KR20210113649A - 생물학적 재료의 동결 보존용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 극성 비양자성 용매, 1가 또는 다가 알코올, 비분지형 다당류, 분지형 다당류 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물을 개시한다. 또한, 생물학적 재료의 동결보존을 위한 상기 액체 조성물의 용도 및 상기 액체 조성물을 사용하여 생물학적 재료를 보존하기 위한 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물, 이러한 조성물을 사용하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인간 세포, 생식세포 및 배아의 동결보존에 유용하다.
동결보존은 경제적으로, 치료적 또는 과학적으로 중요한 세포, 배아 또는 생식세포의 유전학(genetics)을 무한히 보존하기 위한 가장 강력한 및 효율적인 공구이다. 이는 인간 보조 재생 기술(human assisted reproduction technologies, ART)에 대해 적용된다. 물은 세포의 주요 성분이기 때문에, 그 고형화는 냉각 및 후속 가온 동안 얼음 결정의 세포내 형성을 피하도록 긴밀하게 제어되어야 한다. 이는 세포의 해로운 변경 및 사망으로 끝나는 모든 막 시스템 및 세포 소기관에 대해 파괴적인 효과를 가질 것이다.
두 가지 주요 방법이 살아있는 생물학적 재료를 동결보존하는데 현재 사용되고 있다: 느린 동결(SLF) 및 유리화(VIT). 세포 내 얼음 결정 형성(Rail and Fahy 1985)의 가능성을 감소시키기 위해 SLF에 대한 대안으로서 VIT 방법이 도입되었다.
VIT는 특히 중기 II(MII)(Kuwayama et al.2015) 난모세포 및 다양한 발달단계의 배아(rizi et al.2017;Vanderzwalmen et al.2012)를 동결보존하는데서, 인간 ART에서 SLF보다 더 효율적인 것으로 입증되었고, 현재까지 동결보존을 위한 표준으로 인정된다.
이는 동물 및 특히 쥐의 태아에서도 마찬가지이고, 여기서 VIT는 염색질 온전성 및 생체 에너지 상태를 더 잘 보존하여(Somoskoi et al 2015), 동결보호제들(Cps)의 더 낮은 세포내 진입을 유도하고(Vanderzwalmen et al.2013), 궁극적으로 SLF(Zander-Fox et al 2013)보다 더 나은 배아 생존 및 발달을 산출하였다.
그럼에도 불구하고, 현재의 VIT 프로토콜은 방법적 복잡성, 다수의 프로토콜 및 종종 인간 또는 동물 유체로부터 유래하는 화학적으로 미정의된 성분의 빈번한 사용을 겪는다. 그 결과, 상기 성분들의 안정성, 생물학적 안전성, 재현성 및 표준화가 손상된다.
이의 관점에서, 높은 효능, 생물학적 안전성 및 재현성을 갖는 유리화- 및 또한 느린 동결-세포를 위한 추가의 및/또는 개선된 조성물이 필요하다
본 발명자들은 생물학적 재료의 동결보존을 위한 독특한 화학적으로 한정된 액체 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 시약의 특정 조합이 동결보존에 사용하기 위한 최적의 특성을 초래하는 이들 시약의 상승효과를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 조성물의 사용은 공지된 동결보존 용액보다 더 나은 생존 및 부화 속도를 보장한다.
이러한 액체 조성물은 다양한 유형의 동결보존 절차(예를 들어, 느린 동결, 1-단계 유리화, 다-단계 유리화)에 의해, 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 생물학적 재료의 효율적이고, 생물학적으로 안전하고 재현 가능한 동결보존(예를 들어, 유리화)을 허용한다.
따라서, 제1 양태는 극성 비양성자성 용매, 1가 또는 다가 알코올 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물을 제공한다. 특정 실시예로, 상기 조성물은 하기를 포함한다:
-디메틸술폭사이드(DMSO) 및 디메틸포름아미드(DMF)로부터 선택된 극성 비양자성 용매
-에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에리스리톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 볼레미톨, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 및 펜탄올로부터 선택된 1가 또는 다가 알코올;
-수크로스, 트레할로스, 락툴로스, 멜리비오스, 락토비오네이트(lactobionate), 라피노스 및 셀룰로오스, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 비분지된 다당류;
-덱스트란, 펙틴, 피콜 및 전분, 바람직하게는 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 분지된 다당류; 및
-폴리비닐 알코올.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 DMSO, 에틸렌글리콜, 수크로스, 덱스트란 및 폴리비닐 알코올을 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 실질적으로 동일한 양의 DMSO 및 에틸렌글리콜, 및 덱스트란의 적어도 8배인 수크로스의 농도를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 하기를 포함한다:
- 적어도 0.8%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 적어도 0.8%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 적어도 0.5%(w/v)의 비분지된 다당류;
- 적어도 0.037%(w/v)의 분지된 다당류;
- 적어도 0.015%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및
- 바람직하게는 pH 7.2-7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제.
바람직한 구체 예에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 하기를 포함한다:
- 적어도 0.8%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 적어도 0.8%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 적어도 0.5%(w/v)의 비분지된 다당류;-
-적어도 0.037%(w/v)의 덱스트란;
-적어도 0.015%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및
- 바람직하게는 pH 7.2-7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 하기를 포함한다:
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 9.0 내지 31.0%(w/v), 바람직하게는 22.7%(w/v)의 비분지된 다당류;
- 0.60-22.0%(w/v), 바람직하게는 2.64%(w/v)의 분지된 다당류;
- 0.30 내지 4.0%(w/v), 바람직하게는 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및/또는
- 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제,
또는 상기 희석제 중의 상기 액체 조성물의 희석을 포함한다.
바람직한 구체 예에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 하기를 포함한다:
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 9.0 내지 31.0%(w/v), 바람직하게는 22.7%(w/v)의 비분지된 다당류;
- 0.60-22.0%(w/v), 바람직하게는 2.64%(w/v)의 덱스트란;
- 0.30 내지 4.0%(w/v), 바람직하게는 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및/또는
- 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제,
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 적어도 15%(v/v)의 극성 비양성자성 용매, 15%(v/v) 이상의 1가 또는 다가 알코올, 15%(w/v) 이상의 비분지형 다당류, 2%(w/v) 이상의 분지형 다당류 및 약 0.9%(w/v) 폴리비닐 알코올을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 적어도 15%(v/v)의 극성 비양성자성 용매, 15%(v/v) 이상의 1가 또는 다가 알코올, 15%(w/v) 이상의 비분지형 다당류, 2%(w/v) 이상의 덱스트란 및 약 0.9%(w/v) 폴리비닐 알코올을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 희석제는 평형 염 용액, 바람직하게는 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
특정 실시양태에서, 덱스트란은 덱스트란 1, 덱스트란 40 및 덱스트란 70 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물은 하기를 포함한다:
-17.7%(v/v) DMSO,
-17.7%(v/v) 에틸렌글리콜,
-22.7%(w/v) 수크로스,
-0.88%(w/v) 덱스트란 1(Dl)
-0.88%(w/v) 덱스트란 40(D40)
-0.88%(w/v) 덱스트란 70(D70); 및
-0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하지 않는다.
또 다른 양태는 생물학적 재료의 동결보존을 위해 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존은 동결 절차, 다-단계 유리화 절차 또는 1-단계 유리화 절차에 의해 수행된다.
또 다른 양상은 생물학적 재료를 보존하기 위한 하기 단계의 방법을 제공한다:
-생물학적 재료를 제공하는 단계;
-본 명세서에 교시된 바와 같이, 생물학적 재료를 액체 조성물과 접촉시키는 단계;
-본 명세서에 교시된 바와 같이 액체 조성물에서 생물학적 재료를 냉각 및/또는 가열하는 단계.
특정 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 재료를 상기 조성물과 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물의 적어도 하나의 희석과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 냉각은 생물학적 재료의 동결 또는 생물학적 재료의 유리화를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료의 1단계 또는 다단계 유리화를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 줄기세포, 생식세포 및 배아의 군으로부터 선택된다.
도 1은 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물(본 명세서에서 동결보존 용액(CDCS)로 지칭됨)을 사용하여 1-단계 유리화 후에 말 사체로부터 분리된 중간엽 줄기세포(EC-MSC)의 생존능 및 포화도(confluency)를 나타낸다. 도 1a: 트립판 블루 배제 분석에 의해 측정된 가온 후(유리화된 샘플: 평균 = 87.9%) 또는 계대 후(유리화되지 않은 샘플: 평균 94.5%) 24시간에 EC-MSC의 세포 생존율. 데이터는 5 개의 독립적인 실험으로부터 15 및 20 샘플(각각 비유리화 및 유리화)의 평균 + 표준 편차(SD)를 나타낸다.(Mann-Whitney test:P < 0.001); 도 1b 내지 1f: 5개의 독립적인 실험에서 유리화된 샘플과 유리화되지 않은 샘플 사이에서 생존 세포의 수와 증식 능력을 반영하는 EC-MSC 밀집의 비교. 데이터 포인트는 평균±SD를 나타내고; 각 그룹 내의 샘플의 수는 대괄호 사이에 표시된다.
도 2는 3일 배양 후 유리화 및 비유리화 EC-MSC의 형태를 나타낸다. 좌측: 비-유리화 대조군; 우측: 1-단계 방법에 따라 본 명세서에 교시된 바와 같은 CDCS 조성물을 사용하는 유리화된 EC-MSC. 축적 바:50㎛.
도 3은 2x(즉, 50% 희석) 및 4x(즉, 25% 희석) 희석된 CDCS 스톡 용액을 사용하여 느리게 동결한 후 EC-MSC의 생존능 및 포화도를 나타낸다. 도 3a: 트립판 블루 배제 분석에 의해 측정한, 해동(동결보존된 샘플) 또는 계대(비-동결보존된 샘플) 후 24시간 EC-MSCs의 세포 생존능(각각 비-동결보존된 대조군, 기준 방법(Ref), 50% CDCS 및 25% CDCS 샘플에 대해 평균 93.7%, 86.8%, 90.6% 및 93%). 데이터는 5 샘플의 평균+SD를 나타낸다(Mann-Whitney test:* * P < 0.01;ns:유의하지 않음). 도 3b: 기준 동결 방법(Ref), 2x 및 4x 희석된 CDCS(각각 50% 및 25%) 및 동결보존되지 않은 샘플 간의 생존 가능한 세포의 수와 증식 능력을 반영하는 EC-MSC 포화도의 비교. 데이터 포인트는 평균±SD를 나타내고; 각 그룹 내의 샘플의 수는 대괄호 사이에 표시된다.
도 4는 CDCS를 사용하여 느리게 동결한 후 인간 유도 만능성 줄기세포(hiPSCs)의 생존력 및 포화도를 나타낸다. 도 4a:트립판 블루 배제 분석에 의해 측정된, 해동(동결보존된 샘플) 또는 계대(비-동결보존된 샘플) 후 24시간의 hiPSCs 세포 생존능. 데이터는 2 개의 독립적인 실험으로부터 6-7 샘플의 평균±SD를를 나타낸다;(Mann-Whitney test:* P < 0.05, * * P < 0.01) 도 4b: 동결 및 비-동결된 샘플 사이의 hiPSCs 포화도의 비교를 예시하는 대표적인 실시예. 데이터 포인트는 평균±SD를 나타내고; 각 그룹 내의 샘플의 수는 대괄호 사이에 표시된다
도 2는 3일 배양 후 유리화 및 비유리화 EC-MSC의 형태를 나타낸다. 좌측: 비-유리화 대조군; 우측: 1-단계 방법에 따라 본 명세서에 교시된 바와 같은 CDCS 조성물을 사용하는 유리화된 EC-MSC. 축적 바:50㎛.
도 3은 2x(즉, 50% 희석) 및 4x(즉, 25% 희석) 희석된 CDCS 스톡 용액을 사용하여 느리게 동결한 후 EC-MSC의 생존능 및 포화도를 나타낸다. 도 3a: 트립판 블루 배제 분석에 의해 측정한, 해동(동결보존된 샘플) 또는 계대(비-동결보존된 샘플) 후 24시간 EC-MSCs의 세포 생존능(각각 비-동결보존된 대조군, 기준 방법(Ref), 50% CDCS 및 25% CDCS 샘플에 대해 평균 93.7%, 86.8%, 90.6% 및 93%). 데이터는 5 샘플의 평균+SD를 나타낸다(Mann-Whitney test:* * P < 0.01;ns:유의하지 않음). 도 3b: 기준 동결 방법(Ref), 2x 및 4x 희석된 CDCS(각각 50% 및 25%) 및 동결보존되지 않은 샘플 간의 생존 가능한 세포의 수와 증식 능력을 반영하는 EC-MSC 포화도의 비교. 데이터 포인트는 평균±SD를 나타내고; 각 그룹 내의 샘플의 수는 대괄호 사이에 표시된다.
도 4는 CDCS를 사용하여 느리게 동결한 후 인간 유도 만능성 줄기세포(hiPSCs)의 생존력 및 포화도를 나타낸다. 도 4a:트립판 블루 배제 분석에 의해 측정된, 해동(동결보존된 샘플) 또는 계대(비-동결보존된 샘플) 후 24시간의 hiPSCs 세포 생존능. 데이터는 2 개의 독립적인 실험으로부터 6-7 샘플의 평균±SD를를 나타낸다;(Mann-Whitney test:* P < 0.05, * * P < 0.01) 도 4b: 동결 및 비-동결된 샘플 사이의 hiPSCs 포화도의 비교를 예시하는 대표적인 실시예. 데이터 포인트는 평균±SD를 나타내고; 각 그룹 내의 샘플의 수는 대괄호 사이에 표시된다
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 및 복수의 지시자를 모두 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는", "포함한" 및 "~을 포함하는"은 "함유하는", "함유한"과 동의어이며 포괄적이거나 개방형이며 추가, 비 - 인용된 구성원, 요소 또는 방법 단계방법 단계를 배제하지 않는다. 용어는 또한 "~로 구성된" 및 "본질적으로 구성되는"을 포함한다. 조성물을 언급할 때 본 명세서에서 사용된 용어 "~로 구성된"은 이후에 인용된 것들 이외의 다른 성분이 상기 조성물에 존재하지 않음을 의미한다. 조성물을 언급할 때 용어 "본질적으로 구성된"은 미량 시약의 존재를 허용하지만 일반적으로 0.1 w/v % 미만의 농도로 존재한다.
종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 언급은 각 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분획 뿐만 아니라 인용된 종점을 포함한다
파라미터, 양, 시간 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 참조할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 명시된 값, 예컨대 +/- 10% 이하, 바람직하게는 +/- 5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/- 1%, 더욱더 바람직하게는 +/- 0.1% 이하의 변화를, 본 발명에 적합한 경우에 포함하는 것을 의미한다. "약"이라는 수식어가 나타내는 값 자체도 구체적으로, 바람직하게는 개시되어 있음을 이해해야 한다.
하나 이상의 구성원 또는 구성원 그룹의 하나 이상의 구성원과 같은 용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는, 그 자체로 명확하지만 추가 예시를 통해, 상기 부재 중 임의의 하나, 또는 상기 부재의 임의의 2개 이상, 예를 들어, 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 등, 및 모든 상기 부재에 대한 언급을 포함한다. 다른 예에서, 1개 이상, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 이상을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 본 발명에 대한 배경의 논의는 본 발명의 문맥을 설명하기 위해 포함된다. 이것은 언급된 자료가 청구범위의 우선일 현재 어느 국가에서 출판되었거나 알려진 일반적인 일반 지식의 일부임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술 및 과학적 용어를 포함하여, 본 발명을 개시하는데 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가적인 안내에 의해, 본 발명의 교시를 더 잘 이해하도록 용어 정의가 포함된다. 특정 용어가 본 발명의 특정 양태 또는 본 발명의 특정 구현 예에 관련하여 정의되는 경우, 그 뜻은 본 명세서 전반에 걸쳐, 즉, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명의 다른 양태들 또는 구현 예들의 맥락에서도 적용되는 것을 의미한다.
다음에서, 본 발명의 상이한 양태들 또는 구현 예들이 더욱 상세하게 정의된다. 정의된 각각의 양태 또는 구현 예는 달리 명확하게 지시되지 않는 한 임의의 다른 양상(들) 또는 구현 예(들)과 결합될 수 있다. 특히, 바람직한 또는 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직한 또는 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서 전체에서 "일 구현 예", "하나의 구현 예"에 대한 참조는 구현 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 구현 예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 "일 구현 예에서" 또는 "하나의 구현 예에서"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 구현 예를 지칭하는 것은 아니며, 그럴 수도 있다. 또한, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 구현 예에서 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 일부 구현 예는 다른 구현 예에 포함된 다른 특징이 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 실시 예의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것을 의미하고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이한 구현 예를 형성한다. 예를 들어, 첨부된 특허청구범위에서, 청구된 구현 예 중 임의의 것은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 생물학적 재료의 동결보존을 위한 독특한 화학적으로 한정된 액체 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 시약의 특정 조합이 동결보존에 사용하기 위한 최적의 특성을 초래하는 이들 시약의 상승효과를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 극성 비양성자성 용매(예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)), 1가 또는 다가 알코올(예를 들어, 에틸렌글리콜), 비분지형 다당류(예를 들어, 수크로스) 및 분지형 다당류(예를 들어, 덱스트란), 및 폴리비닐 알코올(PVA)로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지거나, 이를 포함한다(액체 조성물은 또한 본 명세서에서 동결보존 용액(CDCS)이라고도 함). 이러한 액체 조성물은 다양한 유형의 동결보존 절차(예를 들어, 느린 동결, 1-단계 유리화, 다-단계 유리화)에 의해, 다양한 유형의 생물학적 재료-이에 제한되지 않는-줄기세포, 배아, 생식세포의 효율적이고, 생물학적으로 안전하고 재현 가능한 동결보존(예를 들어, 유리화)을 허용한다. 보다 구체적으로, 보다 구체적으로, 액체 조성물은 일반적으로 생존력, 증식 및 형태학적 종말점이 동결보존되지 않은 생물학적 재료와 유사하거나, 또는 기준 대조군 동결보존 용액으로 동결보존된 생물학적 재료와 유사하거나 더 나은 생물학적 재료의 효율적인 동결보존(예: 유리화)을 가능하게 한다.
본원에 교시된 바와 같은 조성물의 모든 성분들은 동물 또는 인간 조직 또는 유체(예를 들어, 혈청, 알부민 또는 임의의 다른 혈청 단백질)로부터 발생하지 않는 화학적으로 한정된 물질이다. 따라서, 그들의 특성은 생산 배치에서 본질적으로 안정하다. 또한, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물의 특성은 어떠한 항균제의 부재에도 불구하고, 바람직하지 않은 온도 조건에도, 시간이 지나도 현저하게 안정적이다. 실제로, 적어도 6개월 동안 4℃ 및 37℃(및 중간 및 혼합 온도 조건)에서의 저장에서, 생물학적 재료를 동결보존하는 데 있어서 그 광학/물리적 양태를 변경하지 않고 높은 효율을 가지며, 이는 표준화 및 품질 제어 목적을 위한 장점이다.
또한, 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 얼음 결정 억제 조성물로서 작용하며, 이는 일반적으로 권장보다 느린 냉각 및 보온 속도뿐만 아니라 저온 바이알을 사용하는 경우에도 유리화를 위한 통상적으로 사용되는 조성물보다 더 효과적이다. 예를 들어, 저온 바이알의 유리화는 일반적으로 유리화 목적을 위해 분당 2,000℃에서 20,000℃까지 일반적으로 권장되는 냉각 또는 가온 속도보다 상당히 낮은 약 100℃/분의 평균 냉각 또는 가온 속도를 갖는다(예를 들어, Tao Wang et al, 2015, Determination of convective heat transfer coefficient at the outer surface of a cryovial being plunged into liquid nitrogen. Cryoletters. 36:285-288). 높은 열 관성 조건(예: 용액으로 채워진 프렌치 빨대) 및 세포 부재 하에, 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물의 유리화 능력을 시험할 때, 동결 보존을 위한 액체 조성물의 냉각 또는 후속 가온시 얼음 결정이 광학적으로 검출되지 않은 반면, PVA가 없는 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물 및 참조 예의 유리화 용액은 냉각 또는 가온 시 빠른 결정 형성을 초래하여 생물학적 재료에 해로울 수 있다.
효율성에 더해, 화학적으로 한정된 조성물은 표준화 및 품질 제어 목적을 위한 유리하고, 그 제조 특성의 재현성 및 높은 중기- 내지 장기-안정성을 보장한다. 인간- 또는 동물 기원의 복합 단백질 또는 미정의된 성분의 부재는 생물학적 안전 요건에 부합한다.
따라서, 제1 양태는 극성 비양성자성 용매, 1가 또는 다가 알코올, 비분지형 다당류, 분지형 다당류, 및 폴리비닐 알코올을 필수성분으로 하는, 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "극성 비양성자성 용매"는 양전하를 갖는 불안정성 수소 이온을 함유하지 않는 극성 분자로 이루어진 용매를 지칭한다. 극성 비양성자성 용매는 전형적으로 물과 함께 수소 결합을 형성할 수 있는 반면, 비극성 용매는 강한 수소 결합을 할 수 없다. 극성 비양성자성 용매의 비 제한적인 예는 DMSO, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 아세톤 및 헥사메틸포스포트리아미드이다.
특정 실시양태에서, 극성 비양성자성 용매는 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 바람직하게는 DMSO로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "일가 알코올"은 1 개의 알코올 작용기(즉, 1 개의 히드록실(-OH)기)를 갖는 유기 화합물을 의미한다. 1가 알코올의 비 제한적인 예는 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올(이소프로판올), 부탄올 및 펜탄올을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다가 알코올"은 하나 이상의 알코올 작용기(즉, 1개 이상의 히드록실(- OH)기)를 갖는 유기 화합물을 의미한다. 다가 알코올의 비 제한적인 예는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨 및 볼레미톨을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 1가 또는 다가 알코올은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 개의 지시자를 모두 포함한다. 1가 또는 다가 알코올이 상이한 유형의 1가 및/또는 다가 알코올의 조합을 지칭하는데 사용될 때, 각각 상이한 유형의 1가 및/또는 다가 알코올의 총량은 각각 존재하는 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물 중의 1가 또는 다가 알코올의 양보다 더 높지 않을 것이다. 특정 실시양태에서, 1가 또는 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올(이소프로판올), 부탄올, 펜타놀, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨 및 볼레미톨로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 1가 또는 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 글리세롤이다. 보다 바람직하게는 에틸렌글리콜인것이 더욱 바람직하다
본원에서 사용되는 용어 "다당류"는 단당류의 분지형 또는 비분지형 호모- 또는 헤테로다이머(즉, 2 단당류, 또한 이당류로도 알려짐), -올리고머 또는 -폴리머(즉, 다당류로도 알려진 20개 이상의 단당류)를 의미한다. 단당류는 글리코시드 결합을 통해 결합될 수 있다. 본원에 정의된 다당류의 비 제한적인 예는 수크로스, 트레할로스, 락툴로스, 멜리비오스, 락토비네이트, 라피모오스, 덱스트란, 펙틴, 피콜, 전분, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 예컨대 히드록시에틸 전분 및 메틸셀룰로오스를 포함한다.
특정 실시양태에서, 비분지된 다당류는 수크로스, 트레할로스, 락툴로스, 멜리비오스, 락토비네이트, 라피모오스 및 셀룰로스 또는 이들의 유도체, 예컨대 메틸셀룰로오스, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 분지된 다당류는 덱스트란, 펙틴, 피콜 및 전분 또는 이들의 유도체, 예컨대 히드록시에틸 전분, 바람직하게는 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 비분지된 다당류는 수크로스이고, 분지된 다당류는 덱스트란이다
본원에 사용된 용어 "폴리비닐 알코올", "PVA", "PVOH" 또는 "PVAI"는 화학식[CH2CH(OH)]n에 의해 정의된 수용성 중합체이다. 폴리비닐 알코올은 또한 CAS 번호 9002-89-5로 정의될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "동결보존"은 생물학적 재료(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 유기체)가 0℃ 미만, 바람직하게는 -80℃ 미만(예를 들어, 고체 이산화탄소 사용), 더욱더 바람직하게는 -130℃(예를 들어, 액체 질소)를 갖는 환경에서 보존되는 방법을 지칭한다. 생물학적 재료는 전형적으로 비조절된 생화학적 동역학에 의해 야기되는 손상에 민감하다. 130℃ 이하의 온도에서는, 생물학적 재료를 손상시킬 수 있는 임의의 효소, 생화학적 활성이 효과적으로 정지된다. 동결보존 절차 동안, 냉각 또는 동결에 의해 보존되는 생물학적 재료는 전형적으로 하나 이상의 동결보호제와 접촉된다. 동결보존은 본 기술 분야에 공지된 임의의 동결보존 절차에 의해 얻어질 수 있으며, 이는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 느린 동결 및 다-단계 유리화 및 1-단계 유리화와 같은 과정을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 재료"는 세포, 세포 집합체, 조직 샘플, 기관, 생물학적 유체, (다)세포 유기체 및 임의의 다른 막(예를 들어, 리포좀), 뉴클레오시드(DNA 또는 RNA), 뉴클레오시드(바이러스), 지질 또는 단백질성 개체를 의미한다. 생물학적 재료의 비제한적인 예는 줄기세포(예를 들어, 중간엽 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포), 생식세포(예를 들어, 정자, 난자, 난), 배아(즉, 다양한 발달 단계, 예를 틀어 접합체, 2세포, 상실배, 배반포), 전혈 또는 이의 분획물(예를 들어, 백혈구, 적혈구, 혈장, 혈소판, 단백질 지질, 항체), 골수, 박테리아, 효모, 선충, 막 본체, 핵산(DNA 및 RNA) 및 바이러스를 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 줄기세포, 생식세포 및 배아의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 생물학적 재료는 배아, 바람직하게는 마우스 또는 인간 배아이다.
용어 "줄기세포"는 일반적으로 비 특화된 또는 비교적 덜 특화된 및 증식-경쟁 세포를 지칭하며, 이는 자가-재생이 가능하며, 즉, 분화 없이 증식할 수 있고, 또는 그 자손이 적어도 하나의 비교적 더욱 특화된 세포 유형을 야기할 수 있다. 상기 용어는 실질적으로 무제한 자가-갱신이 가능한 줄기세포, 즉, 줄기세포의 자손 또는 그의 적어도 일부는 비특화 또는 비교적 덜 특화된 표현형, 분화 전위, 및 모 줄기세포의 증식 능력을 유지하는 줄기세포, 뿐만 아니라, 제한된 자가 재생을 나타내는 줄기세포, 즉 추가 증식 및/또는 분화를 위한 자손 또는 이의 일부의 능력이 모세포와 비교하여 명백하게 감소된 줄기세포를 포함하다. 한정이 아닌 예로서, 줄기세포는 하나 이상의 계통을 따라 분화할 수 있는 자손(descendant)을 제공하여 점점 더 많은 특수 세포를 생성할 수 있으며, 여기서 이러한 후손 및/또는 점점 더 많은 특화된 세포는 본 명세서에 정의된 바와 같은 줄기세포일 수 있거나, 또는 말단 분화된 세포, 즉, 유사분열이 끝난 완전 특화된 세포를 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 만능 줄기세포" 또는 "iPS"는 재프로그래밍(reprogramming)에 의해 성체 세포로부터 생성된 만능 줄기세포를 의미한다. iPS 세포는 자가 재생될 수 있고, 유기체의 세 가지 모든 배엽층, 즉 중배엽, 내배엽 및 외배엽에서 기원하는 세포 유형을 생성할 수 있으며, 전체 유기체로 성장할 수는 없지만, 유기체의 모든 세포 유형을 생성할 수 있다. iPS 세포의 예는 특히 야마나카(Yamanaka)에 의해 2006 (Cell 126: 663-676) and Yamanaka et al. 2007 (Cell 131: 861-872)에 게시된 바와 같은 것들이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 만능(pluripotent)은 유기체의 3개의 배엽층, 즉, 중배엽, 내배엽 및 외배엽으로부터 유래하는 세포 유형의 생성을 야기하기 위한 세포의 용량을 나타내고, 잠재적으로 임의의 및 모든 세포 유형의 유기체를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSCs), 혈액 유래 줄기세포(BDSCs), 제대혈 유래 줄기세포(UCBSCs) 및 골수 유래 줄기세포(BMSCs)로 이루어진 군으로부터 선택된 다분화능 줄기세포이다. 바람직한 구체예에서, 세포는 MS Cs 이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중간엽 줄기세포" 또는 "MSCI"는 전형적으로 2개 이상의 중간엽 계통, 더욱 전형적으로는 3개 이상의 중간엽 계통의 세포를 생성할 수 있는 성체, 중배엽 유래 줄기세포, 예를 들어 예를 들어, 연골-골모세포(뼈 및 연골), 골모세포(뼈), 연골모세포(연골), 근세포(근육), 건세포(힘줄), 섬유모세포(결합 조직), 지방세포(지방) 및 기모세포(골수 기질) 계통이다. MSC는 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간 개체의 생물학적 샘플, 예를 들어, 골수, 소주골, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황, 피부(진피), 특히 태아 및 청소년 피부, 골막, 치수, 힘줄 및 지방 조직으로부터 분리될 수 있다.
또한, 용어 "MSC"는 동물 또는 인간 개체의 생물학적 샘플로부터 얻어진 MSC시험관 내 또는 생체 외 증식(propagation/expansion)에 의해 얻어진 자손(progeny)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 생물학적 샘플이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플들"은 동물 또는 사람 피검자, 세포 배양, 조직 샘플 등과 같은 생물체로부터 얻은 샘플을 의미한다. 동물 또는 인간 개체의 생물학적 시료는 동물 또는 사람 피검체로부터 제거된 샘플을 지칭하며, 이의 세포를 포함한다. 동물 또는 인간 개체의 생물학적 샘플은 하나 이상의 조직 유형을 포함할 수 있고, 하나 이상의 조직 유형의 세포를 포함할 수 있다. 동물 또는 인간 개체의 생물학적 샘플을 얻는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 조직 생검 또는 혈액 추출이다. 인간 MSC, 이의 분리, 시험관 내 팽창, 및 분화는 예를 들어 미국 특허 제5,486,359호; 미국 특허 제5,811,094호; 미국 특허 제5,736,396호; 미국 특허 제5,837,539호; 또는 미국 특허 제5,827,740호에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상자" "기증자" 또는 "환자"는 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 척추동물, 더욱더 바람직하게는 포유류, 더욱더 바람직하게는 영장류를 지칭하며, 특히 인간과 비-인간 포유류 및 영장류를 포함한다. 바람직한 대상은 사람이다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 하나 이상의 포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 또는 인간 세포, 더욱 더 바람직하게는 인간 세포이다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 중기 II(MII) 난모세포 및 배아(예를 들어, 다양한 발달 단계에서의 배아)와 같은 보조 생식 기술(ART)을 위한 생물학적 재료이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4를 갖는 희석제를, 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 희석제는 평형 염 용액, 바람직하게는 인산염 완충 식염수(PBS), 더욱 바람직하게는 둘베코 PBS(D-PBS)이다
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "평형 염 용액" 또는 "BSS"는 생리학적 pH(바람직하게는 약 pH 7.4) 및 등장성 염 농도로 제조된 용액을 지칭한다. BSS는 전형적으로 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 염화물을 포함한다. 평형 염 용액의 비제한적 예는 PBS, HEPES, Alsever 용액, Earle의 평형 염 용액(EBSS), Grey의 평형 염 용액(GBSS), Hank의 평형 염 용액(HBSS), Ringer의 평형 염 용액(RBSS) 및 Tyrode의 평형 염 용액(TBSS)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 희석제는 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하지 않는다.
본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 생물학적 재료의 동결보존에 효과적이다. 먼저, 특정 시약의 조합, 보다 구체적으로는 1가 또는 다가 알코올, 비분지된 다당류, 분지된 다당류 및 폴리비닐 알코올을 조합하여, 최적의 동결보존을 제공한다. 또한, 본 발명자들은 광범위한 농도에서 효과적인 극성 비양성자성 용매의 이러한 상이한 성분의 최적 비율을 확인하였다. 따라서, 특정 용도를 위해 극성 비양성자성 용매, 1가 또는 다가 알코올, 비분지형 다당류, 분지형 다당류 및 폴리비닐 알코올의 농도가 더 낮은 조성으로 추가 희석될 수 있는 스톡 용액(즉, 1x 농축, 희석되지 않은 용액)을 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 극성 비양성자성 용매, 1가 또는 다가 알코올, 비분지형 다당류, 분지형 다당류, 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 액체 조성물 및 생물학적 재료의 동결보존에서의 이들의 용도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 0.30 내지 4.0%(w/v), 0.50 내지 3.50%(w/v), 0.50 내지 3.0%(w/v), 0.50 내지 2.50%(w/v), 0.50 내지 2.0%(w/v), 0.50 내지 1.50%(w/v) 또는 0.50 내지 1.0%(w/v), 바람직하게는 0.30 내지 4.0%(w/v)의 폴리비닐 알코올을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물 중의 비분지된 다당류의 양은 각각 폴리비닐 알코올의 20배 이상이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중의 비분지형 올리고당의 양은 각각 분지된 올리고당의 8배 이상이다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물 또는 액체 스톡 조성물(즉, lx 농축, 원액)은,
-13.0 내지 23.0%(v/v), 15.0 내지 20.0%(v/v), 16.0 내지 19.0%(v/v), 17.0 내지 18.0%(v/v), 바람직하게는 13.0 내지 23.0%(v/v)의 극성 비양성자성 용매, 예를 들어 약 17.7%(v/v)의 극성 비양성자성 용매,
-13.0 내지 23.0%(v/v), 15.0 내지 20.0%(v/v), 16.0 내지 19.0%(v/v), 17.0 내지 18.0%(v/v), 바람직하게는 13.0 내지 23.0%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올, 예를 들어 약 17.7%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
-9.0 내지 31.0%(w/v), 10 내지 30%(w/v), 15 내지 25%(w/v) 또는 20 내지 25%(w/v)의 비분지된 다당류, 예를 들어 약 22.7%(w/v)의 비분지된 다당류;
-0.60 내지 22.0%(w/v), 1.0 내지 20.0%(w/v), 1.0 내지 15.0%(w/v), 1.0 내지 10.0%(w/v), 1.0 내지 5.0%(w/v), 2.0 내지 5.0%(w/v) 또는 2.0 내지 3.0%(w/v)의 분지된 다당류, 예를 들어 2.64%(w/v)의 분지된 다당류;
-0.30 내지 4.0%(w/v), 0.50 내지 3.50%(w/v), 0.50 내지 3.0%(w/v), 0.50 내지 2.50%(w/v), 0.50 내지 2.0%(w/v), 0.50 내지 1.50%(w/v) 또는 0.50 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.30 내지 4.0%(w/v)의 폴리비닐 알코올, 예를 들어 약 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및
-100%(v/v)까지의 희석제, 바람직하게는 평형 염 용액을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물 또는 액체 원료 조성물(즉, 1x 농축, 원액)은,
-적어도 15%(v/v), 적어도 16%(v/v) 또는 17%(v/v)의 극성 비양성자성 용매,
-적어도 15%(v/v), 적어도 16%(v/v) 또는 17%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올,
-적어도 15%(w/v), 적어도 16%(w/v), 적어도 17%(w/v), 적어도 18%(w/v), 적어도 19%(w/v), 적어도 20%(w/v), 적어도 21%(w/v) 또는 적어도 22%(w/v)의 비분지형 다당류;
-적어도 2.0%(w/v), 적어도 2.10%(w/v), 적어도 2.20%(w/v), 적어도 2.30%(w/v), 적어도 2.40%(w/v), 적어도 2.50%(w/v) 또는 적어도 2.60%(w/v)의 분지형 다당류, 및
-약 0.9%(w/v)의 폴리비닐알코올을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 조성물은 전술한 바와 같은 스톡 조성물과 동일한, 희석제 중의 스톡 조성물의 희석일 수 있다. 이러한 희석은 상기 희석제, 바람직하게는 평형 염 용액에서 1:2(즉, 50%), 1:3(즉, 약 33.3%)), 1:4(즉, 25%), 1:5(즉, 20%), 1:6(즉, 약 16.7%), 1:7(즉, 약 14.3%), 1:8(즉, 12.5%), 1:9(즉, 약 9.1%), 1:12(즉, 약 8.3%), 1:13(즉, 약 7.7%), 1:14(즉, 약 7.1%), 1:15(즉, 약 6.7%) 또는 1:16(즉, 약 6.3%)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 스톡 조성물의 희석)은
-적어도 0.8%(v/v), 적어도 1%(v/v), 적어도 1.2%(v/v), 적어도 1.6%(v/v), 적어도 2%(v/v), 적어도 4.0%(v/v) 또는 적어도 6.0%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
-적어도 0.8%(v/v), 적어도 1%(v/v), 적어도 1.2%(v/v), 적어도 1.6%(v/v), 적어도 2%(v/v), 적어도 4.0%(v/v) 또는 적어도 6.0%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
-적어도 0.5%(w/v), 적어도 1%(w/v), 적어도 2%(w/v), 적어도 4%(w/v), 적어도 6%(w/v), 적어도 8%(w/v), 적어도 10%(w/v), 적어도 12%(w/v), 적어도 14%(w/v), 적어도 16%(w/v), 적어도 18%(w/v), 적어도 20%(w/v), 적어도 21%(w/v) 또는 적어도 22%(w/v)의 비분지형 다당류;
-적어도 0.035%(w/v), 적어도 0.0750%(w/v), 적어도 0.150%(w/v), 적어도 0.30%(w/v), 적어도 0.60%(w/v), 적어도 2.10%(w/v), 적어도 2.20%(w/v), 적어도 2.30%(w/v), 적어도 2.40%(w/v), 적어도 2.50%(w/v) 또는 적어도 2.60%(w/v)의 분지형 다당류;
-적어도 0.015%(w/v), 적어도 0.1%(w/v), 적어도 0.2%(w/v), 적어도 0.3%(w/v), 적어도 0.4%(w/v), 적어도 0.5%(w/v), 적어도 0.6%(w/v), 적어도 0.7%(w/v) 또는 적어도 0.8%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및
-100%(v/v)의 희석제, 바람직하게는 평형 염 용액을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시 예에서,
-상기 극성 비양자성 용매는 DMSO 및 디메틸포름아미드(DMF)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
-1가 또는 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올(이소프로판올), 부탄올, 펜타놀, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨 및 볼레미톨, 바람직하게는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 글리세롤, 더욱 바람직하게는 에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되고,
-상기 비분지된 다당류는 수크로스, 트레할로스, 락툴로스, 멜리비오스, 락토비네이트, 라피모오스 및 셀룰로스 또는 이들의 유도체, 예컨대 메틸셀룰로오스, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
-상기 분지된 다당류는 덱스트란, 펙틴, 피콜 및 전분 또는 이들의 유도체, 예컨대 히드록시에틸 전분, 바람직하게는 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명은 DMSO, 에틸렌글리콜, 수크로스, 덱스트란 및 폴리비닐 알코올을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "디메틸술폭사이드" 또는 "DMSO"는 화학식(CH3)2SO를 갖는 유기황 화합물을 지칭한다. DMSO는 CAS 번호 67-68-5에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에틸렌글리콜"은 화학식(CH2OH)2의 유기 화합물을 의미하며, 에틸렌글리콜은 CAS 번호 107-21-1에 의해 확인될 수 있다
본 명세서에서 사용되는 용어 "수크로스" 또는 "사카로오스" 또는 "사카로오스" 또는 "설탕"은 글루코오스 및 과당으로 구성된 이당류 및 화학식 C12H22O11을 의미한다. 수크로스는 CAS 번호 57-50-1에 의해 확인될 수 있다
본원에 사용된 용어 "덱스트란"은 글루코오스의 축합으로부터 유도된 복합 분지형 글루칸 다당류를 지칭한다. 덱스트란은 CAS 번호 9004-54-0에 의해 확인될 수 있다. 덱스트란 사슬은 다양한 길이(예를 들어, 1 내지 2000kDa)를 가질 수 있다. 상이한 유형의 덱스트란은 분자량(MW)에 의해 표시될 수 있다. 예를 들어, 다양한 MW를 갖는 덱스트란의 비제한적인 예는 덱스트란 1(즉, 약 1000Da의 MW를 가짐), 덱스트란 5(즉, 약 5000Da의 MW를 가짐), 덱스트란 12(즉, 약 12,000Da의 MW를 갖는 것), 덱스트란 25(즉, 약 25,000Da의 MW를 가짐)), 덱스트란(40)(즉, 약 40,000Da의 MW를 가짐), 덱스트란(50)(즉, 약 50,000Da의 MW를 가짐), 덱스트란(60)(즉, 약 70,000Da의 MW를 가짐), 덱스트란(80)(즉, 약 80,000Da의 MW를 가짐), 덱스트란(150)(즉, 약 150,000Da의 MW를 가짐) 및 덱스트란(200)(즉, 약 200,000Da의 MW를 가짐)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 덱스트란 용어는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수의 지시자를 모두 포함한다. 덱스트란이 상이한 유형의 덱스트란의 조합을 지칭하는데 사용될 때, 상이한 유형의 덱스트란의 총량은 본 명세서에 교시된 바와 같이 액체 조성물 중의 분지된 다당류의 양보다 더 높지 않을 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물에 존재하는 덱스트란은 본질적으로 1종의 덱스트란 또는 상이한 유형의 덱스트란의 조합, 예를 들어, 상이한 MW를 갖는 덱스트란(덱스트란들)의 조합물을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물에 존재하는 덱스트란은 단지 1종의 덱스트란을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 더욱 특정한 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물에 존재하는 덱스트란은 덱스트란 1, 덱스트란 40 또는 덱스트란 70을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 예를 들어, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 덱스트란 1을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물에 존재하는 덱스트란은 상이한 분자량 덱스트란의 조합을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 덱스트란은 덱스트란 1, 덱스트란 40 및 덱스트란 70으로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
조성물 중의 상이한 유형의 덱스트란(예를 들어, 상이한 분자량 덱스트란)의 양 사이의 비율은 본 발명의 액체 조성물에 중요하지 않다
그럼에도 불구하고, 특정 실시양태에서, 덱스트란은 본질적으로 덱스트란 1, 덱스트란 40 및 덱스트란 70으로 구성되며, 1:1:1, 2:1:1, 10:10:1 또는 10:1:10 비, 바람직하게는 1:1:1 비이다. 덱스트란 1의 예는 Pharmacosmos(ref 5510 0001 1007)의 덱스트란 1이다. 덱스트란(40)의 예는 AppliChem(ref A2249)의 덱스트란(40)이다. 덱스트란 70의 예는 AppliChem(ref A1847)의 덱스트란 70이다
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 실질적으로 동일한 양의 DMSO 및 에틸렌글리콜, 및 덱스트란의 적어도 8배 농도의 수크로스를 포함한다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 하기를 포함한다:
-실질적으로 동일한 양의 DMSO 및 에틸렌글리콜,
-덱스트란의 적어도 8배 농도의 수크로스
-폴리비닐알코올의 적어도 20배 농도의 수크로스.
특정 실시양태에서, 액체 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 스톡 조성물의 희석액)은 하기를 포함한다:
-적어도 0.8%(v/v), 적어도 1%(v/v), 적어도 1.2%(v/v), 적어도 1.6%(v/v), 적어도 2%(v/v), 적어도 4.0%(v/v) 또는 적어도 6.0%(v/v)의 DMSO;
-적어도 0.8%(v/v), 적어도 1%(v/v), 적어도 1.2%(v/v), 적어도 1.6%(v/v), 적어도 2%(v/v), 적어도 4.0%(v/v) 또는 적어도 6.0%(v/v)의 에틸렌글리콜;
-적어도 0.5%(w/v), 적어도 2%(w/v), 적어도 4%(w/v), 적어도 6%(w/v), 적어도 8%(w/v), 적어도 10%(w/v), 적어도 12%(w/v), 적어도 14%(w/v), 적어도 16%(w/v), 적어도 18%(w/v), 적어도 20%(w/v), 적어도 21%(w/v), 적어도 22%(w/v)의 수크로스;
-적어도 0.037%(w/v), 적어도 0.075%(w/v), 적어도 0.15%(w/v), 적어도 0.2%(w/v), 적어도 0.25%(w/v), 적어도 0.5%(w/v), 적어도 1%(w/v), 적어도 1.25%(w/v), 적어도 1.5%(w/v), 적어도 1.75%(w/v), 적어도 2%(w/v), 적어도 2.25%(w/v) 또는 적어도 2.5%(w/v)의 덱스트란;
-적어도 0.015%(w/v), 적어도 0.1%(w/v), 적어도 0.2%(w/v), 적어도 0.3%(w/v), 적어도 0.4%(w/v), 적어도 0.5%(w/v), 적어도 0.6%(w/v), 적어도 0.7%(w/v) 또는 적어도 0.8%(w/v) 폴리비닐 알코올; 및
- 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4의, 100%(v/v)까지의 희석제.
특정 실시양태에서, 액체 조성물 또는 액체 원료 조성물(즉, lx 농축, 원액)은,
-13.0 내지 23.0%(v/v), 15.0 내지 20.0%(v/v), 16.0 내지 19.0%(v/v), 17.0 내지 18.0%(v/v) 또는 13.0 내지 23.0%(v/v)의 DMSO, 예를 들어 약 17.7%(v/v)의 DMSO;
-13.0 내지 23.0%(v/v), 15.0 내지 20.0%(v/v), 16.0 내지 19.0%(v/v), 17.0 내지 18.0%(v/v) 또는 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜, 예를 들어 약 17.7%(v/v)의 에틸렌글리콜;
-9.0 내지 31.0%(w/v), 10.0 내지 30.0%(w/v), 15.0 내지 30.0%(w/v), 15.0 내지 25.0%(w/v), 20.0 내지 25.0%(w/v) 또는 22.0 내지 23.0%(w/v), 예를 들어 약 22.7%(w/v)의 수크로스;
-0.60 내지 22.0%(w/v), 1.0 내지 20.0%(w/v), 1.0 내지 15.0%(w/v), 1.0 내지 10.0%(w/v), 1.0 내지 7.50%(w/v), 1.0 내지 5.0%(w/v), 2.0 내지 4.0%(w/v) 또는 2.0 내지 3.0%(w/v), 예를 들어 약 2.64%(w/v)의 덱스트란;
-0.30 내지 4.0%(w/v), 0.50 내지 3.50%(w/v), 0.50 내지 3.0%(w/v), 0.50 내지 2.50%(w/v), 0.50 내지 2.0%(w/v), 0.50 내지 1.50%(w/v) 또는 0.50 내지 1.0%(w/v)의 폴리비닐 알코올, 예를 들어 약 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및/또는
-바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 조성물 또는 스톡 조성물은 적어도 15%(v/v) DMSO, 적어도 15%(v/v) 에틸렌글리콜, 적어도 15%(w/v) 수크로스, 적어도 2.5%(w/v) 덱스트란, 약 0.9%(w/v) 폴리비닐알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 조성물 또는 스톡 조성물은 약 17.7%(v/v) DMSO, 약 17.7%(v/v) 에틸렌글리콜, 약 22.7%(w/v) 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 40, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하지 않으며, 바람직하게는 액체 조성물은 포유류 기원의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 액체 조성물은 임의의 알부민 또는 다른 혈청 단백질을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 동물 성분을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 혈청을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물은 항미생물제, 예컨대 항생제를 포함하지 않는다.
본 발명자들은 본원에 교시된 액체 조성물이, 동결보존되지 않은 대조 생물학적 재료와 유사한 생존력, 증식 및 형태학적 종말점을 갖는, 생물학적 재료의 고도로 효율적인 동결보존(예: 유리화 또는 동결)을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
따라서, 추가의 양태는 생물학적 재료의 동결보존을 위해 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 동결보존은 느린 동결 절차 또는 다단계 유리화 또는 1-단계 유리화와 같은 유리화 절차와 같은 동결 절차에 의해 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "느린 동결 또는 냉동 절차" 또는 "SLF" 라는 용어는, 예를 들어, 적어도 80℃ 또는 적어도 -196℃의 온도로 생물학적 재료를 냉각시키는 공정을 의미하며, 여기서 생물학적 재료는 느린 제어된 속도로, 예를 들어 분당 0.1℃ 내지 2℃의 감소로 냉각된다. 제어된 냉각 속도는 속도-제어 냉동기 또는 벤치탑 휴대용 냉동 컨테이너와 같은 이러한 목적을 위해 당 업계에 공지된 임의의 장치에 의해 달성될 수 있다. 생물학적 재료는, 기계적-예를 들어 세포 내 얼음 결정에 막 붕괴-및 세포의 삼투 손상을 방지하기 위해, 전형적으로 하나 이상의 동결보호제(예를 들어, 배양 배지 중의 10%(v/v)DMSO)와 접촉한다.
예를 들어, 느린 냉동 절차는 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다: 생물학적 재료를 10% 디메틸 술폭시드(DMSO)(예를 들어, CryoStor® CS10 (STEMCELL Technologies))를 함유하는 동결보존 용액 또는 본원에 교시된 바와 같이 액체 조성물의 50% 또는 25% 희석액에 침지시키는 단계, 생물학적 재료를 포함하는 저온 바이알을 -80℃ 냉동기에서 동결용 용기(예를 들어, Mr FrostyTM(Nalgene)장치) 내에서 밤새 저장하는 단계, 이어서 저온 바이알을 액체 질소로 옮기는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유리화"는 생물학적 재료를 냉각시키는 공정을 지칭하며, 여기서 생물학적 재료는 최종 저장 온도에 도달할 때까지 분당 2,000℃ 내지 20,000℃의 매우 빠른 냉각 속도로 0℃ 미만, 예를 들어 1,300℃의 온도로 냉각된다. 생물학적 재료는 전형적으로 하나 이상의 동결보호제(전형적으로 5 내지 7.15M)와 접촉되어 세포 내 삼투 손상을 방지하고 냉각 공정에서 얼음의 형성을 억제한다. 유리화 절차는 당 업계에 공지되어 있으며, 다단계 및 1단계 유리화 절차를 포함한다. 유리화 절차는 전형적으로 침투 및/또는 비투과성 동결보호제를 함유하는 수용액(유리화 용액)으로 생물학적 재료를 탈수하는 적어도 하나의 단계를 포함한다. 생물학적 재료는 유리화 용액과 함께 적합한 저온 용기 내에 배치되고, 액체 질소 또는 그의 증기와 같은 극저온 유체 내의 침지에 의해 신속하게 냉각된다. 잘 균형잡힌 냉각 속도 및 동결보호제의 농도는 세포 내 물이 순차적으로, 손상, 결정질 얼음 상태에 비해 고체, 무해한, 유리질(유리질) 상태를 달성할 수 있게 한다. 유리화 장치는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 저온 용기를 포함한다.
예를 들어, 1-단계 유리화 절차는 생물학적 재료를 본원에 교시된 동결보존을 위한 희석되지 않은 액체 조성물과 접촉시키는 단계 및 생물학적 재료를 조성물에서 이동시켜 생물학적 재료를 둘러싼 실질적으로 모든 배양 배지를 제거하는 단계, 본원에 교시된 액체 조성물의 더 작은 부피에서 생물학적 물질을 수확하고 보호용 빨대 또는 냉동 바이알에 담는 단계를 포함한다. 빨대 또는 냉동 바이알을 밀봉하고 액체 질소에 직접 담근다. 생물학적 재료를 본원에 교시된 액체 조성물로 옮기고 액체 질소에 투입하는 사이의 시간은 최대 1분이다.
예를 들어, 다단계(평형) 유리화 절차는 다음 단계를 포함할 수 있다: 본 명세서에 교시된 바와 같은 동결보존용 스톡 액체 조성물의 희석액에 생물학적 재료를 침지시키는 단계(예를 들어, 1:16 희석액에서 3분, 1:8 희액석에서 3분, 1:4 희석액에서 3분, 1:2 희석액에서 5분), 생물학적 재료를 보호 빨대 또는 저온 바이알에서 본 명세서에 교시된 바와 같은 희석되지 않은 조성물의 보다 작은 부피로 침지하는 단계를 포함한다. 빨대 또는 저온 바이알은 밀봉되고 액체 질소에서 직접 담그게 된다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 적어도 -80℃, 적어도 -90℃, 적어도 -100℃, 적어도 -110℃, 적어도 -120℃, 적어도 -130℃, 적어도 140℃, 적어도 -150℃, 적어도 160℃, 적어도 -170℃, 적어도 180℃, 적어도 -190℃ 또는 적어도 200℃의 온도에서 생물학적 재료의 동결보존을 위해 사용된다,
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20년의 기간 동안 생물학적 재료의 동결보존에 사용된다.
생물학적 재료를 동결보존하기 위한 일반적으로 권장 냉각 및 가온 속도는 [~ 20,000℃/분]이다. 특정 구현 예에서, 유리화 방법의 냉각 및/또는 가온 속도는 [~ 1,000℃/분]이다. 본 발명의 조성물은 냉각 속도 및/또는 가온 속도가 [~ 1,000℃/분]인 유리화 방법에서 강한 얼음 결정 억제 특성을 제공한다는 것이 발견되었다.
마찬가지로, 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 생물학적 재료를 보존하기 위한 방법을 제공한다:
-생물학적 재료를 제공하는 단계;
-본 명세서에 교시된 바와 같이, 생물학적 재료를 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물 또는 스톡 조성물의 희석액)과 접촉시키는 단계;
-본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물 중의 생물학적 재료를 냉각 및/또는 가온하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉" 또는 "접촉하는"은 제1 성분(들)(즉, 하나 이상의 분자, 생물학적 개체, 세포, 또는 물질과 같은)을 하나 이상의 제2 성분(예를 들어, 하나 이상의 분자, 생물학적 개체, 세포, 또는 물질)과 함께 가져와서, 하나 이상의 제1 성분(들)을 2 성분(들)과 직접 노출(직접 접촉)하고, 제1 성분(들)이, 가능한 경우, 제2 성분(들)을 결합 또는 조절할 수 있거나, 또는 제2 성분(들)이, 가능한 경우, 제1 성분(들)을 결합 또는 조절하는 것이다. 용어 "접촉"은 문맥에 의존하여, 노출, 배양, 또는 혼합, 또는 그와 유사한 것과 동의어일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물과 생물학적 재료의 접촉은 액체 조성물의 부피에 생물학적 재료를 침지 또는 담그는 것으로 달성되며, 바람직하게는 액체 조성물의 부피는 생물학적 재료를 완전히 둘러싸기에 충분하다. 당업자는 사용된 액체 조성물의 부피가 생물학적 재료의 종류 및 양에 따라 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 생물학적 재료가 배아(embryo)인 경우, 액체 조성물의 0.1㎕ 내지 1㎕가 충분할 수 있다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물과 생물학적 재료를 접촉시키는 것은 동결보존에 적합한 용기에서 수행된다. 이러한 용기는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 보호 프렌치 빨대(French straw) 또는 저온 바이알을 포함한다
특정 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 예비-냉각 평형 단계를 포함하며, 이는 15 내지 37℃ 사이의 온도에서 유리화 매질의 하나 이상의 (전형적으로 증가하는) 농도에 대한 짧은(30 내지 600초, 바람직하게는 180 내지 300초) 접촉을 포함한다. 예비-냉각 평형 단계는 전형적으로 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 다단계 유리화와 같은 다단계 냉각 과정에 포함된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료를 냉각시키는 것을 포함한다. 다른 구현 예에서, 상기 방법은 생물학적 재료를 가온하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 재료는 냉동 지점 아래의 온도로 냉각되고, 주어진 시간 주기 후에, 동결 지점 이상의 온도로 가열된다.
공정의 만족스러운 효율성을 달성하기 위해 냉각 전에 생물학적 물질을 평형화하기 위해 여러 다른 조성물(즉, 다른 성분으로 구성됨)을 사용하는 냉각 단계(예: 유리화)를 포함하는 생물학적 물질을 보존하기 위해 일반적으로 사용되는 방법과 달리, 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물은 생물학적 재료를 평형화하기 위해 동일한 스톡 용액(그러나 다양한 희석액으로)을 사용하는 것을 허용한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 재료를 본원에 교시된 바와 같은 희석되지 않은 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)과 접촉시키기 전에 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 하나 이상(1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게는 4개)의 희석액과 생물학적 재료를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단계는 생물학적 재료의 냉각 전에 수행된다. 보다 구체적인 구현 예에서, 희석되지 않은 조성물은 13.0 내지 23.0%(v/v)의 DMSO; 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜, 9.0 내지 31.0%(w/v)의 수크로스; 0.60 내지 22.0%(v/v)의 덱스트란; 0.30 내지 4.0%(v/v)의 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제, 바람직하게는 약 17.7%(v/v)의 DMSO, 약 17.7%(v/v)의 에틸렌글리콜, 약 22.7%(w/v)의 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0.88%(w/v)의 덱스트란(40(w/v)), 약 0 88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS를 를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1종 이상의 희석액은 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 및/또는 1:16 희석액이다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 생물학적 재료를 본 명세서에 교시된 바와 같은 희석되지 않은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)과 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 2 이상(예를 들어, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 4) 농도가 감소된 희석액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 단계는 생물학적 재료의 냉각 전에 수행되고, 바람직하게는, 생물학적 재료를 희석되지 않은 액체 조성물과 접촉시키기 전에, 생물학적 재료가 접촉되는 액체 조성물의 최종 희석액은 1:2 희석액이다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료를 상기 조성물과 접촉시키기 전에, 본원에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1:16 희석, 1:8 희석, 1:4 희석 및 1:2 희석액과 생물학적 재료를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 단계는 생물학적 재료의 냉각 전에 수행되고, 바람직하게는 상기 희석되지 않은 액체 스톡 조성물은 13.0 내지 23.0%(v/v)의 DMSO; 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜, 9.0 내지 31.0%(w/v)의 수크로스; 0.60 내지 22.0%(w/v)의 덱스트란; 0.30 내지 4.0%(w/v)의 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제, 더욱 바람직하게는 약 17.7%(v/v)의 DMSO, 약 17.7%(v/v)의 에틸렌글리콜, 22.7%(w/v)의 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 40, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)과 생물학적 재료를 접촉하기 전에, 생물학적 재료를
- 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1:16 희석액은 적어도 0.5분, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 3분, 바람직하게는 적어도 3분,
- 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1:8 희석액은 적어도 0.5분, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 3분, 바람직하게는 적어도 3분,
- 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1:4 희석액은 적어도 0.5분, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 3분, 바람직하게는 적어도 3분, 및
- 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1:2 희석액은 적어도 0.5분, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 3분, 바람직하게는 적어도 5분,
접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 단계는 생물학적 재료의 냉각 전에 수행된다.
특정 실시양태에서, 액체 조성물의 1:16 희석액, 액체 조성물의 1:8 희석액, 액체 조성물의 1:4 희석액 및 액체 조성물의 1:2 희석액과 생물학적 재료를 접촉시키는 각각의 단계는 0.5 내지 10분, 1 내지 6분 또는 3 내지 5분, 바람직하게는 3 내지 5분 동안 수행된다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 냉각은, 생물학적 재료와 교시된 바와 같은 액체 조성물(즉, 희석액 또는 원액)과 접촉으로부터, 3분, 2분 또는 1분, 바람직하게는 1분 이내에, 수행된다.
특정 실시 예로, 상기 냉각은 생물학적 재료의 온도를 적어도 -70℃, 적어도 -80℃, 적어도 -90℃, 적어도 -100℃, 적어도 -110℃, 적어도 -120℃, 적어도 -130℃, 적어도 140℃, 적어도 -150℃, 적어도 -160℃, 적어도 -170℃, 적어도 180℃, 적어도 -190℃ 또는 적어도 -200℃ 이하의 온도로 감소시키는 것을 포함한다. 이것은 동결 절차(예를 들어, 느린 동결) 또는 유리화와 같은 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 냉각은 느린-동결 절차에 의해 수행된다. 더욱 특정한 실시양태에서, 느린-동결 절차에 의해 냉각이 수행되면, 액체 조성물은 다음을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 액체 스톡 조성물의 희석액, 바람직하게는 1:2 또는 1:4 희석액, 더욱 바람직하게는 1:4 희석액이다; 13.0 내지 23.0%(v/v) DMSO; 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜, 9.0 내지 31.0%(w/v) 수크로스; 0.60 내지 22.0%(w/v) 덱스트란; 0.30 내지 4 0%(v/v)의 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제, 바람직하게는 약 17.7%(v/v) DMSO, 약 17.7%(v/v) 에틸렌글리콜, 약 22.7% (w/v) 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 40, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료의 1단계 유리화를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 방법이 생물학적 재료의 1-단계 유리화를 포함하는 경우, 생물학적 재료는, 다음을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 희석되지 않은 액체 스톡 조성물과만 접촉한다: 13.0 내지 23.0%(v/v)의 DMSO; 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜; 9.0 내지 31.0%(w/v) 수크로스; 0.60 내지 22.0%(w/v) 덱스트란; 0.30 내지 4%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제, 바람직하게는 약 17.7%(v/v) DMSO, 약 17.7%(v/v) 에틸렌글리콜, 약 22.7%(w/v) 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 40, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료의 다-단계 유리화를 포함한다. 다-단계 유리화는 생물학적 재료의 냉각 전에 하나 이상의 평형 단계(들)를 포함할 수 있으며, 여기서 생물학적 재료를 본 명세서에 교시된 바와 같은 희석되지 않은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)과 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물(예를 들어, 스톡 조성물)의 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 4)의 희석액과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 희석되지 않은 조성물은 13.0 내지 23.0%(v/v)의 DMSO; 13.0 내지 23.0%(v/v)의 에틸렌글리콜, 9.0 내지 31.0%(w/v)의 수크로스; 0.60 내지 22.0%(v/v)의 덱스트란; 0.30 내지 4.0%(v/v)의 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 희석제, 보다 바람직하게는 약 17.7%(v/v) 에틸렌글리콜, 약 22.7%(w/v) 수크로스, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 1, 약 0,88%(w/v) 덱스트란 40, 약 0.88%(w/v) 덱스트란 70, 약 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올 및 100%(v/v)까지의 D-PBS를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 액체 조성물과 생물학적 재료를 접촉시키는 단계는 15℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 37℃, 20℃ 내지 37℃ 또는 20℃ 내지 30℃의 온도에서, 예를 들어, 약 20℃에서 수행된다
특정 실시양태에서, 생물학적 재료 냉각 전의 생물학적 재료의 온도는 15℃ 내지 40℃, 15℃ 내지 37℃, 20℃ 내지 37℃, 또는 20℃ 내지 30℃, 예를 들어, 약 20℃이다.
특정 실시 예로, 상기 방법은 적어도 1분 동안, 적어도 1시간 또는 적어도 1일 생물학적 재료를 저장하는 것을 포함하고, 상기 저장은 상기 생물학적 재료의 냉각 후에 수행되고, 상기 저장은 적어도 -70℃, 적어도 -80℃, 적어도 -90℃, 적어도 -100℃, 적어도 -110℃, 적어도 -120℃, 적어도 -130℃, 적어도 140℃, 적어도 -150℃, 적어도 160℃, 적어도 -170℃, 적어도 180℃, 적어도 -190℃ 또는 적어도 -200℃, 바람직하게는 적어도 -100℃, 더욱 바람직하게는 적어도 -190℃에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 재료의 냉각 후에 생물학적 재료를 가열하는 단계를 포함한다. 생물학적 재료의 가열은 냉각, 냉동 또는 유리화된 생물학적 재료를 가열 또는 가온시키기 위해 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시 예로, 상기 가열은 직접적으로 냉각된, 바람직하게는 유리화된, 생물학적 재료를, 적어도 25℃, 적어도 26℃, 적어도 27℃, 적어도 28℃, 적어도 29℃, 적어도 30℃, 적어도 31℃, 적어도 32℃, 적어도 33℃, 적어도 34℃, 적어도 35℃, 적어도 36℃ 또는 적어도 37℃, 예를 들어 37℃의 온도를 갖는 상기 생물학적 재료를 배양하기 위한 배양 배지에 접촉하는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 예비-가온(예, 37℃) 배양 배지를 냉각된, 바람직하게는 유리화된, 생물학적 재료에 직접 첨가할 수 있다. 이어서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 동결보존용 액체 조성물은 예를 들어 원심분리에 의해 해동된 생물학적 재료로부터 실질적으로 분리될 수 있다. 이어서, 생물학적 재료를 신선한 배양 배지와 접촉시켜 배양할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "성장 배지" 또는 "배양 배지"는 세포 또는 조직의 성장을 지지하도록 설계된 고체, 액체 또는 반고체(semi-solid)를 의미한다. 성장 배지는 통상적으로 대량 영양소(예를 들어, 질소, 인, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 또는 황), 미량 영양소(예를 들어, 철, 망간, 아연, 붕소, 구리, 몰리브덴), 비타민, 아미노산, 하나 이상의 당(예를 들어, 글루코오스), 무기 염 및/또는 단백질(예를 들어, 트랜스페린)을 포함한다. 성장 배지는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 배양물의 목적(예를 들어, 분화, 팽창 또는 유지)뿐만 아니라 세포 또는 조직의 유형에 따라 달라질 수 있다. 성장 배지의 비제한적인 예는 Eagle's Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alpha modified Minimum Essential Medium (alpha-MEM), Basal Medium Essential (BME), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), BGJb medium, F-12 Nutrient Mixture (Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, Essential Modified Eagle's Medium (EMEM), RPMI-1640, Medium 199, Waymouth's MB 752/1 또는 Williams Medium E, Mesenchymal Stem Cell Basal Medium 이들의 변형 및/또는 조합을 포함한다.
본 발명자들은, 본 명세서에 기술된 바와 같은 액체 조성물이, 대조 동결보존 용액과 비교하여, 생쥐 배아와 같은 생물학적 재료의 (예를 들어, (예를 들어, 37℃) 수조에서 공기-가온 또는 가온을 포함하는) 느린-속도 가온에서 특히 유익하다는 것을 발견하였다
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 가열은, 냉각된, 바람직하게는 유리화된 생물학적 재료를, 생물학적 재료를 배양하기 위한 배양 배지와 접촉시키기 전에, 15℃ 내지 37℃(예를 들어, 약 37℃의 온도)의 온도를 갖는 수조에, 최대 10초간 노출시킴으로써, 가온하는 것을 포함한다. 상기 배양 배지는 25℃ 이상, 26℃ 이상, 27℃ 이상, 28℃ 이상, 29℃ 이상, 30℃ 이상, 31℃ 이상, 32℃ 이상, 33℃ 이상, 34℃ 이상, 35℃ 이상, 36℃ 이상 또는 37℃ 이상, 예를 들어 37℃의 온도를 갖는다
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 가열은, 냉각된, 바람직하게는 유리화된 생물학적 재료를, 생물학적 재료를 배양하기 위한 배양 배지와 접촉시키기 전에, 15℃ 내지 30℃의 온도로 공기-가온에 노출시킴으로써, 가온하는 것을 포함한다. 여기서 상기 배양 배지는 적어도 25℃, 적어도 26℃, 적어도 27℃, 적어도 28℃, 적어도 29℃, 적어도 30℃, 적어도 31℃, 적어도 32℃, 적어도 33℃, 적어도 34℃, 적어도 35℃, 적어도 36℃ 또는 적어도 37℃, 예를 들어 37℃의 온도를 갖는다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 가열은, 생물학적 재료를 25℃ 이상의 온도로 배양하기 위해 생물학적 재료를 배양 배지와 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비-침투 동결보호제로 구성된 적어도 하나의 과삼투압 용액과 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 실시 예로, 생물학적 재료의 가열은, 생물학적 재료를 적어도 25℃의 온도로 배양하기 위해 생물학적 재료를 배양 배지와 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 적어도 하나의 수크로스 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 수크로스 용액은, 바람직하게는 평형화된 염 용액에서, 더욱 바람직하게는 PBS에서, 더욱 바람직하게는 D-PBS에서, 1M, 0.75M, 0.6M, 0.5M, 0.25M, 0.2M 및/또는 0.1M 수크로스 용액이다.
특정 실시양태에서, 생물학적 재료의 가열은, 생물학적 재료를 25℃ 이상의 온도로 배양하기 위해 생물학적 재료를 배양 배지와 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 1 M, 0.75M, 0.5M 및 0.25 M 수크로스 용액과 접촉시키는 것을 포함한다
특정 실시양태에서, 본원에 교시된 바와 같은 방법은 생물학적 재료가 가열된 후(예를 들어, 가온 또는 해동된) 살아있는 채로 유지되는 것을 허용한다.
본 발명이 특정 실시 예와 관련하여 기술되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 정신 및 광범위한 범위에서 다음과 같은 모든 이러한 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
하기 실시 예는 특정 실시양태를 더욱 양호하게 예시하기 위해 제공되며, 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원은 청구항들에 의해서만 제한된다.
실시 예
실시 예 1: 본 발명의 조성물은 세포, 생식세포 및 배아를 성공적으로 동결보존할 수 있게 한다.
재료 및 방법
·동결보존 용액(CDCS) 조성물
화학적으로 정의된 동결보존 용액(CDCS)은 그의 기준 스톡 농도(l x 농축)에 대해 표 1에 나타낸 바와 같이 구성된다. 프로토콜에 따라, 이 코어 용액을 사용하여 고유 방법론적/동결생물학적 요구조건을 따르도록 희석하지 않거나 희석시킬 수 있다. 원액 내의 CDCS 성분의 각각의 양은 조건 또는 동결방지 특성을 크게 변경하지 않고 표 1 에 나타낸 범위 내에서 서로 상대적으로 변할 수 있다.
| 성분 | 최종 조성물 | 바람직한 기준 범위 |
| D-PBS 또는 삼투압 및 생리학적으로 동등한 용액 | 희석제 | 희석제 |
| 디메틸술폭시드(DMSO) | 17.7% v/v | 13.3 내지 22.1 % v/v |
| 에틸렌글리콜(EG) | 17.7% v/v | 13.3 내지 22.1 % v/v |
| 수크로스(SUC) | 22.7% w/v | 9.1 내지 30.3 % w/v |
| 덱스트란 1(D1) | 0.88% w/v | 0.2 내지 8.8 % w/v |
| 덱스트란 40(D40) | 0.88% w/v | 0.2 내지 8.8 % w/v |
| 덱스트란 70(D70) | 0.88% w/v | 0.2 내지 8.8 % w/v |
| 폴리비닐 알코올(PVA) | 0.88% w/v | 0.3 내지 3.5 % w/v |
·표준 유리화 용액(VSE) 조성물
통상적으로 사용되는 표준 배아 유리화 용액(VSE, Vanderzwalmen et al, 2013)은 다양한 CDCS 특성에 대한 비교 포인트로서 사용되어 왔다. 표 2는 CDCS 및 VSE 조성물을 비교한다. 이 기준 용액은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 상업적 용액(예를 들어, Fertipro사의 FertiVitTM)과 매우 유사하다.
| 성분 | CDCS (1x), 최종 조성물 | VSE, 최종 조성물 |
| D-PBS 또는 삼투압 및 생리학적으로 동등한 용액 | 희석제 | 희석제 |
| 디메틸술폭시드(DMSO) | 17.7% v/v | 20% v/v |
| 에틸렌글리콜(EG) | 17.7% v/v | 20% v/v |
| 수크로스 (SUC) | 22.7% w/v | 17.1% w/v |
| 덱스트란 1 (D1) | 0.88% w/v | - |
| 덱스트란 40 (D40) | 0.88% w/v | - |
| 덱스트란 70 (D70) | 0.88% w/v | - |
| 폴리비닐 알코올 (PVA) | 0.88% w/v | - |
| Ficoll 400 | - | 1% w/v |
| 소 태반 혈청(FCS) | - | 10% v/v |
| 황산 스트렙토마이신 | - | 0.005% w/v |
| 황산 카나마이신 | - | 0.01% w/v |
·CDCS의 유리화 능력의 물리적 시험
냉각 시 희석되지 않은 CDCS의 유리화 능력(즉, 결정 형성 없이 응고) 및 후속 가온 시 결정 형성의 부재 또는 형성이 물리적 시험을 사용하여 평가되었다. Vse, CDCS(-)(CDCS와 밀접한 관련이 있지만 PVA가 없는 용액, 덜 효율적인 전구체로 당사에서 개발됨) 및 CDCS를 250㎕ 정액 프렌치 빨대(Minitube ref 1340/0010)에서 주사기로 흡인하고, 이어서 그 하단부에서 플러그를 이용하여 닫았다. 빨대를 떨어뜨리고 액체 질소(LN2)에서 교반하고 이어서 37℃ 수조에서 가온하였다. 냉각 및 후속 가온 시 유리화/결정화 상태는 육안 검사에 의해 평가되었다: 유리 전이 온도에 결쳐 냉각 또는 가온된 용액은 유리화 시에 투명하고 투명한 상태를 유지하며, 결정화는 백색/육백색 양태를 유도한다.
·CDCS의 안정성 분석
CDCS는 유지될 때 안정성 검정에 제출되었다 (i) 4℃에서, (ii) 실온(22 +/- 4℃)에서, (iii) 실온에서 2주 동안 후 4℃에서 저장, (iv) 37℃에서 및 (v) 37℃에서 2주 동안 후 4℃에서 보관하고 안정성 분석을 하였다. 분취량을 제조 1일 후 (D1) 및 이후 7일(D7), D14 및 1개월(M1), 2개월(M2), 3개월(M3) 및 6개월(M6)을 포함하는 다양한 시점에서 시험하였다. 기록된 종점(endpoints)은 (i) 육안 검사 후 정상/비정상적인 양상(탁도, 침전물.) 및 (ii) 이하에서 설명하는 쥐 배아의 1단계 유리화 효율(FVB/N 변형)이었다.
·CDCS를 사용한 배아, 난모세포 및 세포의 동결보존
·
마우스 배아
·생산 및 배양
C57BL6/JRj 근친교배(Janvier Labs, France)마우스를 이 예에서 사용하였다. 수정된 난모세포는 University of Liege의 Central Mouse Facility에서 제공되었다. 두 개의 전핵과 정상적인 세포질을 가진 접합체는 추후 사용을 위해 보관하였다. 적용 가능하다면, 이들은 처리 전까지 5% C02 하에 37℃에서 수분-포화 분위기에서 M16 배지의 50㎕ 방울로 배양되었다. 2-세포 단계에서의 배아들은 유리화되거나, 동결보존되지 않은 대조군으로 유지되었다.
·유리화
배아의 유리화는 상기 개시된 CDCS 또는 VSE 중 어느 하나를 사용하는 1단계 방법을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 배아를 그들의 배양 배지로부터 수확하여 500㎕ CDCS 또는 VSE 방울로 옮겼다. 이들은 배양액의 맥석을 제거하기 위해 유리화 용액으로 수회 이동된다. 그 후, 이들은 보호 빨대 내로 삽입된 담체(VitriVet ™, vitr배지, Bregenz, Austria)에 유리화 배지 0.3 내지 1㎕에서 수확된다. 빨대를 밀봉하고 직접 넣고 LN2에서 교반하였다. 배아를 CDCS 또는 VSE로 옮겨 이들을 LN2에 넣는 것까지 60초 이상을 걸리지 않는다.
·가온
냉각 후 24시간 이상 가온하였다. Virivet ™ 담체는 여전히 LN2에 매달려 있는 동안 그의 보호 빨대부터 추출되었다. Varivet(tm) 거터는 (i) 10초 동안 공기 중에서 부드럽게 교반되고, 이어서 따뜻한(37℃) 배양 배지에 침지되거나, 그렇지 않으면 (ii) 공기-가온 단계 없이 배양 배지에 직접 침지된다.
·배양 및 종점(endpoint)
기록된 종점은 배반포 단계로의 초기 생존 및 발달이었다. 조기생존은 가온 후 1시간 동안 투명대 및 할구의 형태의 측정함으로써 평가하였다. 배반포 단계에 대한 발달을 관찰하여 5 일째에 기록하였다(D5).
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마우스 중기 2(MII) 난모세포
FVB/NRj 및 C57BL6/JRj 근친교배(Janvier Labs, France)마우스를 이 연구에 사용하였다. MII 난모세포를 수확하고, 배아와 동일한 유리화 및 가온을 적용하지만 CDCS만 사용하고 배양 배지로 직접 가온하였다. 이어서, 이들은 동결된 정자와함께 체외 수정(IVF)되었다. 수정된 난모세포를 48시간에서 5일 동안 배양하였다. 48시간 후에 얻은 2-세포 단계 배아를 배반포 단계(D5)로 계속 발달시키거나 표준 절차(Nagy A.; Nagy A.; Vintersten K., Behringer R. 2003)를 사용하여 B6CBAFl/JRj(Janvier Labs, France) 의사-임산모의 난관에 옮겼다. 성공적인 수정, 2-세포 및 배반포 단계로의 발달 및 이식 후 출생률을 종점으로 기록하였다.
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인간 배아 및 MII 난모세포
이수 배반포 단계 배아 및 인간 MII 난모세포의 유리화는 현재의 법률 및 윤리 규정을 준수하여 수행되었다. CDCS는 냉각 전에 다단계 평형 프로토콜에 따라 D-PBS의 다양한 희석 및 희석되지 않은 형태로 사용되었다. 가온 시 SUC 용액의 다단계 평형 절차를 배양 전에 적용했다.
·배반포
전통적인 절차를 사용하여 이전에 유리화 및 가온된 20개의 이수 배반포는 이어서 VitriSafe® 폐쇄 담체 시스템(Vitri배지, Austria)을 사용하여 CDCS로 재-유리화(re-vitrified)되었다. 냉각하기 전에, 배아를 CDCS의 다양한 희석액(D-PBS 중의) 및 최종적으로 비-희석된 CDCS로 평형화시켰다. 요약하면, 배반포를 50㎕의 25%(v/v) CDCS에 5분 동안 담그고, 이어서 50㎕의 50%(v/v) CDCS에 4 내지 6분 동안 담그었다. 이어서, 배반포를 약 60초 동안 100㎕ 희석되지 않은 CDCS 방울로 옮겼다. 여기에는 0.3㎕ 내지 1.0㎕ CDCS 미세액적 내에서 담체 상에 배아를 로딩하고, 보호 빨대에 삽입하고, 밀봉하고, 이를 LN2로 담그는데 필요한 시간이 포함된다.
가온을 위해, VitriSafe® 담체는 추출기 도구를 사용하여 제거되었다. 담체의 팁을 1㎖의 1M SUC 용액(D-PBS 중)에 실온에서 침지시켰다. 30초 후, 배반포를 0.75M SUC에 추가의 30초 동안 옮기고, 이어서 0.5M SUC에 1분 및 0.25M SUC에 2 분 동안 옮겼다. 최종적으로 배반포를 적당한 배양 배지로 옮겼다.
처리된 배반포의 형태학적 및 "건강" 상태를 가온 후 즉시 기록하고, 배양 중 18 시간 후에 기록하였다.
·MII 난모세포
10 MII 난모세포는 배반포과 같은 유사한 유리화 프로토콜을 겪지만, 예비-냉각 및 가온 평형 단계의 약간의 변형을 갖는다. 냉각 전에, 난모세포를 CDCS(D-PBS)의 50㎕ 방울에 순차적으로 침지시켰다: 6.25%(v/v) CDCS에서 3분, 12.5%에서 3분, 25%(v/v)에서 3분 및 50%에서 5분. 다음으로, 이들은 배반포에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 LN2에 넣기 전에 약 60초 동안 희석되지 않은 CDCS 100㎕ 방울로 옮겼다.
가온하기 위해, 담체의 팁을 1㎖의 1M SUC에 침지시키고, 배아를 1분 동안 그 용액에 옮기고, 이어서 3분 동안 0.5M SUC, 2분 동안 0.25M SUC 및 2분 동안 0.125M SUC로 옮겼다. 난모세포는 최종적으로 적절한 배양 배지로 옮겨졌다. 처리된 난모세포의 형태학적 및 "건강" 상태를 가온 후 즉시 기록하고, 배양 중 18시간 후에 기록하였다.
말 중간엽 줄기세포
·분리 및 배양
말 사체에서 분리된 중간엽 줄기세포(Prof N. Antoine, U. Liege의 EC-MSC)를 10% 소태아 혈청(Gibco) 및 1% Pen/Strep(Gibco)가 보충된 DMEM + GlutaMAX(Gibco)에서 37℃에서 5% CO2로 유지하였다. 70-80%의 포화도에서, 세포는 0.05% 트립신-EDTA(Gibco)를 사용하여 계대되었다.
·유리화 및 가온
1단계 포맷에서 유리화를 위해, 세포를 분리하고 106 세포의 분취액을 제조하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 CDCS(실온에서 미리 평형화됨) 220㎕에 재현탁시키고, 1.8㎖ 저온 바이알로 옮기고, CDCS와 세포의 첫 번째 접촉과 LN2에 침지 사이의 30초의 시간 프레임을 고려하여 교반하면서 LN2로 넣는다. 세포를 LN2 탱크에 적어도 24시간 동안 저장하였다. 각 실험에서, 비-처리된 세포 분취액을 접종하고 분석했으며, 이를 유리화되지 않은 대조군이라고 칭한다.
이어서, 저온 바이알을 LN2로부터 꺼내고, 37℃ 수조에서 보관하고, 예비-가온된(37℃) 배양 배지 1㎖를 직접 첨가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하면서 유리화된 세포를 가온하였다. 이어서, 세포 현탁액을 3㎖의 완전한 배양 배지를 포함하는 원뿔형 튜브로 옮기고, 원심분리시키고, 신선한 배지에 재현탁시키고, 6-웰 플레이트에 접종하였다.
·느린 동결(SLF) 및 해동
SLF 에 대해, 세포를 분리하여 4개의 그룹으로 균등하게 분포시켰다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 배양 배지(비-동결보존 대조군), 배양 배지 중의 10% DMSO (Ref) 또는 106 세포/㎖ 농도의 D-PBS 중의 CDCS의 25% 또는 50% 희석액으로 재현탁시켰다. 그 후, 1㎖(106 세포)의 분취액을 1.8㎖의 저온 바이알(Nunc)에 분배시키고, 이를 LN2에 저장하기 전에 80℃ 냉동고에서 Mr Frosty™(Nalgene) 장치에 밤새 두었다. 세포를 LN2 탱크에 최소 4시간 동안 보관했다. 비-처리된 세포를 접종하고 분석했으며, 이를 비-동결보존된 대조군으로서 칭한다.
저온 바이알을 LN2로부터 꺼내어 따뜻하게 하고, 37℃ 수조에서 그 하부를 가져와 보관하여, 동결된 세포를 가온하였다. 해동 직후에 배지 1㎖를 첨가하고 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 이어서, 세포 현탁액을 3㎖의 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브로 옮겼다. 각 샘플을, 배양 배지를 첨가하여 10㎖로 조정하고, 원심분리하고, 1㎖ 신선한 배지에 재현탁시키고, 6-웰 플레이트에 접종하였다.
·종점 기록
트립판 블루 배제 분석(TC20 Cell Counter, Bio-Rad)을 사용하여, 트립신화 후 탈착된 세포 상에서 해동 후 또는 계대 후(비유리화 대조군에 대해) 24시간에 세포 생존율을 평가하였다
포화도는 CKX-CCSW Confluency Checker Software(Olympus)를 갖춘 DP22 현미경 카메라를 사용하여 웰 당 5개의 랜덤 이미지를 분석함으로써 표시된 시점에서 평가되었다.
인간 유도 만능 줄기세포(hiPSCs)
·세포 및 배양의 기원
hiPSC 세포주(dkip, Prof Dr.F.Edenhofer, U.Bonn)는 CDCS를 사용하여 느린 동결을 했다. 이들은, 5% C02를 갖는 37℃에서 0.5% Pen/Strep(Gibco)보충된 Essentia 8 ™ Flex 배지(Gibco)에서, 비트로넥틴-코팅된 6-웰 세포 배양 플레이트에서 배양되었다.
·느린 동결(SLF)
SLF를 위해, 배양 플레이트를 D-PBS로 부드럽게 세정하고, ReLeSR™(StemCell Technologies)을 사용하여 웰에서 세포를 응집체로 분리하고, Essential 8™-Flex 배지에 현탁하고, 풀링하고, 3개의 그룹으로 균등하게 분배했다. 한 그룹은 어떠한 처리도 하지 않았고, 바로 배양(비-동결보존된 대조군)로 복귀했다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 CryoStor® CS10(STEMCELL Technologies) 또는 1 배양 웰/㎖에 해당하는 농도의 D-PBS 중 CDCS의 50%호 희석액에 재현탁시켰다. 이어서, 1㎖의 분취량(1 웰 내의 세포 양과 동등함)을 1.8㎖의 저온 바이알(Nunc)에 분배시키고, LN2에 저장되기 전에 80℃ 냉동고에서 Mr Frosty™(Nalgene) 장치에 넣었다. 세포를 LN2 탱크에 적어도 4시간 동안 저장하였다
·해동
이어서, 저온 바이알을 LN2로부터 꺼내어 동결된 세포를 가온하고, 37℃ 수조에서 그 하부를 가져와 보관하였다. 해동 직후에 Essential 8™ Flex 배양 배지 1㎖를 첨가하고 매우 부드럽게 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 이어서, 세포 현탁액을 3㎖의 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브로 옮겼다. 각 샘플을 배양 배지를 첨가하여 10㎖로 조정하고, 원심분리하여 1㎖의 신선한 배지에 재현탁시켰다. 각 샘플을 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트의 4 개의 웰에 접종하였다
·종점 기록
세포 생존율은 트립판 블루 배제 분석(TC20 Cell Counter, Bio-Rad)을 사용하여, 분리된 세포(StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, Gibco)에서 해동 후(또는 동결되지 않은 대조군의 경우 계대 후) 24시간 후에 평가하였다.
포화도는 CKX-CCSW Confluency Checker Software(Olympus)를 갖는 DP22 현미경 카메라를 사용하여 웰 당 5개의 무작위 이미지를 분석하여 표시된 시점에서 평가하였다.
결과
·CDCS의 유리화 능력의 물리적 시험
표 3에 나타낸 바와 같이, CDCS는 LN2에서 냉각시 어떠한 결정화를 겪지 않고 37℃ 수조에서 가온할 때 어떠한 결정화도 겪지 않는다. 동일한 표준화된 조건에서, VSE는 샘플의 절반에서 냉각 시 결정화를 겪었지만, 모든 CDCS(-) (PVA가 없는 CDCS의 전구체)샘플은 가온 시 결정화된다. 결론적으로, 기준 VSE 용액 및 CDCS(-) (PVA가 없는 CDCS) 둘 모두는 일관된 유리화를 허용하지 않으며, 비교적 높은 열 관성을 갖는 제안된 시스템에서, 냉각(VSE) 또는 가온(CDCS(-) )시 빠른 결정 형성을 허용한다. 이러한 VSE 및 CDCS(-)의 빠른 결정화는 세포에 유해한 것으로 예상된다. 따라서, CDSC는 일반적으로 추천되는 것보다 더 느린 냉각 및 가온 속도를 유발하는 조건에서 보다 강한 얼음 결정 억제 용액인 것으로 입증되는데, 이는 유명한 유리화 조성물(VSE, 그 조성은 의료 보조 출산(MAP)에 사용되는 상용 용액과 매우 유사))보다 훨씬 더 강력하다.
| 유리화 용액 | 빨대 ID | 냉각 | 가온 |
| VSE | VSE1 | V | V |
| VSE2 | C | C | |
| VSE3 | C | C | |
| VSE4 | V | V | |
| CDCS(-) | CDCS(-)1 | V | C |
| CDCS(-)2 | V | C | |
| CDCS(-)3 | V | C | |
| CDCS(-)4 | V | C | |
| CDCS | CDCS1 | V | V |
| CDCS2 | V | V | |
| CDCS3 | V | V | |
| CDCS4 | V | V |
이 표는 표준화된 물리적 유리화 테스트의 결과를 보고한다. 세 가지 유리화 용액(VSE, CDCS(-) 및 CDCS)을 흡인하고 250㎕ 프렌치 빨대에 밀봉하고 LN2로 냉각한 다음 37℃ 수조에서 가온했다. 유리화 또는 결정화된 상태는 육안 검사에 의해 냉각 및 가온 시 평가되었다. "V"는 유리화를 나타내고 "C"는 결정화를 나타낸다.
·CDCS의 안정성 분석
CDCS는 4℃, 실온, 37℃ 및 실온 또는 37℃ 및 4℃에서 추가의 저장의 조합으로 몇 주 동안 저장되었을 때, 안정성 분석을 하였다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, 어떠한 항균제의 부재에도 불구하고, 용액(탁도 또는 침전물 없음)의 육안 검사 및 배아의 유리화 효과에 의해 평가되는 바와 같이, 보관 조건에 관계없이 시간이 지남에 따라 CDCS의 눈에 띄는 변화는 관찰되지 않았다.
결론적으로, CDCS 조성물의 특성은 어떠한 항미생물제의 부재 및 불리한 온도 조건에도 불구하고, 시간이 지남에 따라 현저하게 안정적이다. 실제로, 4℃뿐만 아니라 37℃(및 또한 중간 및 혼합 온도 조건)에서 6개월 정도의 저장은 이의 광학/물리적 양상을 변경하지 않고 쥐의 배아를 유리화하는데 그의 높은 효율을 변화시키지 않는다.
| 4℃에서 저장 | ||||||
| 시점 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 | 육안 관찰 |
| D1 | 21 | 21 | 100% | 14 | 67% | OK |
| D7 | 21 | 21 | 100% | 14 | 67% | OK |
| D14 | 19 | 19 | 100% | 19 | 100% | OK |
| M1 | 20 | 20 | 100% | 19 | 95% | OK |
| M2 | 21 | 21 | 100% | 19 | 90% | OK |
| M3 | 20 | 20 | 100% | 18 | 90% | OK |
| M6 | 20 | 20 | 100% | 14 | 70% | OK |
| 실온에서 저장 | ||||||
| 시점 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 | 육안 관찰 |
| D7 | 21 | 21 | 100% | 13 | 62% | OK |
| D14 | 20 | 20 | 100% | 12 | 60% | OK |
| M1 | 21 | 21 | 100% | 16 | 76% | OK |
| M3 | 21 | 21 | 100% | 14 | 67% | OK |
| M6 | 20 | 20 | 100% | 17 | 85% | OK |
| 실온에서 (14D) 그리고 4℃에서 저장 | ||||||
| 시점 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 | 육안 관찰 |
| D14 | 21 | 21 | 100% | 13 | 62% | OK |
| M1 | 21 | 21 | 100% | 18 | 86% | OK |
| M3 | 21 | 21 | 100% | 13 | 62% | OK |
| M6 | 17 | 17 | 100% | 14 | 82% | OK |
| 37℃에서 저장 | ||||||
| 시점 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 | 육안 관찰 |
| D7 | 21 | 21 | 100% | 12 | 57% | OK |
| D14 | 21 | 20 | 95% | 14 | 70% | OK |
| M1 | 20 | 20 | 100% | 19 | 95% | OK |
| M2 | 21 | 21 | 100% | 16 | 76% | OK |
| M3 | 18 | 18 | 100% | 15 | 83% | OK |
| M6 | 20 | 20 | 100% | 20 | 100% | OK |
| 37℃에서 그리고 4℃에서 저장 | ||||||
| 시점 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 | 육안 관찰 |
| D14 | 21 | 21 | 100% | 17 | 81% | OK |
| M1 | 20 | 20 | 100% | 20 | 100% | OK |
| M3 | 12 | 12 | 100% | 11 | 92% | OK |
| M6 | 21 | 21 | 100% | 20 | 95% | OK |
이 표는 다양한 저장 조건(4℃, 실온, 실온에서 14일 동안 보관한 후 4℃, 37℃ 및 37℃에서 14일 동안 보관한 후 4℃에서 보관)에서 CDCS의 분취량에 대해 수행된 안정성 테스트의 결과를 나타낸다. 기록을 위한 시점은 용액의 제조 후 7 일(D7), 14 일(D14), 1, 2, 3 또는 6 개월(Ml, M2, M3, M6)이었다. 정상 양태를 평가하는 분취액의 육안 검사 후, 2-세포 단계에서 쥐의 FVB/N 배아의 1-단계 유리화를 위한 유리화 용액으로서 사용되었다. 각 종점에 대해, 유리화된 배아의 수, 가온 후 그들의 즉각적인 생존 및 배반포 단계에 대한 그들의 발달이 기록되었다.
·CDCS를 사용한 배아, MII 난모세포 및 세포의 동결보존
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마우스 배아
C57BL6/JRj 균주의 2-세포 단계 마우스 배아는 기준 VSE 유리화 용액 또는 희석되지 않은 CDCS를 사용하여 2개의 유리화/가온 프로토콜을 행해졌다. 간략하게, 냉각은 두 프로토콜 모두에 대해 동일한(1단계)이었고, 가온은 상이하다, 가온은 가온된 배양 배지 중에 배아를 함유하는 유리화된 액적을 직접 떨어뜨려 빠른 속도로 하거나, 배지로 침지 되기 전에 10초 동안 공기 중에서 제1 가온 단계로 인한 보다 느린 속도로 가온하였다(M&M 참조). 표 5에 나타낸 바와 같이, 느린-속도 가온 시(공기), 초기 배아 생존은 VSE(p = 0.026)보다 CDCS가 더 우수하였다.
| 처치/세션 | # 배아 | # 생존 | % 생존 | # 배반포 | % 배반포 |
| CDCS배지/1 | 19 | 13 | 68% | 8 | 42% |
| CDCS배지/2 | 36 | 34 | 94% | 28 | 78% |
| CDCS배지/전체 | 55 | 47 | 85% | 36 | 65% |
| CDCS공기/1 | 19 | 18 | 95% | 12 | 63% |
| CDCS공기/2 | 36 | 32 | 89% | 22 | 61% |
| CDCS공기/전체 | 55 | 50a | 91% | 34 | 62% |
| VSE배지/1 | 20 | 13 | 65% | 5 | 25% |
| VSE배지/2 | 36 | 32 | 89% | 25 | 69% |
| VSE배지/전체 | 56 | 45 | 80% | 30 | 54% |
| VSE공기/1 | 19 | 11 | 58% | 6 | 32% |
| VSE공기/2 | 37 | 31 | 84% | 26 | 70% |
| VSE공기/전체 | 56 | 42b | 75% | 32 | 57% |
| 대조군/1 | 16 | 16 | 100% | 11 | 69% |
| 대조군/2 | 24 | 24 | 100% | 23 | 96% |
| 대조군/전체 | 40 | 40 | 100% | 34 | 85% |
이 표는 C57BL6/JR/마우스 2-세포 단계 배아의 유리화 및 가온 결과를 나타낸다. 동결보존되지 않은 대조군과 함께, 2개의 개별적인 실험이 수행되었다(세션 1 및 2). CDCS를, 배양 배지에 배아를 직접 담그는 것에 가온하거나 공기 중으로 느린 속도로 가온한 다음 배지(공기)에 침지한 다음 1단계 유리화 프로토콜에서 VSE와 비교하였다. 시험에 제출된 것은 배아의 수(# 배아) 및 처리에 살아 남은 것(# 생존), D5에서 배반포 단계로 발달한 것((# 배반포)이었다. 관련 있는 경우, 생존 및 발달 값은 카이 자승 검증(1 dfi)를 사용하여 서로 비교된 첨자에 영향을 받았으며, 이에 상응하는 P값은 ab:0.026 이었다.
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마우스 MII 난모세포
C57BL6/JRj 및 FVB/NRj 균주의 마우스는 희석되지 않은 CDCS로 1단계 유리화되었다. 그들은 이후에 시험관 내에서 냉동 정자로 수정되었고 시험관 내에서 배반포 단계로 발달하도록 허용하거나 생체 내 발달을 모니터하기 위해 가 임신한 산모로 옮겨졌다(종료점 = 살아있는 신생아의 출생). 표 6에 나타낸 바와 같이, CDCS를 사용한 난모세포의 유리화는 효율적인 IVF 뿐만 아니라, 통상적인 유리화 프로토콜로 관찰되는 것(F.J. Ectors, personal communication)과 유사한 속도로 결과 배아의 시험관 내 및 생체 내 발달을 가능하게 한다.
| 처치/ | 난모 세포 |
접합자 | 2 세포 | 배반포 | 신생아 | ||||||
| strain | # | # | % | # | % | # start. | # | % | # transf. | # | % |
| C57BL6/JRj | 382 | 362a | 95% | 191c | 50% | 105 | 85e | 81% | 50 | 29g | 58% |
| NV 대조군 | 466 | 447b | 96% | 310d | 67% | 132 | 102f | 77% | 65 | 32h | 49% |
| FVB/NRj | 414 | 337i | 81% | 230k | 56% | 124 | 69m | 56% | 80 | 29o | 36% |
| NV 대조군 | 514 | 501j | 97% | 400l | 78% | 185 | 163n | 88% | 65 | 31p | 47% |
이 표는 CDCS로 1-단계-유리화된 마우스 난모세포의 IVF에 의해 생성된 배아의 C57BL6/JRJ 및 FVB/NRj 발달의 결과를 나타낸다. 비-유리화(NV) 대조군은 신선한 비-유리화된 난모세포와 동일한 방식으로 제조하였다. 시험에 제출된 난모세포의 수(# 난모세포)는 생성된 접합체(# 접합체) 및 2-세포 단계 배아(# 2 세포)와 함께 표시된다. 일부 2-세포 단계 배아를 배양(# start)에 유지하여 배반포 단계(# 배반포)에 대한 발달을 평가하거나, 또는 형질전환(# transf)하여 생성된 신생아(# 신생아)의 수를 평가하였다. 난모세포의 시작 수에 대한 모든 해당 백분율이 표시된다. 5분의 출발 수에 대한 모든 상응하는 %가 표시된다. 난모세포 유리화 후 발달 값은 NV 대조군과 비교되었고, 카이 자승 검증(1 dfi)를 사용하여 서로 비교된 첨자에 영향을 받았으며, 이에 상응하는 P값은 ab: 0.423; cd: 1.121 x 10-6; ef: 0.490; gh: 0.350; ij: 1.987 x 10-16; kl: 5.153 x 10-13; mn: 1.002x 10-10; op: 0.164로 계산되었다.
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인간 배반포
표 7에 나타낸 바와 같이, 표 7에서 볼 수 있듯이 희석 및 희석되지 않은 CDCS 분취액이 이수성 배반포를 유리화하기 위한 다단계 절차에 사용되었다. 20개의 배아에서 시작하여 18개 및 17개는 각각 가온 직후 및 18시간 배양 후에 건강하고 온전한 것으로 나타났다.
| 프로토콜 (인간 D5 이수성 배반포) | ||||
| 냉각 | ||||
| D-PBS 중 CDCS (%) | 25 | 50 |
||
| 노출 시간(분) | 4 내지 5 | 4 |
||
| 가온 | ||||
| HTF/HSA 중 SUC(8/2; M) | 1 | 0.75 | 0.5 | 0.25 |
| 노출 시간(분) | 0.5 | 0.5 | 1 | 2 |
| 결과 (인간 D5 이수성 배반포 | ||||
| 전체 처리된 수 | 가온 후 시간에 생존 | |||
| 20 | t=0 | t=18시간 | ||
| 18 온전 | 17 온전 | |||
이 표는 CDCS 희석액(상단 프레임)을 사용한 냉각 프로토콜과 SUC를 사용한 가온 프로토콜을 나타낸다. CDCS의 희석은 %(v/v)로 표시되고 SUC 함량은 몰 농도(M)로 표시된다. HTF는 배아용 배양 배지이고 HSA는 Human Serum Albumin의 약자이다. 가온 직후 및 18시간 배양 후 배반포 생존/온전성은 아래쪽 프레임에 표시된다.
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인간 MII 난모세포
표 8에 나타낸 바와 같이, 희석 및 희석되지 않은 CDCS 분취액이 인간 MII 난모세포를 유리화하기 위해 다단계 과정에 사용되었다. 연구에 제출된 모든 10 난모세포는 가온 및 18 시간 배양 후 각각 건강하고 온전하게 나타났다.
| 프로토콜 (인간 MII 난모세포) | |||||
| 냉각 | |||||
| D-PBS 중 CDCS (%) | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 | 100 |
| 노출 시간(분) | 3 | 3 | 3 | 5 | 1 |
| 가온 | |||||
| HTF/HSA 중 SUC(8/2; M) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.125 | |
| 노출 시간(분) | 1 | 3 | 2 | 2 | |
| 결과 (인간 MII 난모세포) | |||||
| 전체 처리된 수 | 가온 후 시간에 생존 | ||||
| 10 | t=0 | t=18 hours | |||
| 10 온전 | 10 온전 | ||||
이 표는 CDCS 희석액(상단 프레임)을 사용한 냉각 프로토콜과 SUC를 사용한 가온 프로토콜을 나타낸다. CDCS의 희석은 %(v/v)로 표시되고 SUC 함량은 몰 농도(M)로 표시된다. HTF는 배아용 배양 배지이고 HSA는 인간 혈청 알부민의 약자이다. 가온 직후 및 18시간 배양 후 난모세포 생존/온전성은 아래쪽 프레임에 표시된다.
·
말 중간엽 줄기세포
·1단계 유리화 및 가온
1단계 유리화 후 1단계 가온 과정을 저온 바이알에서 CDCS를 사용하여 EC-MSC 상에서 수행하였다. 106개의 세포의 20 분취량은 17개의 비-유리화 대조군과 함께 유리화/가온 과정을 거쳤다. 유리화된 샘플의 세포 생존율 및 포화도(생존력 및 증식능의 복합 지표) 값 대조군과 매우 유사하지만(도 1), 생존력은 아마도 결과의 높은 반복성(감소된 감소)과 조작 과정 자체 동안 피할 수 없는 세포 손실로 인해 통계적으로 달랐다. 또한, CDCS를 이용한 1단계 유리화 후 또는 비유리화 대조군으로서 EC-MSC 배양물의 형태학적 측면들은 구별되지 않는다(도 2).
·느린 동결 및 해동
SLF는 2x 및 4x 희석된 CDCS 뿐만 아니라 통상적으로 사용되는 기준 방법(10% DMSO, v/v)을 사용하여 EC-MSC 상에서 수행되었다. 도 3은 두 CDCS 희석액이 모두 참조 방법만큼 효율적이며, 가온 후 24시간 동안 동결보존되지 않은 세포와 거의 동일한 세포 생존율을 나타냄을 보여준다. 모든 3개의 처리가 유사한 결과를 제공하는 세포 포화도에 대해 동일하게 적용하여, 비-동결보존된 세포와 비교하여 대략 1 일 정도의 포화 지연을 나타낸다.
·
인간 유도 만능 줄기세포(hiPSCs)
SLF는 2x 희석된 CDCS 및 상용 최적화 용액(CryoStor® CS10)을 사용하여 hiPSCs 상에서 수행되었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 희석된 CDCS를 이용한 세포 생존율은, 해동 후 24시간, 29.6%이고, 통계적으로 다르지만 CryoStor CS10(41.8%)를 사용한 후와 동일한 차수이다. 또한, 포화도는 시간(1 내지 7일)을 따라 유사하게 유지되어, 5일째에 동결보존되지 않은 세포 수준에 도달한다.
본 명세서에 제공된 결과는 본 발명의 조성물이 다양한 장치를 사용하고 희석되거나 희석되지 않은 형태로 다양한 방법에 따라 인간을 포함한 다양한 유기체의 살아있는 세포, 배아 및 생식세포를 동결보존하기 위한 효율적이고 안정적이며 생물학적으로 안전하고 재현 가능한 용액을 제공한다는 것을 입증한다.
실시 예 2: 본 발명의 조성물(CDCS)은 Refl 및 Ref2 용액보다 쥐의 배아의 보다 효율적인 동결보존을 가능하게 한다.
재료 및 방법
·동결보존 용액 조성물
화학적으로 정의된 동결보존 용액(CDCS)은 그의 기준 스톡 농도(l x 농축)에 대해 표 1에 나타낸 바와 같이 구성된다. 프로토콜에 따라, 이 핵심 용액을 희석하지 않거나 희석하여 사용하여 고유의 방법론적/냉동 생물학적 요구조건을 해결할 수 있다. 희석되지 않은 CDCS 성분의 각각의 양은 상태 또는 동결 보호 특성을 크게 변경하지 않고 표 1에 표시된 범위 내에서 서로 상대적으로 변할 수 있다.
기준 동결보존 용액 1(본원에서 "Refl 용액"로도 지칭됨)은 표 9에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 국제 특허 출원 WO 2010/046949 A1에 기술된 동결보존 용액을 지칭한다.
| 성분 | 농도 |
| 에틸렌글리콜 | 7.5% |
| DMSO | 7.5% |
| 수크로스 | 0.5M |
| PVA | 0.1% |
| 피콜 | 1% |
| 히알루로난 | 0.05% |
| HEPES-완충 배양 용액에서 | |
기준 동결보존 용액 2(본원에서 "Ref2 용액"로도 지칭됨)은 표 10에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 "Lopez M. et al, Chemically defined and xeno-free cryopreservation of human adiose-derived stem cells, 2016, PLOS ONE, vol. 11(3): 1-15" 에 기재된 용액을 지칭한다.
| 성분 | 농도 |
| 에틸렌글리콜 | 3.5% |
| DMSO | 3.5% |
| 다음을 포함하는 HEPES-완충 배양 배지에서 | |
| 트레할로스 | 0.25M |
| PVA | 2% |
| 피콜 | 5% |
| EGTA | 0.1mM |
·유리화 능력의 물리적 시험
냉각시 CDCS, Refl 용액 및 ref2 용액의 유리화 능력(즉, 결정 형성 없이 고화) 및 후속 가온 시 결정 형성의 부재 또는 형성은 물리적 시험을 사용하여 평가되었다. CDCS, Refl 용액 또는 Ref2 용액은 250㎖ 프렌치 빨대(Minitube ref 13407/0010)에 담긴 주사기로 흡인하고, 이어서 그 하단부에서 플러그를 이용하여 폐쇄하였다. 빨대를 떨어뜨리고 액체 질소(LN2)에서 교반하고 이어서 37℃ 수조에서 가온하였다.
·마우스 배아
FVB/N x CD1 마우스를 이 예에서 사용하였다. 수정된 난모세포는 University of Liege의 Central Mouse Facility에서 제공되었다. 2개의 전핵과 정상적으로 보이는 세포질을 갖는 접합체를 추가의 사용을 위해 보관하였다. 적용 가능하다면, 이들은 처리 전까지 5% C02 하에 37℃에서 수분-포화 분위기에서, M16 배지 50㎕의 방물로 배양되었다. 배반포 단계(발달 ~ 5일)에서의 배아 유리화/가온 공정에 제출되었다.
·유리화 및 가온
배아의 유리화는 전술한 CDCS, Refl 용액 또는 Ref2 용액 (이하, "용액"이라 함)을 사용하는 1 단계 방법을 사용하여 수행하였다.
·빨대의 전-로딩(Pre-loading)
0.25ml 프랑스 빨대(CryoBioSystem)를 배아를 유리화하기 위한 담체로서 사용하였다.
빨대는 그 면(cotton) 플러그 측에서 1㎖ 주사기에 연결된다. 10% 태아 소 혈청(Gibco)(이하 DPBS-F10라 함)으로 보충된 DPBS(Gibco)50 밀리미터(mm)를 로딩하고, 이어서 10mm의 공기를 흡인한다. 충전된 빨대는 추가적인 사용(배아의 로딩)까지 실온에서 수평으로 배치된다.
·배아 컨디셔닝 및 냉각
요약하면, 최대 5 배아의 그룹은 그들의 배양 배지로부터 채취되어 500㎕ 용액 방울로 전달된다. 이들은 용액으로 수회 이동하여 배양 배지의 맥석을 제거한다. 그 후, 이들은 수확되고 50㎕의 용액 방울로 전달된다. 배아를 10mm 용액 칼럼과 함께 빨대의 흡입에 의해 로딩한 후, 10mm의 공기, 마지막으로, DPBS-F10으로 사전-로딩된 DPBS-F10 칼럼으로 습윤될 때까지 로딩한다. 빨대를 밀봉하고 직접 담그고 액체 질소(LN2)에서 교반하였다. 배아를 용액으로 옮기는 것부터 LN2에 넣는 것까지 60초 이상 걸리지 않는다.
·배아 가온 및 배양
냉각 후 24시간 이상 가온하였다. 빨대를 LN2로부터 꺼내어 공기 중에서 5초 동안 따뜻하게 하고 37℃ 수조에서 5초 동안 더 담근다. 빨대를 닦아내고 그 밀봉된 끝 부분에서 가위를 사용하여 절단한다. 빨대 내용물을, 면 플러그를 밀어 금속 막대로 실온에서 800㎕ DPBS-F10 방울로 방출한다. 배아를 헹구고 수확하고 또 다른 200㎕ DPBS-F10 방울로 최종 세척을 위해 옮겼다. 헹굼 후, 배아를 추가 분석이 될 때까지 5% C02하에 37℃에서 수분-포화 분위기에서 50㎕의 M16 배지로 옮겼다.
·종점 기록
유리화 가능성의 물리적 시험에 있어서, 냉각 및 후속 가온 시에 용액의 유리화/결정화 상태는 육안 검사에 의해 평가된다: 유리화된 용액은 깨끗하고 투명한 반면, 결정화는 백색/우유 양태를 유도한다.
배아 유리화 분석에 있어서, 기록된 종점은 가온 후 24 및 48시간 배양에서 생존, 48시간 동안 투명대에서 부화였다. 생존은 투명대와 할구의 형태를 평가하여 평가되었다.
·결과
·용액의 유리화 능력의 비교
표 11에 나타낸 바와 같이, CDCS 는 LN2에서 냉각시 어떠한 결정화를 겪지 않고 37℃ 수조에서 가온할 때도 어떠한 결정화도 겪지 않는다. 동일한 표준화된 조건에서, Refl 용액 및 Ref2 용액은 냉각시 및 가온시 결정화를 겪는다. 결론적으로, Refl 용액 및 Ref2 용액은 일관된 유리화를 허용하지 않으며, 비교적 높은 열 관성을 갖는 제안된 시스템에서 냉각 및 보온 시에 빠른 결정 형성을 허용한다. Refl 용액 및 Ref2 용액의 신속한 결정화는 세포에 유해한 것으로 예상된다. 따라서, 따라서 CDSC는 일반적으로 권장되는 것(~20.000℃/분)보다 느린 냉각 및 가온 속도(1.000℃/분)를 유발하는 조건에서 강력한 얼음 결정 억제 용액인 것으로 입증되었다.
| 냉동보존 용액 | 빨대 ID | 냉각 | 가온 |
| Ref1 용액 | Ref1-1 | C | C |
| Ref1-2 | C | C | |
| Ref1-3 | C | C | |
| Ref1-4 | C | C | |
| Ref2 용액 | Ref2-1 | C | C |
| Ref2-2 | C | C | |
| Ref2-3 | C | C | |
| Ref2-4 | C | C | |
| CDCS | CDCS1 | V | V |
| CDCS2 | V | V | |
| CDCS3 | V | V | |
| CDCS4 | V | V |
이 표는 표준화된 물리적 유리화 테스트의 결과를 보고한다. 3가지 유리화 용액(Ref1 용액, Ref2 용액 및 CDCS)을 흡인하고 250㎕ 프렌치 빨대에 밀봉하고, LN2로 냉각한 다음 이어서 37℃ 수조에서 가온하였다. 유리화 또는 결정화된 상태는 육안 검사에 의해 냉각 및 가온 시 평가되었습니다. "V"는 유리화를 나타내고 "C"는 결정화를 나타낸다.
·배아 유리화 분석
표 12에 보고된 결과에서, 비교적 높은 열 관성을 가진 시스템에서 1단계 유리화 절차를 사용하면 CDCS가 Ref1 및 Ref2 용액보다 훨씬 더 나은 생존 및 부화율을 보장한다는 것이 분명해 보인다
| 가온 24시간 후 분석 | 가온 48시간 후 분석 | |||
| 처리 | # 배아 | # 생존 % 생존 | # 생존 % 생존 | #부화 %부화 |
| CDCS | 143 | 75a 52% | 71d 50% | 12g 8% |
| Ref1 용액 | 137 | 2b 1% | 0e 0% | 0h 0% |
| Ref2 용액 | 140 | 2c 1% | 0f 0% | 0i 0% |
이 표는 동결보존되지 않은 대조군과 함께 수행된 FVB/NxCD1 마우스 배반포 단계 배아(D5) 유리화 및 가온의 결과를 나타낸다. 1단계 빨대 내부 유리화 프로토콜에서, 배아를 배양 배지로 직접 배출하여 가온하는 것에 의해 CDCS를 Refl 용액 및 Ref2 용액과 비교하였다. 시험으로 제출된 배아의 수는 가온 후 24시간 및 48시간에서 처리에서 생존한 것(# 생존), 가온 후 48시간에서 부화한 배반포 단계로 발달(# 부화)한 것을 함께 표시한다(# 배아). 다른 첨자가 있는 값을 서로 비교하고 해당 P 값을 카이 제곱 테스트를 사용하여 계산했다. a-b: 1.3 x 10-21; a-c: 5.3 x 10-22; d-e: 1.3 x 10-21; d-f: 5.8 x 10-22; g-h:5.3 x 10-4; g-i: 4.6 x 10-4.
Claims (15)
- - 디메틸술폭사이드(DMSO) 및 디메틸포름아미드(DMF)로부터 선택된 극성 비양자성 용매,
- 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 볼레미톨, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 및 펜탄올로부터 선택된 1가 또는 다가 알코올;
- 수크로스, 트레할로스, 락툴로스, 멜리비오스, 락토비오네이트(lactobionate), 라피노스 및 셀룰로오스, 바람직하게는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된 비분지된 다당류;
- 덱스트란; 및
- 폴리비닐 알코올
을 포함하는 생물학적 재료를 동결보존하기 위한 액체 조성물. - 제1항에 있어서, DMSO, 에틸렌글리콜, 수크로스, 덱스트란 및 폴리비닐 알코올을 포함하는 생물학적 재료의 동결보존용 액체 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물이 실질적으로 동일한 양의 DMSO 및 에틸렌글리콜, 및 덱스트란의 적어도 8배인 수크로스의 농도를 포함하는 액체 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
- 적어도 0.8%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 적어도 0.8%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 적어도 0.5%(w/v)의 비분지된 다당류;
- 적어도 0.037%(w/v)의 덱스트란;
- 적어도 0.015%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및
- 바람직하게는 pH 7.2-7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제
를 포함하는 액체 조성물, - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 극성 비양성자성 용매;
- 13.0 내지 23.0%(v/v), 바람직하게는 17.7%(v/v)의 1가 또는 다가 알코올;
- 9.0 내지 31.0%(w/v), 바람직하게는 22.7%(w/v)의 비분지된 다당류;
- 0.60-22.0%(w/v), 바람직하게는 2.64%(w/v)의 덱스트란;
- 0.30 내지 4.0%(w/v), 바람직하게는 0.88%(w/v)의 폴리비닐 알코올; 및/또는
- 바람직하게는 pH 7.2 내지 7.4인, 100%(v/v)까지의 희석제,
또는 상기 희석제 중의 상기 액체 조성물의 희석을 포함하는 액체 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 15%(v/v)의 극성 비양성자성 용매, 15%(v/v) 이상의 1가 또는 다가 알코올, 15%(w/v) 이상의 비분지형 다당류, 2%(w/v)의 덱스트란 및 약 0.9%(w/v) 폴리비닐알코올을 포함하는 액체 조성물.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석제가 평형 염액, 바람직하게는 인산염 완충 식염수(PBS)인 액체 조성물.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란이 덱스트란 1, 덱스트란 40 및/또는 덱스트란 70 중 하나 이상을 포함하는 액체 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
- 17.7%(v/v) DMSO;
- 17.7%(v/v) 에틸렌글리콜;
- 22.7%(w/v) 수크로스;
- 0.88%(w/v) 덱스트란 1;
- 0.88%(w/v) 덱스트란 40;
- 0.88%(w/v) 덱스트란 70; 및
- 0.88%(w/v) 폴리비닐 알코올
을 포함하는 액체 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 조성물이 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하지 않는 액체 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 재료의 동결보존을 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 액상 조성물의 용도에 있어서, 상기 동결은 동결 과정, 다단계 유리화 과정 또는 1단계 유리화 과정에 의해 바람직하게 수행되는 것을 특징으로 하는, 용도.
- - 생물학적 재료를 제공하는 단계;
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 액상 조성물과 생물학적 재료를 접촉시키는 단계;
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 액체 조성물에서 생물학적 재료를 냉각 및/또는 가열하는 단계
를 포함하는 생물학적 재료를 보존하기 위한 방법. - 제12항에 있어서, 생물학적 재료를 상기 조성물과 접촉시키기 전에, 생물학적 재료를 제5항, 제6항 또는 제9항 또는 그 종속항의 조성물의 적어도 하나의 희석과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 냉각은 생물학적 재료의 동결 또는 생물학적 재료의 유리화, 바람직하게는 생물학적 재료의 1단계 또는 다단계 유리화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 재료가 줄기세포, 생식세포 및 배아의 군으로부터 선택되는 것인 용도 또는 방법.
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