术，将对物种的资源保护更具实践意义。

美洲鲥是典型的溯河产卵洄游性鱼类，其采取一年一次产卵一次繁殖或一年多次产卵繁殖等多种生殖繁育策略。同时由于美洲鲥的洄游性及溯河产卵的特性，其人工繁殖，特别是高质量受精卵的获得特别难，仍是鲥鱼规模化养殖的瓶颈，也是鲥鱼野生资源保护研究的关键制约因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存方法，该方法步骤少、操作简便、重复性强，能获得高成活率的美洲鲥早期生殖细胞至成熟精子等各期雄性生殖细胞，对物种资源保护，包括对野生资源保护具有非常重要的实践应用意义及价值。

本发明的上述目的是通过以下技术步骤来实现的：一种美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，包括以下步骤：

（1）对雄性美洲鲥进行酒精杀菌处理，然后取出精巢组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并浸泡精巢组织，装入试管，冷藏；

（2）弃去所述试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液（PBS）中剪碎精巢组织，转移到冷冻保存液后分装到冻存管中，于程序降温盒中降温至-80℃，1-2天后转移到液氮中冷冻保存。

所述步骤（1）中雄性美洲鲥为性成熟或性未成熟的个体。

所述步骤（1）中酒精灭菌处理时优选采用体积百分比含量为60~90%的酒精，更佳为70%。

所述步骤（2）中100mL冷冻保存液成份：5~10mL 二甲基亚砜（DimethylSulphoxide， DMSO），胎牛血清30~50mL，高糖DMEM （基础培养基）1.3~1.4g，pH值缓冲剂Hepes 0.4~0.5g。

进一步地，本发明包括步骤(3)冷存后复苏步骤，即从液氮中取出样品冻存管并迅速转移到水浴锅中解冻，离心弃去冻存液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。所述解冻温度30~40℃，优选为37℃。

进一步地，本发明还包括步骤(4)细胞存活率及活力检测：将复苏后精巢组织用胶原酶I 28 ℃水浴消化18-25 min，加入胰酶继续消化18-25 min，使其分离成单个细胞，加入1/10体积牛血清终止消化反应，用细胞筛过滤并收集细胞，采用Hoechst33342和2 µg/mL PI双染后在荧光显微镜下观察并统计细胞存活率，并结合细胞移植技术对冷冻复苏组织细胞，特别是针对精原干细胞等早期雄性生殖细胞，进行活力检测。

所述胶原酶的浓度优选为0.5~2 mg/mL，更佳为1 mg/mL，所述胶原酶优选购自Worthington公司。所述胰酶的质量百分比含量优选为0.01~0.5%，更佳为0.25%，所述胰酶优选购自Worthington公司。

本发明具有如下的优点：

（1）本发明对美洲鲥个体性成熟度没有特别要求，而且在不做细胞分离尽量减少细胞损伤及精子仍在精巢组织或精小管中保持细胞原有微环境的前提下，对美洲鲥雄性生殖细胞进行冷冻保存，能同时保存精原干细胞至成熟精子的各期雄性生殖细胞。

（2）本发明进行的美洲鲥雄性生殖细胞冷冻方法，不同于传统方法只对单一游离细胞进行冻存，采用组织块直接冻存所有精巢细胞，步骤新颖、操作简单、重复性强，能高效保存美洲鲥分化各期的雄性生殖细胞，解冻复苏后所得生殖细胞中，精原干细胞的存活率达到50%以上，精子的存活率达93%以上，远高于已报道的传统冻存方法获得的结果。

（3）对今后进行美洲鲥及其它洄游性鱼类的生殖细胞培养及应用研究提供了理论基础，为将来进行鱼类种质资源保护研究提供技术基础。

附图说明

图1是本发明中美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻、复苏流程；

图2是本发明美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻、复苏细胞观察图A-B：对比例，图C-D：实施例1，图E-F：实施例2，图G-H：实施例3；图A、C、E、G为Hoechst 33342染色，图B、D、F、H为PI染色，比例尺：20µm；

图3是本发明美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻、复苏细胞移植观察 (亮白色为荧光信号)。

具体实施方式

下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。

对比例1

（1）选取雄性美洲鲥鱼性成熟个体1尾，用75%的酒精灭菌，然后解剖并取出精巢组织。精巢组织用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗并浸泡在干净的磷酸盐缓冲液（PBS），装入试管，置于冰盒冷藏待处理。

（2）弃试管的磷酸盐缓冲液，将所取精巢组织剪碎后，用1 mg/mL胶原酶 I，28 ℃水浴消化~20 min，加0.25 % 胰酶继续消化约20 min。加入1/10体积牛血清终止消化后，在细胞筛过滤并收集细胞，用冷冻保存液重悬后冻存管分装，于程序降温盒中慢速降温至-80℃保存1~2天，然后将样品转移到液氮中长期保存。冷冻保存液成分为：100mL冷冻保存液中含有10 mL 二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）、胎牛血清35 mL、高糖DMEM （基础培养基）1.37g、pH值缓冲剂Hepes 0.47g。

（3）组织冻存200-300天后，取出在37℃复苏，染色（图2）并统计细胞存活率，结果见表1。

实施例1

（1）选取雄性美洲鲥个体1尾，用75%的酒精灭菌，然后解剖并取出精巢组织。精巢组织用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后迅速装入试管并浸泡在干净的磷酸盐缓冲液（PBS），置于冰盒冷藏待处理。

（2）冻存：弃试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液（PBS）中剪碎精巢组织至1mm³左右，然后用配制好的冷冻保存液浸泡精巢组织，分装于冻存管中，于程序降温盒中慢速降温至-80℃，1-2天后转移到液氮中冷冻保存。冷冻保存液成分为：100mL冷冻保存液中含有10 mL 二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）、胎牛血清35 mL、高糖DMEM（基础培养基）1.37g、pH值缓冲剂Hepes 0.47g。

（3）复苏：冻存200-300天后，从液氮中取出存有精巢组织样品的冻存管并迅速转移到水浴锅中在37℃解冻，离心弃去冷冻保存液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。

（4）酶消化分离细胞：将鲥鱼精巢组织用1 mg/mL胶原酶 I，28 ℃水浴消化约20min，加0.25 % 胰酶继续消化约20 min，使其分离成单个细胞，采用Hoechst33342和2 µg/mL PI双染后在荧光显微镜下观察形态并统计细胞存活率(结果见表1)，并结合细胞移植技术对冷冻复苏组织细胞，特别是针对精原干细胞等早期雄性生殖细胞，进行活力检测，结果见图3。

取出经过长时间冷冻保存的精巢组织，进行快速复苏、胶原酶\胰酶消化成单个的细胞后进行荧光染色观察及存活率统计（图2）；相对现有技术，本实施例冻存复苏的组织细胞各期细胞的存活率都比较高（表1）并且能够通过种间细胞移植在受体中存活，且能整合到受体性腺中发育分化（图3）。本实施例中的美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，重复性强且能获得高存活率的美洲鲥鱼各期雄性生殖细胞。

实施例2

（1）选取雄性美洲鲥鱼性成熟个体1尾，用80%的酒精灭菌，然后解剖并取出精巢组织。精巢组织用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后迅速装入试管并并浸泡在干净的磷酸盐缓冲液（PBS），置于冰盒冷藏待处理。

（2）冻存：弃试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液（PBS）中剪碎精巢组织至1mm³左右，然后用配制好的冷冻保存液浸泡精巢组织，分装于冻存管中，于程序降温盒中慢速降温至-80℃，1-2天后转移到液氮中冷冻保存。冷冻保存液成分为： 100mL冷冻保存液中含有 5mL 二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）、胎牛血清30 mL、高糖DMEM （基础培养基）1.37g、pH值缓冲剂Hepes 0.47g。

（3）复苏：冻存200-300天后，从液氮中取出存有精巢组织样品的冻存管并迅速转移到水浴锅中在37℃解冻，离心弃去冻存液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。

（4）酶消化分离细胞：将鲥鱼精巢组织用1 mg/mL胶原酶 I，28 ℃水浴消化约25min，加0.25 % 胰酶继续消化约25 min，使其分离成单个细胞，采用Hoechst33342和2 µg/mL PI双染后在荧光显微镜下观察形态并统计细胞存活率(结果见表1)，并结合细胞移植技术对冷冻复苏组织细胞，特别是针对精原干细胞等早期雄性生殖细胞，进行活力检测，结果见图3。

取出过长时间冷冻保存的精巢组织，进行快速复苏、胶原酶\胰酶消化成单个的细胞后进行荧光染色观察及存活率统计（图2）；相对现有技术，本实施例冻存复苏的组织细胞各期细胞的存活率都比较高（表1）并且能够通过种间细胞移植在受体中存活，且能整合到受体性腺中发育分化，移植细胞在受体分布情况同实施例1。本实施例中的美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，重复性强且能获得高存活率的美洲鲥鱼各期雄性生殖细胞。

实施例3

（1）选取雄性美洲鲥鱼性成熟个体1尾，用80%的酒精灭菌，然后解剖并取出精巢组织。精巢组织用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，然后迅速装入试管并浸泡在干净的磷酸盐缓冲液（PBS），置于冰盒冷藏待处理或运回实验室。

（2）冻存：弃试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液（PBS）中剪碎精巢组织至1mm³左右，然后用配制好的冷冻保存液浸泡精巢组织，分装于冻存管中，于程序降温盒中慢速降温至-80℃，1-2天后转移到液氮中冷冻保存。冷冻保存液成分为：100mL冷冻保存液中含有 5mL 二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）、胎牛血清30 mL、高糖DMEM （基础培养基）1.37g、pH值缓冲剂Hepes 0.47g。

（4）酶消化分离细胞：将鲥鱼精巢组织用1 mg/mL胶原酶 I，28 ℃水浴消化约15min，加0.25 % 胰酶继续消化约15 min，使其分离成单个细胞，采用Hoechst33342和2 µg/mL PI双染后在荧光显微镜下观察形态并统计细胞存活率(结果见表1)，并结合细胞移植技术对冷冻复苏组织细胞，特别是针对精原干细胞等早期雄性生殖细胞，进行活力检测，结果见图3。

取出经过长时间冷冻保存的精巢组织，进行快速复苏、胶原酶\胰酶消化成单个的细胞后进行荧光染色观察及存活率统计（图2）；相对已有报道，本实施例冻存复苏的组织细胞各期细胞的存活率都比较高（表1）并且能够通过种间细胞移植在受体中存活，且能整合到受体性腺中发育分化，移植细胞在受体分布情况同实施例1。本实施例中的美洲鲥鱼雄性生殖细胞的冷冻保存方法，重复性强且能获得高存活率的美洲鲥鱼各期雄性生殖细胞。

表1结果所示，美洲鲥生殖细胞冻存复苏后，精原干细胞、精母细胞、精细胞及其它、精子的存活率相比较，实施例1-3所得结果均高于对比例结果，即本发明的组织块冻存法所得细胞存活率高于传统的细胞冻存法所得细胞存活率。因此本发明中的美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，能获得高存活率的美洲鲥鱼各期雄性生殖细胞。

Claims

1.一种美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）对雄性美洲鲥进行酒精杀菌处理，然后取出精巢组织，用磷酸盐缓冲液冲洗并浸泡精巢组织，装入试管，冷藏；

（2）弃去所述试管的磷酸盐缓冲液，在干净的磷酸盐缓冲液中剪碎精巢组织，转移到冷冻保存液后分装于冻存管中，于程序降温盒中降温至-80℃，1-2天后转移到液氮中冷冻保存。

2.根据权利要求1所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，所述步骤（1）中雄性美洲鲥为性成熟或性未成熟的个体。

3.根据权利要求1所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，所述步骤（1）中酒精灭菌处理时采用体积百分比含量为60~90%的酒精。

4.根据权利要求1所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，所述步骤（2）中冷冻保存液成份：每100mL中含有 5~10mL 二甲基亚砜，胎牛血清30~50mL，高糖DMEM 1.3~1.4g，pH值缓冲剂Hepes 0.4~0.5g。

5.根据权利要求1所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，还包括步骤(3)冷存后复苏步骤，即从液氮中取出样品冻存管并迅速转移到水浴锅中解冻，离心弃去冷冻保存液，用磷酸盐缓冲液清洗。

6.根据权利要求5所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，所述解冻温度30~40℃。

7.根据权利要求5所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，还包括步骤(4)细胞存活率及活力检测：将复苏后精巢组织用胶原酶I 28 ℃水浴消化18-25 min，加入胰酶继续消化18-25 min，使其分离成单个细胞，加入1/10体积牛血清终止消化反应，用细胞筛过滤并收集细胞，采用Hoechst33342和2 µg/mL PI双染后在荧光显微镜下观察并统计细胞存活率，并结合细胞移植技术对冷冻复苏组织细胞进行活力检测。

8.根据权利要求7所述美洲鲥鱼雄性生殖细胞冷冻保存方法，其特征是，所述胶原酶I的浓度为0.5~2 mg/mL；所述胰酶的质量百分比含量为0.01~0.5%。