BR112021015654A2 - Composições para criopreservação de um material biológico - Google Patents
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Abstract
composições para criopreservação de um material biológico. o presente pedido divulga uma composição líquida para criopreservação de um material biológico compreendendo um solvente polar aprótico, um álcool monohídrico ou polihídrico, um polissacarídeo não ramificado, um polissacarídeo ramificado; e álcool polivinílico. além disso, são fornecidos os usos da referida composição líquida para criopreservação de um material biológico e métodos para preservar um material biológico usando a referida composição líquida.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÕES PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE UM MATERIAL BIOLÓGICO”
[001] A presente invenção se refere a composições líquidas para criopreservação de um material biológico, métodos empregando essas composições e seus usos. A presente invenção é particularmente útil para a criopreservação de células, gametas e embriões humanos.
[002] A criopreservação está entre as ferramentas mais poderosas e eficientes para preservar indefinidamente a genética de células, embriões ou gametas economicamente, terapeuticamente ou cientificamente importantes. Isso também se aplica às tecnologias de reprodução humana assistida (TRA). Como a água é o principal componente da célula, sua solidificação deve ser rigidamente controlada durante o resfriamento e o aquecimento subsequente para evitar a formação intracelular de cristais de gelo. Isso teria efeitos destrutivos nas organelas e em todos os sistemas de membrana, resultando em alterações celulares deletérias e morte.
[003] Dois grupos principais de métodos estão atualmente em uso para a criopreservação de material biológico vivo: congelamento lento (SLF) e vitrificação (VIT). Os procedimentos VIT foram introduzidos como uma alternativa ao SLF para reduzir a probabilidade de formação de cristais de gelo intracelulares (Rall e Fahy 1985).
[004] VIT foi demonstrado como mais eficiente do que SLF em TRA humana, particularmente para criopreservação de oócitos metafase II (MII) (Kuwayama et al. 2005) e embriões em vários estágios de desenvolvimento (Rienzi et al. 2017; Vanderzwalmen et al. 2012), estando agora como o padrão ouro para criopreservação em TARV.
[005] Isso é igualmente verdadeiro para embriões animais e particularmente murinos, onde VIT demonstrou melhor preservar a integridade da cromatina e o status de bioenergia (Somoskoi et al. 2015), induzindo menor ingresso intracelular de crioprotetores (CPs) (Vanderzwalmen et al.
2013) e, finalmente, produzem melhor sobrevivência e desenvolvimento de embriões do que SLF (Zander-Fox et al.
2013).
[006] No entanto, os protocolos VIT atuais sofrem de complexidade metodológica, multiplicidade de protocolos e uso frequente de componentes quimicamente indefinidos, muitas vezes originários de fluidos humanos ou animais.
Como consequência, a estabilidade dos componentes, a segurança biológica, a reprodutibilidade e a padronização dos processos ficam comprometidas.
[007] Em vista disso, há uma necessidade de composições adicionais e/ou melhoradas para vitrificação -
e também congelamento lento - de células com alta eficácia, segurança biológica e reprodutibilidade.
[008] Os presentes inventores desenvolveram uma composição líquida quimicamente definida única para criopreservação de um material biológico. Os inventores constataram que a combinação específica de reagentes permite um efeito sinérgico desses reagentes, resultando em características ótimas para uso em criopreservação. Mais particularmente, o uso das composições da invenção garante uma melhor sobrevivência e taxa de eclosão do que as soluções de criopreservação conhecidas.
[009] Esta composição líquida permite criopreservação eficiente, biologicamente segura e reproduzível (por exemplo, vitrificação) de vários tipos de material biológico, abrangendo - mas não se limitando a - células- tronco, embriões e gametas, por vários tipos de procedimentos de criopreservação (por exemplo, congelamento lento, uma etapa vitrificação, vitrificação em várias etapas).
[0010] Consequentemente, um primeiro aspecto fornece uma composição líquida para criopreservação de um material biológico compreendendo um solvente polar aprótico, um álcool monohídrico ou polihídrico e um álcool polivinílico.
Em modalidades particulares, a composição compreende:
- um solvente polar aprótico selecionado a partir de dimetilsulfóxido (DMSO) e dimetilformamida (DMF) - um álcool monohídrico ou polihídrico selecionado a partir de etilenoglicol, propilenoglicol, glicerol, eritritol, sorbitol, manitol, xilitol, volemitol, metanol, etanol, isopropanol, butanol e pentanol; - um polissacarídeo não ramificado selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, trealose, lactulose, melibiose, lactobionato, rafinose e celulose, de um modo preferido sacarose; - um polissacarídeo ramificado selecionado a partir do grupo que consiste em dextrano, pectina, ficoll e amido, de um modo preferido dextrano; e - álcool polivinílico.
[0011] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende DMSO, etilenoglicol, sacarose, dextrano e álcool polivinílico.
[0012] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende quantidades substancialmente iguais de DMSO e etilenoglicol e uma concentração de sacarose que é pelo menos 8 vezes a de dextrano.
[0013] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende: - pelo menos 0,8% (v/v) de um solvente polar aprótico; - pelo menos 0,8% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico; - pelo menos 0,5% (p/v) de polissacarídeo não ramificado; - pelo menos 0,037% (p/v) de um polissacarídeo ramificado; - pelo menos 0,015% (p/v) de álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de preferência com pH 7,2 a 7,4.
[0014] Em uma modalidade preferida, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende: - pelo menos 0,8% (v/v) de um solvente polar aprótico; - pelo menos 0,8% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico; - pelo menos 0,5% (p/v) de polissacarídeo não ramificado; - pelo menos 0,037% (p/v) de dextrano; - pelo menos 0,015% (p/v) de álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4.
[0015] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende: - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v) de um solvente polar aprótico; - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v), de um álcool monohídrico ou polihídrico; - 9,0 a 31,0% (p/v), de um modo preferido 22,7% (p/v), de um polissacarídeo não ramificado; - 0,60 a 22,0% (p/v), de um modo preferido 2,64% (p/v), de um polissacarídeo ramificado; - 0,30 a 4,0% (p/v), de um modo preferido 0,88% (p/v), de álcool polivinílico; e/ou - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4; ou uma diluição da referida composição líquida no referido diluente.
[0016] Em uma modalidade preferida, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende: - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v) de um solvente polar aprótico; - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v), de um álcool monohídrico ou polihídrico; - 9,0 a 31,0% (p/v), de um modo preferido 22,7% (p/v), de um polissacarídeo não ramificado; - 0,60 a 22,0% (p/v), de um modo preferido 2,64%
(p/v), de dextrano; - 0,30 a 4,0% (p/v), de um modo preferido 0,88% (p/v), de álcool polivinílico; e/ou - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4; ou uma diluição da referida composição líquida no referido diluente.
[0017] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende pelo menos 15% (v/v) de um solvente polar aprótico, pelo menos 15% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico, pelo menos 15% (p/v) de um polissacarídeo não ramificado, pelo menos 2% (p/v) de um polissacarídeo ramificado e cerca de 0,9% (p/v) de álcool polivinílico.
[0018] Em uma modalidade preferida, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende pelo menos 15% (v/v) de um solvente polar aprótico, pelo menos 15% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico, pelo menos 15% (p/v) de um polissacarídeo não ramificado, pelo menos 2% (p/v) de dextrano e cerca de 0,9% (p/v) de álcool polivinílico.
[0019] Em modalidades particulares, o referido diluente é uma solução salina balanceada, de um modo preferido solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0020] Em modalidades particulares, dextrano compreende um ou mais de Dextrano 1, Dextrano 40 e Dextrano
70.
[0021] Em modalidades particulares, a composição líquida para criopreservação de um material biológico compreende: - 17,7% (v/v) de DMSO, - 17,7% (v/v) de etilenoglicol, - 22,7% (w/v) de sacarose, - 0,88% (p/v) de dextrano 1 (D1) - 0,88% (p/v) de dextrano 40 (D40) - 0,88% (p/v) de dextrano 70 (D70); e - 0,88% (p/v) de álcool polivinílico.
[0022] Em modalidades particulares, a composição líquida não compreende proteínas, polipeptídeos ou peptídeos.
[0023] Um outro aspecto fornece o uso da composição líquida, conforme ensinado neste documento, para a criopreservação de um material biológico.
[0024] Em modalidades particulares, a criopreservação do material biológico é realizada por um procedimento de congelamento, um procedimento de vitrificação de várias etapas ou um procedimento de vitrificação de uma etapa.
[0025] Um outro aspecto fornece um método para preservar um material biológico que compreende as etapas de - fornecer um material biológico;
- contatar o material biológico com a composição líquida conforme ensinado neste documento; - resfriar e/ou aquecer o material biológico na composição líquida, conforme ensinado neste documento. Em modalidades particulares, o método compreende ainda contatar o material biológico com pelo menos uma diluição da composição líquida como ensinado neste documento, antes de contatar o material biológico com a referida composição.
[0026] Em modalidades particulares, o referido resfriamento compreende o congelamento do material biológico ou a vitrificação do material biológico.
[0027] Em modalidades particulares, o referido método compreende vitrificação em uma ou várias etapas do material biológico.
[0028] Em modalidades particulares, o material biológico é selecionado a partir do grupo de células- tronco, gametas e embriões.
[0029] A Figura 1 representa a viabilidade e a confluência das células-tronco mesenquimais isoladas de cadáveres equinos (EC-MSCs) após vitrificação em uma etapa usando a composição líquida (também referida aqui como solução de criopreservação (CDCS)), conforme ensinado neste documento. A: Viabilidade celular de EC-MSCs 24h pós- aquecimento (amostras vitrificadas: média = 87,9%) ou pós-
passagem (amostras não vitrificadas: média 94,5%) determinada pelo ensaio de exclusão com azul de tripano. Os dados representam a média + desvio padrão (DP) de 15 e 20 amostras (não vitrificadas e vitrificadas, respectivamente) de 5 experimentos independentes. (Teste de Mann-Whitney: P < 0,001); B a F: Comparação da confluência de EC-MSCs, refletindo o número de células viáveis, bem como sua capacidade de proliferar, entre amostras vitrificadas e não vitrificadas em 5 experimentos independentes. Os pontos de dados representam a média ± DP; o número de amostras em cada grupo é indicado entre colchetes.
[0030] A Figura 2 representa a morfologia de EC-MSCs vitrificadas e não vitrificadas após 3 dias de cultura.
Lado esquerdo: controles não vitrificados; lado direito: EC-MSCs vitrificadas usando a composição de CDCS como ensinado neste documento seguindo o método de uma etapa.
Barra de escala: 50 m.
[0031] A Figura 3 representa a viabilidade e a confluência de EC-MSCs após congelamento lento usando 2x (isto é, diluição de 50%) e 4x (isto é, diluição de 25%) de solução estoque de CDCS diluída. A: Viabilidade celular de EC-MSCs 24h pós-descongelamento (amostras criopreservadas) ou pós-passagem (amostras não criopreservadas) (média de 93,7%, 86,8%, 90,6% e 93% para controle não criopreservado, método de referência (Ref), 50% de amostras de CDCS e 25%
de CDCS, respectivamente) determinado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Os dados representam a média + DP de 5 amostras (teste de Mann-Whitney: **P < 0,01; ns: não significativo); B: Comparação da confluência de EC- MSCs, refletindo o número de células viáveis, bem como sua capacidade de proliferar, entre o método de congelamento de referência (Ref), 2x e 4x de CDCS diluídos (50% e 25%, respectivamente) e amostras não criopreservadas. Os pontos de dados representam a média ± DP; o número de amostras em cada grupo é indicado entre colchetes.
[0032] A Figura 4 representa a viabilidade e a confluência de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) após congelamento lento usando CDCS. A: Viabilidade celular de hiPSCs 24h após o descongelamento (amostras criopreservadas) ou pós-passagem (amostras não criopreservadas) determinada pelo ensaio de exclusão com azul de tripano. Os dados representam a média + DP de 6 a 7 amostras de 2 experimentos independentes; (Teste de Mann- Whitney: *P < 0,05, **P < 0,01) B: Exemplo representativo que ilustra a comparação da confluência de hiPSCs entre amostras congeladas e não congeladas. Os pontos de dados representam a média ± DP; o número de amostras em cada grupo é indicado entre colchetes.
[0033] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes singulares e plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[0034] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido de", conforme usados neste documento, são sinônimos de "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém" e são inclusivos ou abertos e não excluem membros, elementos ou etapas do método adicionais ou não citados. Os termos também abrangem "consistindo em" e "consistindo essencialmente em". O termo "consistindo em", conforme usado neste documento, quando se refere a uma composição, significa que nenhum outro ingrediente está presente na referida composição além daqueles citados posteriormente. O termo "consistindo essencialmente em", quando se refere a uma composição, permite a presença de vestígios de reagentes, mas normalmente a uma concentração inferior a 0,1% p/v.
[0035] A citação de intervalos numéricos por pontos finais inclui todos os números e frações incluídos nos respectivos intervalos, bem como os pontos finais citados.
[0036] Os termos "cerca de" ou "aproximadamente", conforme usados neste documento, quando se referem a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, destinam-se a abranger variações de e a partir do valor especificado, como variações de +/- 10% ou menos, de um modo preferido +/- 5% ou menos, de um modo mais preferido +/- 1% ou menos, e de um modo ainda mais preferido +/- 0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para executar a invenção divulgada. Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" se refere também é especificamente, e de um modo preferido, divulgado.
[0037] Considerando que os termos "um ou mais" ou "pelo menos um", como um ou mais membros ou pelo menos um membro de um grupo de membros, são claros per se, por meio de exemplificação adicional, o termo abrange, inter alia, uma referência a qualquer um dos referidos membros, ou a quaisquer dois ou mais dos referidos membros, como, por exemplo, qualquer 3, 4, 5, 6 ou 7 etc. dos referidos membros, e até todos os referidos membros. Em outro exemplo, "um ou mais" ou "pelo menos um" pode se referir a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais.
[0038] A discussão dos antecedentes da invenção neste documento é incluída para explicar o contexto da invenção.
Isso não deve ser tomado como uma admissão de que qualquer material referido foi publicado, conhecido ou faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.
[0039] A menos que definido de outra forma, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Por meio de orientação adicional, definições de termos são incluídas para melhor reconhecer os ensinamentos da invenção. Quando termos específicos são definidos em conexão com um aspecto particular da invenção ou uma modalidade particular da invenção, tal conotação deve ser aplicada ao longo deste relatório descritivo, isto é, também no contexto de outros aspectos ou modalidades da invenção, a menos que definido de outra forma.
[0040] Nas seguintes passagens, diferentes aspectos ou modalidades da invenção são definidos em mais detalhes.
Cada aspecto ou modalidade assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou modalidade, a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferidas ou vantajosas.
[0041] Referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, o aparecimento das frases "em uma modalidade" em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se refere necessariamente à mesma modalidade, mas pode. Além disso, os recursos, as estruturas ou as características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada, como seria evidente para uma pessoa versada na técnica a partir desta divulgação, em uma ou mais modalidades. Além disso, embora algumas modalidades descritas neste documento incluam algumas, mas não outras características incluídas em outras modalidades, as combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes modalidades, como seria entendido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.
[0042] Os presentes inventores desenvolveram uma composição líquida quimicamente definida única para criopreservação de um material biológico. Os inventores constataram que a combinação específica de reagentes permite um efeito sinérgico desses reagentes, resultando em características ótimas para uso em criopreservação.
[0043] Conforme detalhado neste documento, as composições da presente invenção compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em um solvente polar aprótico (por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO)), um álcool monohídrico ou polihídrico (por exemplo, etilenoglicol), um polissacarídeo não ramificado (por exemplo, sacarose) e um polissacarídeo ramificado (por exemplo, dextrano) e álcool polivinílico (PVA) ((a composição líquida também é referida aqui como uma solução de criopreservação (CDCS)). Esta composição líquida permite uma criopreservação eficiente, biologicamente segura e reproduzível (por exemplo, vitrificação) de vários tipos de material biológico, abrangendo - mas não se limitando a - células-tronco, embriões e gametas, por vários tipos de procedimentos de criopreservação (por exemplo, congelamento lento, vitrificação em uma etapa, vitrificação em várias etapas).
Mais particularmente, a composição líquida permite uma criopreservação eficiente (por exemplo, vitrificação) de material biológico geralmente com viabilidade, proliferação e parâmetros morfológicos semelhantes a material biológico de controle não criopreservado, ou semelhante ou melhor do que o material biológico criopreservado com uma solução de criopreservação de controle de referência.
[0044] Todos os ingredientes da composição como ensinado neste documento são substâncias quimicamente definidas, não originárias de tecidos ou fluidos de animais ou humanos (por exemplo, soro, albumina ou qualquer outra proteína do soro). Portanto, suas características são intrinsecamente estáveis nos lotes de produção. Além disso,
as propriedades da composição líquida, conforme ensinadas neste documento, são notavelmente estáveis ao longo do tempo, mesmo em condições de temperatura desfavoráveis e apesar da ausência de qualquer agente antimicrobiano. De fato, o armazenamento à 4 °C bem como a 37 °C (e também em condições de temperatura intermediária e mista) por pelo menos 6 meses não altera seu aspecto óptico/físico nem sua alta eficiência na criopreservação de material biológico, o que é uma vantagem para fins de padronização e controle de qualidade.
[0045] Além disso, a composição líquida, conforme ensinada neste documento, atua como uma composição de inibição de cristal de gelo, que é mais eficaz do que as composições comumente usadas para vitrificação, mesmo em condições com taxas de resfriamento e aquecimento que são mais lentas do que geralmente recomendado, bem como quando se usa criotubos. Por exemplo, a vitrificação em criotubos normalmente tem uma taxa média de resfriamento ou aquecimento de cerca de 100 °C/min (por exemplo, conforme descrito em Tao Wang et al., 2015, Determination of convective heat transfer coefficient at the outer surface of a cryovial being plunged into liquid nitrogen.
Cryoletters. 36: 285 a 288), que é consideravelmente inferior à taxa de resfriamento ou aquecimento comumente recomendada de 2.000 °C a 20.000 °C por minuto para fins de vitrificação. Ao testar a capacidade de vitrificação da composição líquida, conforme ensinado neste documento em condições de alta inércia térmica (por exemplo, canudos franceses cheios com solução) e na ausência de células, nenhum cristal de gelo é opticamente detectável após o resfriamento ou aquecimento subsequente da composição líquida para criopreservação, enquanto por outro lado, uma solução de vitrificação de referência e a composição líquida como ensinada aqui desprovida de PVA não permitem a vitrificação consistente e resultam na rápida formação de cristais após o resfriamento ou o aquecimento, o que pode ser deletério para o material biológico.
[0046] Além da eficiência, sua composição quimicamente definida garante a reprodutibilidade de suas propriedades de fabricação e alta estabilidade de médio a longo prazo, o que é um ativo para fins de padronização e controle de qualidade. A ausência de proteínas complexas ou componentes indefinidos de origem humana ou animal está em conformidade com os requisitos de segurança biológica.
[0047] Consequentemente, um primeiro aspecto fornece uma composição líquida para criopreservação de um material biológico compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um solvente polar aprótico, um álcool monohídrico ou polihídrico, um polissacarídeo não ramificado, um polissacarídeo ramificado e álcool polivinílico.
[0048] O termo "solvente aprótico polar", tal como utilizado neste documento, refere-se a um solvente que consiste em moléculas polares que não contêm íons de hidrogênio lábeis com carga positiva. Os solventes polares apróticos são tipicamente capazes de formar ligações de hidrogênio com água para se dissolver na água, enquanto os solventes não polares não são capazes de formar ligações de hidrogênio fortes. Exemplos não limitativos de solventes apróticos polares são DMSO, dimetilformamida, diclorometano, tetra-hidrofurano, acetato de etila, acetonitrila, dimetilformamida, acetona e triamida hexametilfosfórica.
[0049] Em modalidades particulares, o solvente aprótico polar é selecionado a partir do grupo que consiste em dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), de um modo preferido DMSO.
[0050] O termo "álcool monohídrico", tal como utilizado neste documento, refere-se a um composto orgânico com um grupo funcional de álcool (ou seja, um grupo hidroxila (-OH)). Exemplos não limitativos de álcoois monohídricos incluem metanol, etanol, álcool isopropílico (isopropanol), butanol e pentanol.
[0051] O termo "álcool polihídrico", tal como utilizado neste documento, refere-se a um composto orgânico com mais de um grupo funcional de álcool (ou seja, mais de um grupo hidroxila (-OH)). Exemplos não limitativos de álcoois polihídricos incluem etilenoglicol, propilenoglicol, glicerol, eritritol, sorbitol, manitol, xilitol e volemitol.
[0052] Conforme usado neste documento, a forma singular "álcool monohídrico ou polihídrico" inclui referentes tanto no singular quanto no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Quando o álcool monohídrico ou polihídrico é usado para se referir a uma combinação de diferentes tipos de álcoois monohídricos e/ou polihídricos, a quantidade total dos diferentes tipos de álcoois monohídricos e/ou polihídricos, respectivamente, não será maior do que a quantidade do álcool monohídrico ou polihídrico na composição líquida como ensinado neste documento. Em modalidades particulares, o álcool monohídrico ou polihídrico é selecionado a partir do grupo que consiste em etilenoglicol, metanol, etanol, álcool isopropílico (isopropanol), butanol, pentanol, propilenoglicol, glicerol, eritritol, sorbitol, manitol, xilitol e volemitol, de um modo preferido o álcool monohídrico ou polihídrico é etilenoglicol, propilenoglicol ou glicerol, de um modo mais preferido etilenoglicol.
[0053] O termo "polissacarídeo", tal como utilizado neste documento, refere-se a um homo- ou heterodímero ramificado ou não ramificado (ou seja, 2 monossacarídeos, também conhecido como dissacarídeo), oligômero ou polímero (ou seja, mais de 20 monossacarídeos, também conhecido como polissacarídeo) de monossacarídeos. Os monossacarídeos podem ser combinados por meio de ligações glicosídicas.
Exemplos não limitativos de polissacarídeos como definidos neste documento incluem sacarose, trealose, lactulose, melibiose, lactobionato, rafinose, dextrano, pectina, ficoll, amido, celulose e derivados dos mesmos, tais como hidroxietilamido e metilcelulose.
[0054] Em modalidades particulares, o polissacarídeo não ramificado é selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, trealose, lactulose, melibiose, lactobionato, rafinose e celulose ou um derivado da mesma, como metilcelulose, de um modo preferido sacarose.
[0055] Em modalidades particulares, o polissacarídeo ramificado é selecionado a partir do grupo que consiste em dextrano, pectina, ficoll e amido ou um derivado do mesmo, como hidroxietilamido, de um modo preferido dextrano. Em modalidades particulares, o polissacarídeo não ramificado é sacarose e o polissacarídeo ramificado é dextrano.
[0056] O termo "álcool polivinílico", "PVA", "PVOH" ou "PVAI", conforme usado neste documento, refere-se ao polímero sintético solúvel em água definido pela fórmula química [CH2CH(OH)]n. O álcool polivinílico também pode ser identificado pelo número CAS 9002-89-5.
[0057] O termo "criopreservação", tal como utilizado neste documento, refere-se a um processo onde um material biológico (por exemplo, células, tecidos, órgãos, organismos) é preservado em um ambiente com uma temperatura abaixo de 0 °C, de um modo preferido abaixo de -80 °C (por exemplo, usando dióxido de carbono sólido), de um modo ainda mais preferido abaixo de -130 °C (por exemplo, usando nitrogênio líquido). O material biológico é normalmente suscetível a danos causados por cinética bioquímica desregulada. Em temperaturas abaixo de -130 °C, qualquer atividade enzimática e bioquímica que possa danificar o material biológico é efetivamente interrompida. Durante os procedimentos de criopreservação, o material biológico a ser preservado por resfriamento ou congelamento é normalmente colocado em contato com um ou mais crioprotetores. A criopreservação pode ser obtida por qualquer procedimento de criopreservação conhecido na técnica, incluindo procedimentos de congelamento, como congelamento lento (SLF) e procedimentos de vitrificação, como vitrificação em várias etapas e vitrificação em uma etapa, conforme descrito em outro lugar neste documento.
[0058] O termo "material biológico", tal como utilizado neste documento, refere-se a células, agregados de células, amostras de tecidos, órgãos, fluidos biológicos, organismos (multi)celulares e qualquer outro membranoso (por exemplo, lipossoma), nucleotídico (DNA ou RNA), nucleoproteico (vírus), entidades lipídicas ou proteicas. Exemplos não limitativos de material biológico incluem células-tronco (por exemplo, células-tronco mesenquimais ou células-tronco pluripotentes induzidas), gametas (por exemplo, espermatozoides, oócitos, óvulos), embrião (ou seja, em vários estágios de desenvolvimento, por exemplo, zigoto, duas células, mórula, blastocisto), sangue total ou frações do mesmo (por exemplo, glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, plasma, plaquetas, proteínas, lipídios, anticorpos), medula óssea, bactérias, leveduras, nematoides, corpos membranosos, ácidos nucléicos (DNA e RNA) e vírus.
[0059] Em modalidades particulares, o material biológico é selecionado a partir do grupo de células- tronco, gametas e embriões. De um modo preferido, o material biológico é um embrião, de um modo preferido um embrião de camundongo ou humano.
[0060] O termo "célula-tronco" se refere, de forma geral, a uma célula não especializada ou relativamente menos especializada e competente para proliferação, que é capaz de autorrenovação, ou seja, pode proliferar sem diferenciação e cuja progênie pode dar origem a pelo menos um tipo de célula relativamente mais especializado. O termo abrange células-tronco capazes de autorrenovação substancialmente ilimitada, ou seja, em que a progênie de uma célula-tronco ou pelo menos parte dela retém substancialmente o fenótipo não especializado ou relativamente menos especializado, o potencial de diferenciação e a capacidade de proliferação da célula- tronco mãe, bem como células-tronco que exibem autorrenovação limitada, isto é, em que a capacidade da progênie ou parte dela para proliferação e/ou diferenciação adicional é demonstravelmente reduzida em comparação com a célula mãe. Por meio de exemplo e não de limitação, uma célula-tronco pode dar origem a descendentes que podem se diferenciar ao longo de uma ou mais linhagens para produzir células cada vez mais relativamente mais especializadas, em que tais descendentes e/ou células cada vez mais relativamente mais especializadas podem ser células-tronco conforme definido neste documento, ou mesmo para produzir células diferenciadas terminalmente, isto é, células totalmente especializadas, que podem ser pós-mitóticas.
[0061] O termo "células-tronco pluripotentes induzidas" ou "células iPS", tal como utilizado neste documento, refere-se a células-tronco pluripotentes geradas a partir de células adultas por reprogramação. As células iPS podem se autorrenovar e dar origem a tipos de células originários de todas as três camadas germinativas de um organismo, ou seja, mesoderme, endoderme e ectoderma, e potencialmente a todo e qualquer tipo de célula de um organismo, embora não seja capaz de crescer em todo o organismo. Exemplos de células iPS são aqueles ensinados, inter alia, por Yamanaka et al. 2006 (Cell 126: 663 a 676) e Yamanaka et al. 2007 (Cell 131: 861 a 872).
[0062] Conforme usado neste documento, o qualificador "pluripotente" denota a capacidade de uma célula de dar origem a tipos de células originários de todas as três camadas germinativas de um organismo, ou seja, mesoderme, endoderme e ectoderma, e potencialmente capaz de dar origem a todo e qualquer tipo de células de um organismo.
[0063] Em modalidades particulares, as células-tronco são células-tronco multipotentes selecionadas do grupo que consiste em células-tronco mesenquimais (MSCs), células- tronco derivadas do sangue (BDSCs), células-tronco derivadas do sangue do cordão umbilical (UCBSCs) e células- tronco derivadas da medula óssea (BMSCs). Em modalidades preferidas, as células são MSCs.
[0064] O termo "célula-tronco mesenquimal" ou "MSC", tal como utilizado neste documento, refere-se a uma célula- tronco adulta derivada do mesoderma que é capaz de gerar células de linhagens mesenquimais, tipicamente de duas ou mais linhagens mesenquimais, mais tipicamente três ou mais linhagens mesenquimais, por exemplo, linhagem condro-
osteoblástica (osso e cartilagem), osteoblástica (osso), condroblástica (cartilagem), miocítica (músculo), tenocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) e estromogênica (estroma medular).
MSC pode ser isolada de uma amostra biológica, de um modo preferido uma amostra biológica de um indivíduo humano, por exemplo, medula óssea, osso trabecular, sangue, cordão umbilical, placenta, saco vitelino fetal, pele (derme), especificamente pele fetal e adolescente, periósteo, polpa dentária, tendão e tecido adiposo.
[0065] O termo "MSC" também abrange a progênie de MSC, por exemplo, progênie obtida por proliferação in vitro ou ex vivo (propagação/expansão) de MSC obtida de uma amostra biológica de um indivíduo animal ou humano.
[0066] Em modalidades particulares, o material biológico é uma amostra biológica. O termo "amostra biológica" ou "amostra", tal como utilizado neste documento, refere-se a uma amostra obtida de uma fonte biológica, por exemplo, de um organismo, tal como um indivíduo animal ou humano, cultura de células, amostra de tecido, etc. Uma amostra biológica de um indivíduo animal ou humano se refere a uma amostra removida de um indivíduo animal ou humano e compreendendo células do mesmo. A amostra biológica de um indivíduo animal ou humano pode compreender um ou mais tipos de tecido e pode compreender células de um ou mais tipos de tecido. Os métodos de obtenção de amostras biológicas de um indivíduo animal ou humano são bem conhecidos na técnica, por exemplo, biópsia de tecido ou coleta de sangue. MSC humana, seu isolamento, expansão in vitro e diferenciação, foram descritos em, por exemplo, Patente No. US 5.486.359; Patente No.
US 5.811.094; Patente No. US 5.736.396; Patente No.
US 5.837.539; ou Patente No. US 5.827.740.
[0067] O termo "indivíduo", "doador" ou "paciente", tal como utilizado neste documento, refere-se a animais, de um modo preferido animais de sangue quente, de um modo mais preferido vertebrados, de um modo ainda mais preferido mamíferos, de um modo ainda mais preferido primatas, e inclui especificamente humanos e mamíferos não humanos e primatas. Os indivíduos preferidos são os seres humanos.
[0068] Em modalidades particulares, o material biológico é uma ou mais células de mamíferos, de um modo preferido células de camundongo ou humanas, de um modo ainda mais preferido células humanas.
[0069] Em uma modalidade particular, o material biológico é material biológico para tecnologias de reprodução assistida (TRA), como oócitos e embriões metafase II (MII) (por exemplo, embriões em vários estágios de desenvolvimento).
[0070] Em modalidades particulares, a composição compreende ainda um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4.
[0071] Em modalidades particulares, o referido diluente é uma solução salina balanceada, de um modo preferido solução salina tamponada com fosfato (PBS), de um modo mais preferido PBS de Dulbecco (D-PBS).
[0072] O termo "uma solução salina balanceada" ou "BSS", tal como utilizado neste documento, refere-se a uma solução feita a um pH fisiológico (de um modo preferido cerca de pH 7,4) e concentrações de sal isotônico. BSS normalmente compreende sódio, potássio, cálcio, magnésio e cloreto. Exemplos não limitativos de soluções salinas balanceadas incluem PBS, HEPES, solução de Alsever, solução salina balanceada de Earle (EBSS), solução salina balanceada de Grey (GBSS), solução salina balanceada de Hank (HBSS), solução salina balanceada de Ringer (RBSS) e solução salina balanceada de Tyrode (TBSS).
[0073] Em modalidades particulares, o referido diluente não compreende quaisquer proteínas, polipeptídeos ou peptídeos.
[0074] As composições líquidas, conforme ensinadas neste documento, são eficazes para a criopreservação de material biológico. Em primeiro lugar, a combinação de reagentes específicos, mais particularmente o álcool monohídrico ou polihídrico, o polissacarídeo não ramificado, o polissacarídeo ramificado e o álcool polivinílico, que proporciona uma criopreservação ótima.
Além disso, os inventores identificaram uma proporção ótima desses diferentes componentes do solvente aprótico polar, que é eficaz em uma ampla faixa de concentrações.
Consequentemente, uma solução estoque (ou seja, solução concentrada 1x não diluída) pode ser preparada, a qual pode ser posteriormente diluída em composições com concentrações mais baixas do solvente aprótico polar, álcool monohídrico ou polihídrico, polissacarídeo não ramificado, polissacarídeo ramificado e álcool polivinílico para uso.
[0075] Consequentemente, a invenção fornece composições líquidas compreendendo um solvente polar aprótico, um álcool monohídrico ou polihídrico, um polissacarídeo não ramificado, um polissacarídeo ramificado e álcool polivinílico e seu uso na criopreservação de um material biológico.
[0076] Em modalidades particulares, a composição compreende 0,30 a 4,0% (p/v), 0,50 a 3,50% (p/v), 0,50 a 3,0% (p/v), 0,50 a 2,50% (p/v), 0,50 a 2,0% (p/v), 0,50 a 1,50% (p/v) ou 0,50 a 1,0% (p/v), de um modo preferido 0,30 a 4,0% (p/v), de álcool polivinílico. Em modalidades particulares, a quantidade do polissacarídeo não ramificado na composição é, cada uma, pelo menos 20 vezes a do álcool polivinílico. Em modalidades particulares, a quantidade do oligossacarídeo não ramificado na composição é, cada uma, pelo menos 8 vezes a do oligossacarídeo ramificado.
[0077] Em modalidades particulares, a composição líquida ou composição de estoque líquido (ou seja, 1x concentrado, não diluído), como ensinado neste documento compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: - 13,0 a 23,0% (v/v), 15,0 a 20,0% (v/v), 16,0 a 19,0% (v/v), 17,0 a 18,0% (v/v), de um modo preferido 13,0 a 23,0% (v/v), do solvente polar aprótico, por exemplo, cerca de 17,7% (v/v) do solvente polar aprótico; - 13,0 a 23,0% (v/v), 15,0 a 20,0% (v/v), 16,0 a 19,0% (v/v), 17,0 a 18,0% (v/v), de um modo preferido 13,0 a 23,0% (v/v), do álcool monohídrico ou polihídrico, por exemplo, cerca de 17,7% (v/v) do álcool monohídrico ou polihídrico; - 9,0 a 31,0% (p/v), 10 a 30% (p/v), 15 a 25% (p/v) ou 20 a 25% (p/v) do polissacarídeo não ramificado, por exemplo, cerca de 22,7% (p/v) do polissacarídeo não ramificado; - 0,60 a 22,0% (p/v), 1,0 a 20,0% (p/v), 1,0 a 15,0% (p/v), 1,0 a 10,0% (p/v), 1,0 a 5,0% (p/v), 2,0 a 5,0% (p/v) ou 2,0 a 3,0% (p/v) do polissacarídeo ramificado, por exemplo cerca de 2,64% (p/v) do polissacarídeo ramificado; - 0,30 a 4,0% (p/v), 0,50 a 3,50% (p/v), 0,50 a 3,0% (p/v), 0,50 a 2,50% (p/v), 0,50 a 2,0% (p/v), 0,50 a 1,50%
(p/v) ou 0,50 a 1,0% (p/v), de um modo preferido 0,30 a 4,0% (p/v), de álcool polivinílico, por exemplo, cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido uma solução salina balanceada.
[0078] Em modalidades particulares, a composição líquida ou composição de estoque líquida (ou seja, 1x concentrada, não diluída) compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: - pelo menos 15% (v/v), pelo menos 16% (v/v) ou pelo menos 17% (v/v) do solvente aprótico polar, - pelo menos 15% (v/v), pelo menos 16% (v/v) ou pelo menos 17% (v/v) do álcool monohídrico ou polihídrico, - pelo menos 15% (p/v), pelo menos 16% (p/v), pelo menos 17% (p/v), pelo menos 18% (p/v), pelo menos 19% (p/v), pelo menos 20% (p/v), pelo menos 21% (p/v) ou pelo menos 22% (p/v), do polissacarídeo não ramificado; - pelo menos 2,0% (p/v), pelo menos 2,10% (p/v), pelo menos 2,20% (p/v), pelo menos 2,30% (p/v), pelo menos 2,40% (p/v), pelo menos 2,50% (p/v) ou pelo menos 2,60% (p/v) do polissacarídeo ramificado, e - cerca de 0,9% (p/v) do álcool polivinílico.
[0079] Em modalidades particulares, a composição pode ser uma diluição de uma composição de estoque no mesmo diluente que a composição de estoque conforme descrito acima. Essa diluição pode ser 1:2 (ou seja, 50%), 1:3 (ou seja, cerca de 33,3%), 1:4 (ou seja, 25%), 1:5 (ou seja, 20%), 1:6 (ou seja, cerca de 16,7%), 1:7 (ou seja, cerca de 14,3%), 1:8 (ou seja, 12,5%), 1:9 (ou seja, cerca de 11,1%), 1:10 (ou seja, 10%), 1:11 (ou seja, cerca de 9,1%), 1:12 (ou seja, cerca de 8,3%), 1:13 (ou seja, cerca de 7,7%), 1:14 (ou seja, cerca de 7,1%), 1:15 (ou seja, cerca de 6,7%) ou 1:16 (ou seja, cerca de 6,3%) de diluição em um diluente como descrito acima, de um modo preferido uma solução salina balanceada.
[0080] Em modalidades particulares, a composição líquida (por exemplo, uma diluição de uma composição de estoque como descrito neste documento) compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: - pelo menos 0,8% (v/v), pelo menos 1% (v/v), pelo menos 1,2% (v/v), pelo menos 1,6% (v/v), pelo menos 2% (v/v), pelo menos 4,0% (v/v) ou pelo menos 6,0% (v/v) do solvente aprótico polar; - pelo menos 0,8% (v/v), pelo menos 1% (v/v), pelo menos 1,2% (v/v), pelo menos 1,6% (v/v), pelo menos 2% (v/v), pelo menos 4,0% (v/v) ou pelo menos 6,0% (v/v) do álcool monohídrico ou polihídrico; - pelo menos 0,5% (p/v), pelo menos 1% (p/v), pelo menos 2% (p/v), pelo menos 4% (p/v), pelo menos 6% (p/v), pelo menos 8% (p/v), pelo menos 10% (p/v), pelo menos 12%
(p/v), pelo menos 14% (p/v), pelo menos 16% (p/v), pelo menos 18% (p/v), pelo menos 20% (p/v), pelo menos 21% (p/v) ou pelo menos 22% (p/v) do polissacarídeo não ramificado; - pelo menos 0,035% (p/v), pelo menos 0,0750% (p/v), pelo menos 0,150% (p/v), pelo menos 0,30% (p/v), pelo menos 0,60% (p/v), pelo menos 1,0% (p/v), pelo menos 1,50% (p/v), pelo menos 2,0% (p/v), pelo menos 2,10% (p/v), pelo menos 2,20% (p/v), pelo menos 2,30% (p/v), pelo menos 2,40% (p/v), pelo menos 2,50% (p/v) ou pelo menos 2,60% (p/v) do polissacarídeo ramificado; - pelo menos 0,015% (p/v), pelo menos 0,1% (p/v), pelo menos 0,2% (p/v), pelo menos 0,3% (p/v), pelo menos 0,4% (p/v), pelo menos 0,5% (p/v), pelo menos 0,6% (p/v), pelo menos 0,7% (p/v) ou pelo menos 0,8% (p/v) do álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido uma solução salina balanceada.
[0081] Em modalidades particulares, - o solvente polar aprótico é selecionado a partir do grupo que consiste em DMSO e dimetilformamida (DMF), - o álcool monohídrico ou polihídrico é selecionado a partir do grupo que consiste em etilenoglicol, metanol, etanol, álcool isopropílico (isopropanol), butanol, pentanol, propilenoglicol, glicerol, eritritol, sorbitol, manitol, xilitol e volemitol, de um modo preferido etilenoglicol, propilenoglicol ou glicerol, de um modo mais preferido etilenoglicol; - o polissacarídeo não ramificado é selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, trealose, lactulose, melibiose, lactobionato, rafinose e celulose ou um derivado do mesmo, tal como metilcelulose, de um modo preferido sacarose; e/ou - o polissacarídeo ramificado é selecionado a partir do grupo que consiste em dextrano, pectina, ficoll e amido ou um derivado do mesmo, tal como hidroxietilamido, de um modo preferido dextrano.
[0082] De um modo preferido, a invenção fornece uma composição líquida para criopreservação de um material biológico compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em DMSO, etilenoglicol, sacarose, dextrano e álcool polivinílico.
[0083] O termo "dimetilsulfóxido" ou "DMSO", tal como utilizado neste documento, refere-se a um composto organossulfurado com a fórmula química (CH3)2SO. O DMSO pode ser identificado pelo número CAS 67-68-5.
[0084] O termo "etilenoglicol", "EG" ou "1,2- etanodiol", tal como utilizado neste documento, refere-se a um composto orgânico com fórmula química (CH2OH)2. O etilenoglicol pode ser identificado pelo número CAS 107-21-
1.
[0085] O termo "sucrose" ou "sacarose" ou "açúcar" ou "SUC", conforme usado neste documento, refere-se a um dissacarídeo composto de glicose e frutose com a fórmula química C12H22O11. A sacarose pode ser identificada pelo número CAS 57-50-1.
[0086] O termo "dextrano", tal como utilizado neste documento, refere-se a um polissacarídeo de glucano ramificado complexo derivado da condensação de glicose.
Dextrano pode ser identificado pelo número CAS 9004-54-0.
As cadeias de dextrano podem ter comprimentos variados (por exemplo, de 1 a 2.000 kDa). Diferentes tipos de dextrano podem ser indicados por seu peso molecular (MW). Por exemplo, exemplos não limitativos de dextranos com MW variável incluem dextrano 1 (ou seja, com um MW de cerca de 1000 Da), dextrano 5 (ou seja, com um MW de cerca de 5000 Da), dextrano 12 (ou seja, com um MW de cerca de
12.000 Da), dextrano 25 (ou seja, com um MW de cerca de
25.000 Da), dextrano 40 (ou seja, com um MW de cerca de
40.000 Da), dextrano 50 (ou seja, com um MW de cerca de
50.000 Da), dextrano 60 (ou seja, com um MW de cerca de
60.000 Da), dextrano 70 (ou seja, com um MW de cerca de
70.000 Da), dextrano 80 (ou seja, com um MW de cerca de
80.000 Da), dextrano 150 (ou seja, com um MW de cerca de
150.000 Da) e dextrano 200 (ou seja, com um MW de cerca de
200.000 Da).
[0087] Conforme usado neste documento, a forma singular "dextrano" inclui referentes tanto no singular quanto no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Quando o dextrano é usado para se referir a uma combinação de diferentes tipos de dextrano, a quantidade total dos diferentes tipos de dextrano não será maior do que a quantidade do polissacarídeo ramificado na composição líquida como ensinado neste documento.
[0088] Em modalidades particulares, o dextrano presente na composição líquida como ensinado neste documento pode compreender, consiste essencialmente em ou consiste em apenas um tipo de dextrano ou uma combinação de diferentes tipos de dextrano, tal como uma combinação de dextranos com um MW diferente.
[0089] Em modalidades particulares, o dextrano presente na composição líquida como ensinado neste documento pode compreender, consiste essencialmente em ou consiste em apenas um tipo de dextrano. Em modalidades mais particulares, o dextrano presente na composição líquida como ensinado neste documento compreende, consiste essencialmente em ou consiste em dextrano 1, dextrano 40 ou dextrano 70. Por exemplo, a composição líquida como ensinado neste documento compreende, consiste essencialmente em ou consiste em dextrano 1.
[0090] Em modalidades preferidas, o dextrano presente na composição líquida, conforme ensinado neste documento, compreende uma combinação de dextranos de diferentes pesos moleculares.
[0091] Em modalidades mais preferidas, o dextrano consiste essencialmente em ou consiste em dextrano 1, dextrano 40 e dextrano 70.
[0092] A proporção entre as quantidades dos diferentes tipos de dextrano (por exemplo, os dextranos de peso molecular diferente) na composição não é crítica para a composição líquida da invenção.
[0093] No entanto, em modalidades particulares, o dextrano consiste essencialmente em ou consiste em dextrano 1, dextrano 40 e dextrano 70 em uma proporção de 1:1:1, 2:1:1, 10:10:1 ou 10:1:10, de um modo preferido uma proporção de 1:1:1. Um exemplo de dextrano 1 é o dextrano 1 da Pharmacosmos (ref. 5510 0001 1007). Um exemplo de dextrano 40 é o dextrano 40 da AppliChem (ref. A2249). Um exemplo de dextrano 70 é o dextrano 70 da AppliChem (ref.
A1847).
[0094] Em modalidades particulares, a composição líquida compreende quantidades substancialmente iguais de DMSO e etilenoglicol e uma concentração de sacarose que é pelo menos 8 vezes a do dextrano.
[0095] Em modalidades particulares, a composição líquida compreende:
- quantidades substancialmente iguais de DMSO e etilenoglicol, - uma concentração de sacarose que é pelo menos 8 vezes a do dextrano, e - concentração de sacarose pelo menos 20 vezes superior à do álcool polivinílico.
[0096] Em modalidades particulares, a composição líquida (por exemplo, uma diluição de uma composição de estoque como descrito neste documento) compreende: - pelo menos 0,8% (v/v), pelo menos 1% (v/v), pelo menos 1,2% (v/v), pelo menos 1,6% (v/v), pelo menos 2% (v/v), pelo menos 4,0% (v/v) ou pelo menos 6,0% (v/v) de DMSO; - pelo menos 0,8% (v/v), pelo menos 1% (v/v), pelo menos 1,2% (v/v), pelo menos 1,6% (v/v), pelo menos 2% (v/v), pelo menos 4,0% (v/v) ou pelo menos 6,0% (v/v) de etilenoglicol; - pelo menos 0,5% (p/v), pelo menos 1% (p/v), pelo menos 2% (p/v), pelo menos 4% (p/v), pelo menos 6% (p/v), pelo menos 8% (p/v), pelo menos 10% (p/v), pelo menos 12% (p/v), pelo menos 14% (p/v), pelo menos 16% (p/v), pelo menos 18% (p/v), pelo menos 20% (p/v), pelo menos 21% (p/v), pelo menos 22% (p/v) de sacarose; - pelo menos 0,037% (p/v), pelo menos 0,075% (p/v), pelo menos 0,15% (p/v), pelo menos 0,2% (p/v), pelo menos
0,25% (p/v), pelo menos 0,5% (p/v), pelo menos 1% (p/v), pelo menos 1,25% (p/v), pelo menos 1,5% (p/v), pelo menos 1,75% (p/v), pelo menos 2% (p/v), pelo menos 2,25% (p/v) ou pelo menos 2,5% (p/v) de dextrano; - pelo menos 0,015% (p/v), pelo menos 0,1% (p/v), pelo menos 0,2% (p/v), pelo menos 0,3% (p/v), pelo menos 0,4% (p/v), pelo menos 0,5% (p/v), pelo menos 0,6% (p/v), pelo menos 0,7% (p/v) ou pelo menos 0,8% (p/v) de álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4.
[0097] Em modalidades particulares, a composição líquida ou composição de estoque líquido (ou seja, 1x concentrada, não diluída) compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: - 13,0 a 23,0% (v/v), 15,0 a 20,0% (v/v), 16,0 a 19,0% (v/v), 17,0 a 18,0% (v/v) ou 13,0 a 23,0% (v/v) de DMSO, por exemplo, cerca de 17,7% (v/v) de DMSO; - 13,0 a 23,0% (v/v), 15,0 a 20,0% (v/v), 16,0 a 19,0% (v/v), 17,0 a 18,0% (v/v) ou 13,0 a 23,0% (v/v) de etilenoglicol, por exemplo, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol; - 9,0 a 31,0% (p/v), 10,0 a 30,0% (p/v), 15,0 a 30,0% (p/v), 15,0 a 25,0% (p/v), 20,0 a 25,0% (p/v) ou 22,0 a 23,0% (p/v), por exemplo, cerca de 22,7% (p/v) de sacarose;
- 0,60 a 22,0% (p/v), 1,0 a 20,0% (p/v), 1,0 a 15,0% (p/v), 1,0 a 10,0% (p/v), 1,0 a 7,50% (p/v), 1,0 a 5,0% (p/v), 2,0 a 4,0% (p/v) ou 2,0 a 3,0% (p/v), por exemplo, cerca de 2,64% (p/v) de dextrano; - 0,30 a 4,0% (p/v), 0,50 a 3,5% (p/v), 0,50 a 3,0% (p/v), 0,50 a 2,50% (p/v), 0,50 a 2,0% (p/v), 0,50 a 1,50% (p/v) ou 0,50 a 1,0% (p/v) de álcool polivinílico, por exemplo, cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico; e/ou - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4.
[0098] Em modalidades particulares, a composição ou composição de estoque compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos 15% (v/v) de DMSO, pelo menos 15% (v/v) de etilenoglicol, pelo menos 15% (p/v) de sacarose, pelo menos 2,5% de dextrano (p/v), cerca de 0,9% (p/v) de álcool polivinílico e um diluente até 100% (v/v).
[0099] Em modalidades particulares, a composição ou composição de estoque compreende, consiste essencialmente em ou consiste em cerca de 17,7% (v/v) DMSO, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol, cerca de 22,7% (p/v) de sacarose, cerca de 0,88% dextrano 1 (p/v), cerca de 0,88% dextrano 40 (p/v), cerca de 0,88% dextrano 70 (p/v), cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico e D-PBS até 100% (v/v).
[00100] Em modalidades particulares, a composição líquida não compreende quaisquer proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, de um modo preferido a composição líquida não compreende quaisquer proteínas, polipeptídeos ou peptídeos de origem mamífera. Por exemplo, a composição líquida não contém albumina ou outras proteínas séricas.
[00101] Em modalidades particulares, a composição líquida não compreende componentes animais.
[00102] Em modalidades particulares, a composição líquida não compreende soro.
[00103] Em modalidades particulares, a composição líquida não compreende agentes antimicrobianos, como antibióticos.
[00104] Os presentes inventores constataram que a composição líquida como ensinada neste documento permite a criopreservação altamente eficiente (por exemplo, vitrificação ou congelamento) de material biológico com viabilidade, proliferação e pontos finais morfológicos semelhantes ao material biológico de controle não criopreservado.
[00105] Consequentemente, um outro aspecto fornece o uso da composição líquida, conforme ensinado neste documento, para a criopreservação de um material biológico.
[00106] Em modalidades particulares, a criopreservação do material biológico é realizada por um procedimento de congelamento, como um procedimento de congelamento lento ou um procedimento de vitrificação, como vitrificação em várias etapas ou vitrificação em uma etapa.
[00107] O termo "procedimento de congelamento ou congelamento lento" ou "SLF", tal como utilizado neste documento, refere-se a um processo de resfriamento de material biológico a uma temperatura abaixo de 0 °C, por exemplo, a uma temperatura de pelo menos -80 °C ou pelo menos -196 °C, em que o material biológico é resfriado a uma taxa lenta controlada - por exemplo, a uma diminuição de 0,1 °C a 2 °C por minuto. A taxa controlada de resfriamento pode ser alcançada por qualquer dispositivo conhecido na técnica para tais fins, tal como um freezer de taxa controlada ou um recipiente de congelamento portátil de bancada. O material biológico é normalmente colocado em contato com um ou mais crioprotetores (por exemplo, 10% (v/v) de DMSO em meio de cultura) para prevenir - por exemplo, rupturas mecânicas das membranas devido a cristais de gelo - e danos osmóticos na célula.
[00108] Por exemplo, um procedimento de congelamento lento pode compreender as seguintes etapas: imersão de um material biológico em uma solução de criopreservação contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (por exemplo, CryoStor® CS10 (STEMCELL Technologies)) ou em uma diluição de 50% ou 25% do composição líquida, conforme ensinado neste documento, transferência do material biológico para criotubos, armazenamento dos criotubos compreendendo o material biológico durante a noite em um recipiente de congelamento (por exemplo, dispositivo Mr Frosty™ (Nalgene)) em um freezer de -80 °C e subsequentemente transferência dos criotubos em nitrogênio líquido.
[00109] O termo "vitrificação", tal como utilizado neste documento, refere-se a um processo de resfriamento de material biológico, em que o material biológico é resfriado a uma temperatura abaixo de 0 °C, por exemplo, a uma temperatura de pelo menos -130 °C, a uma taxa de resfriamento muito rápida - por exemplo, de 2.000 °C a
20.000 °C por minuto - até atingir a temperatura final de armazenamento. O material biológico é tipicamente colocado em contato com um ou mais crioprotetores (tipicamente de 5 a 7,15 M) para prevenir dano osmótico na célula e inibir a formação de gelo no processo de resfriamento. Os procedimentos de vitrificação são conhecidos na técnica e incluem procedimentos de vitrificação de várias etapas e de uma etapa. Os procedimentos de vitrificação normalmente compreendem pelo menos uma etapa de desidratação do material biológico com uma solução aquosa ("solução de vitrificação") contendo crioprotetores permeadores e/ou não permeadores. O material biológico junto com uma quantidade de solução de vitrificação é colocado em um criocontêiner adequado e resfriado rapidamente por imersão em um fluido criogênico, como nitrogênio líquido ou vapor do mesmo. Uma taxa de resfriamento e de concentração bem balanceadas de crioprotetores permitem que a água intracelular atinja um estado sólido, inócuo e vítreo, em vez de um estado de gelo cristalino ordenado e prejudicial. Os dispositivos de vitrificação são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, criocontêineres.
[00110] Por exemplo, um procedimento de vitrificação de uma etapa pode compreender as seguintes etapas: contatar um material biológico com a composição líquida não diluída para criopreservação como ensinado neste documento e movê- lo na composição para eliminar substancialmente todo o meio de cultura em torno do material biológico, colhendo o material biológico em um volume menor da composição líquida como ensinado neste documento e carregando-o em um canudo protetor ou criotubo. O canudo ou criotubo é selado e mergulhado diretamente em nitrogênio líquido. O período entre a transferência do material biológico para a composição líquida, como ensinado neste documento, e o mergulho no nitrogênio líquido é de no máximo 1 minuto.
[00111] Por exemplo, um procedimento de vitrificação de múltiplas etapas (equilíbrio) pode compreender as seguintes etapas: subsequentemente imersão do material biológico em diluições decrescentes da composição líquida de estoque para criopreservação como ensinado neste documento (por exemplo, 3 minutos em uma diluição de 1:16,
3 minutos em uma diluição de 1:8, 3 minutos em uma diluição de 1:4, 5 minutos em uma diluição de 1:2), imergindo o material biológico em um volume menor da composição de estoque não diluída como ensinado neste documento em um canudo protetor ou criotubo. O canudo ou criotubo é selado e mergulhado diretamente em nitrogênio líquido.
[00112] Em modalidades particulares, a composição líquida como ensinada neste documento é usada para criopreservação de um material biológico a uma temperatura de pelo menos -80 °C, pelo menos -70 °C, pelo menos -80 °C, pelo menos -90 °C, a pelo menos -100 °C, pelo menos -110 °C, pelo menos -120 °C, pelo menos -130 °C, pelo menos -140 °C, pelo menos -150 °C, pelo menos -160 °C, pelo menos -170 °C, pelo menos -180 °C, pelo menos -190 °C ou pelo menos -200 °C.
[00113] Em modalidades particulares, a composição líquida como ensinada neste documento é usada para criopreservação de um material biológico por um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 anos.
[00114] As taxas de resfriamento e de aquecimento geralmente recomendadas para materiais biológicos de criopreservação são [~20.000 °C/min]. Em modalidades particulares, a taxa de resfriamento e/ou de aquecimento do método de vitrificação é [~1000 °C/min]. Os inventores constataram que as composições da presente invenção fornecem fortes propriedades de inibição de cristal de gelo em métodos de vitrificação em que as taxas de resfriamento e/ou as taxas de aquecimento são [~1000 °C/min].
[00115] Da mesma forma, um outro aspecto fornece um método para preservar um material biológico que compreende as etapas de: - fornecer um material biológico; - contatar o material biológico com a composição líquida (por exemplo, composição de estoque ou diluição da composição de estoque) como ensinado neste documento; - resfriar e/ou aquecer o material biológico na composição líquida, conforme ensinado neste documento.
[00116] O termo "contato" ou "contatar", conforme usado neste documento, refere-se a trazer um ou mais primeiros componentes (como uma ou mais moléculas, entidades biológicas, células ou materiais) junto com um ou mais segundos componentes (como uma ou mais moléculas, entidades biológicas, células ou materiais) de tal maneira que o(s) primeiro(s) componente(s) é/são diretamente expostos (ou seja, em contato direto com) o(s) segundo(s) componente(s) e pode(m) - se for(em) capaz(es) disso - ligar ou modular o(s) segundo(s) componente(s) ou que o(s) segundo(s) componente(s) pode(m) - se for(em) capaz(es) disso - ligar ou modular o(s) primeiro(s) componente(s). O termo "contatar" pode, dependendo do contexto, ser sinônimo de "expor", "incubar", "misturar" ou semelhantes.
[00117] Em modalidades particulares, o contato do material biológico com a composição líquida, conforme ensinado neste documento, é conseguido imergindo ou mergulhando o material biológico em um volume da composição líquida, de um modo preferido em que o volume da composição líquida é suficiente para envolver completamente o material biológico. O especialista compreenderá que o volume da composição líquida utilizada depende do tipo e da quantidade de material biológico. Por exemplo, se o material biológico for um embrião, 0,1 l a 1 l da composição líquida pode ser suficiente.
[00118] Em modalidades particulares, o contato do material biológico com a composição líquida é realizado em um recipiente que é adequado para criopreservação. Tais recipientes são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um canudo francês protetor ou um criotubo.
[00119] Em modalidades particulares, o método compreende uma ou mais etapas de equilíbrio de pré- resfriamento, que envolvem um breve (30 a 600 s, de um modo preferido 180 a 300 s) contato com uma ou mais (normalmente aumentando) concentrações do meio de vitrificação a uma temperatura entre 15 a 37 °C. As etapas de equilíbrio de pré-resfriamento são normalmente incluídas em procedimentos de resfriamento de várias etapas, como a vitrificação de várias etapas, conforme descrito em outro lugar neste documento.
[00120] Em modalidades particulares, os métodos envolvem o resfriamento do material biológico. Em outras modalidades, os métodos envolvem o aquecimento do material biológico. Em modalidades particulares, o material biológico é resfriado a uma temperatura abaixo do ponto de congelamento e, após um determinado período de tempo, aquecido a uma temperatura acima do ponto de congelamento.
[00121] Em contraste com os métodos comumente usados para preservar um material biológico, incluindo uma etapa de resfriamento (por exemplo, vitrificação), fazendo uso de várias composições diferentes (ou seja, consistindo em ingredientes diferentes) para equilibrar o material biológico antes do resfriamento para atingir a eficiência satisfatória do processo, a composição líquida como ensinada neste documento permite o uso da mesma solução de estoque (mas em várias diluições) para equilibrar o material biológico.
[00122] Por conseguinte, em modalidades particulares, o método compreende contatar o material biológico com pelo menos uma (tal como uma, duas, três ou quatro, de um modo preferido quatro) diluição da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento antes de contatar o material biológico com a composição líquida não diluída (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento, em que a referida etapa é realizada antes do resfriamento do material biológico. Em modalidades mais particulares, a composição de estoque líquida não diluída compreende, consiste essencialmente em ou consiste em 13,0 a 23,0% (v/v) de DMSO; 13,0 a 23,0% (v/v) de etilenoglicol, 9,0 a 31,0% (p/v) de sacarose; 0,60 a 22,0% (p/v) de dextrano; 0,30 a 4,0% (p/v) de álcool polivinílico e até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido cerca de 17,7% (v/v) de DMSO, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol, cerca de 22,7% (p/v) de sacarose, cerca de 0,88% de dextrano 1 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 40 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 70 (p/v), cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico e D-PBS até 100% (v/v).
[00123] Em modalidades particulares, a pelo menos uma diluição da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento é diluição de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 e/ou 1:16.
[00124] Em modalidades particulares, o método compreende subsequentemente contatar o material biológico com duas ou mais (tais como duas, três ou quatro, de um modo preferido quatro) diluições decrescentes da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento antes de contatar o material biológico com a composição líquida não diluída (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento, em que a referida etapa é realizada antes do resfriamento do material biológico, de um modo preferido em que a última diluição da composição líquida com a qual o material biológico é contatado antes de contatar o material biológico com a composição líquida não diluída é uma diluição de 1:2.
[00125] Em modalidades particulares, o método compreende o contato do material biológico com uma diluição de 1:16, uma diluição de 1:8, uma diluição de 1:4 e uma diluição de 1:2 da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento antes de entrar em contato com o material biológico com a referida composição (por exemplo, composição de reserva), em que a referida etapa é realizada antes do resfriamento do material biológico, de um modo preferido em que a composição de reserva líquida não diluída compreende, consiste essencialmente em ou consiste em 13,0 a 23,0% (v/v) de DMSO; 13,0 a 23,0% (v/v) de etilenoglicol, 9,0 a 31,0% (p/v) de sacarose; 0,60 a 22,0% (p/v) dextrano; 0,30 a 4,0% (p/v) de álcool polivinílico e até 100% (v/v) de um diluente, de um modo mais preferido cerca de 17,7% (v/v) de DMSO, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol, cerca de 22,7%
(p/v) de sacarose, cerca de 0,88% de dextrano 1 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 40 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 70 (p/v), cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico e D-PBS até 100% (v/v).
[00126] Em modalidades particulares, o método compreende contatar o material biológico com - uma diluição de 1:16 da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento por pelo menos 0,5 minuto, pelo menos 1 minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 4 minutos ou pelo menos 3 minutos, de um modo preferido pelo menos 3 minutos, - uma diluição de 1:8 da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento por pelo menos 0,5 minuto, pelo menos 1 minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 4 minutos ou pelo menos 3 minutos, de um modo preferido pelo menos 3 minutos, - uma diluição de 1:4 da composição líquida (por exemplo, composição de estoque) como ensinado neste documento por pelo menos 0,5 minuto, pelo menos 1 minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 4 minutos ou pelo menos 3 minutos, de um modo preferido pelo menos 3 minutos, e - uma diluição 1:2 da composição líquida (por exemplo,
composição de estoque), conforme ensinado neste documento por pelo menos 0,5 minuto, pelo menos 1 minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 4 minutos ou pelo menos 3 minutos, de um modo preferido pelo menos 5 minutos, antes de contatar o material biológico com a referida composição (por exemplo, composição de estoque), em que a referida etapa é realizada antes do resfriamento do material biológico.
[00127] Em modalidades particulares, cada etapa de contato do material biológico com a diluição 1:16 da composição líquida, a diluição 1:8 da composição líquida, a diluição 1:4 da composição líquida e a diluição 1:2 da composição líquida é realizada por um período de 0,5 a 10 minutos, de 1 a 6 minutos ou de 3 a 5 minutos, de um modo preferido de 3 a 5 minutos.
[00128] Em modalidades particulares, o resfriamento do material biológico é realizado dentro de 3 minutos, 2 minutos ou 1 minuto, de um modo preferido dentro de 1 minuto, a partir do contato do material biológico com a composição líquida (isto é, diluída ou não diluída) como ensinado neste documento.
[00129] Em modalidades particulares, o referido resfriamento compreende diminuir a temperatura do material biológico para uma temperatura de pelo menos -70 °C, pelo menos -80 °C, pelo menos -90 °C, pelo menos -100 °C, pelo menos -110 °C, pelo menos -120 °C, pelo menos -130 °C, pelo menos -140 °C, pelo menos -150 °C, pelo menos -160 °C, pelo menos -170 °C, pelo menos -180 °C, pelo menos -190 °C ou pelo menos -200 °C. Isto pode ser conseguido por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como por procedimentos de congelamento (por exemplo, congelamento lento) ou vitrificação.
[00130] Em modalidades particulares, o referido resfriamento é realizado por um procedimento de congelamento lento. Em modalidades mais particulares, se o resfriamento for realizado por um procedimento de congelamento lento, a composição líquida é uma diluição, de um modo preferido uma diluição de 1:2 ou 1:4, de um modo mais preferido uma diluição de 1:4; da composição de estoque líquida que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em 13,0 a 23,0% (v/v) de DMSO; 13,0 a 23,0% (v/v) de etilenoglicol, 9,0 a 31,0% (p/v) de sacarose; 0,60 a 22,0% (p/v) de dextrano; 0,30 a 4,0% (p/v) de álcool polivinílico e até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido cerca de 17,7% (v/v) de DMSO, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol, cerca de 22,7% (p/v) de sacarose, cerca de 0,88% de dextrano 1 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 40 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 70 (p/v), cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico e D-PBS até
100% (v/v).
[00131] Em modalidades particulares, o referido método compreende uma vitrificação de uma etapa do material biológico. Em modalidades particulares, se o método compreende uma vitrificação de uma etapa do material biológico, o material biológico é apenas colocado em contato com a composição de estoque líquida não diluída que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em 13,0 a 23,0% (v/v) de DMSO; 13,0 a 23,0% (v/v) de etilenoglicol, 9,0 a 31,0% (p/v) de sacarose; 0,60 a 22,0% (p/v) de dextrano; 0,30 a 4,0% (p/v) de álcool polivinílico e até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido cerca de 17,7% (v/v) de DMSO, cerca de 17,7% (v/v) de etilenoglicol, cerca de 22,7% (p/v) de sacarose, cerca de 0,88% de dextrano 1 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 40 (p/v), cerca de 0,88% de dextrano 70 (p/v), cerca de 0,88% (p/v) de álcool polivinílico e D-PBS até 100% (v/v).
[00132] Em modalidades particulares, a etapa de contatar o material biológico com a composição líquida, conforme ensinado neste documento, é realizada a uma temperatura de 15 °C a 40 °C, de 15 °C a 37 °C, de 20 °C a 37 °C ou de 20 °C a 30 °C. Por exemplo, a cerca de 20 °C.
[00133] Em modalidades particulares, a temperatura do material biológico antes do resfriamento do material biológico é de 15 °C a 40 °C, de 15 °C a 37 °C, de 20 °C a
37 °C ou de 20 °C a 30 °C. Por exemplo, a cerca de 20 °C.
[00134] Em modalidades particulares, o referido método compreende armazenar o material biológico por um período de pelo menos 1 minuto, pelo menos 1 hora ou pelo menos 1 dia, em que o referido armazenamento é realizado após o resfriamento do material biológico, e em que o referido armazenamento é realizado em um temperatura de pelo menos -70 °C, pelo menos -80 °C, pelo menos -90 °C, pelo menos -100 °C, pelo menos -110 °C, pelo menos -120 °C, pelo menos -130 °C, pelo menos -140 °C, pelo menos -150 °C, pelo menos -160 °C, pelo menos -170 °C, pelo menos -180 °C, pelo menos -190 °C ou pelo menos -200 °C, de um modo preferido pelo menos -100 °C, de um modo mais preferido pelo menos -190 °C.
[00135] Em modalidades particulares, o referido método compreende aquecer o material biológico após o resfriamento do material biológico. O aquecimento do material biológico pode ser realizado por quaisquer métodos conhecidos na técnica para aquecer ou aumentar a temperatura de um material biológico resfriado, congelado ou vitrificado.
[00136] Em modalidades particulares, o aquecimento compreende contatar diretamente o material biológico resfriado, de um modo preferido vitrificado, com um meio de cultura para cultivar o referido material biológico, em que o referido meio de cultura tem uma temperatura de pelo menos 25 °C, pelo menos 26 °C, pelo menos 27 °C, pelo menos 28 °C, pelo menos 29 °C, pelo menos 30 °C, pelo menos 31 °C, pelo menos 32 °C, pelo menos 33 °C, pelo menos 34 °C, pelo menos 35 °C, pelo menos 36 °C ou pelo menos 37 °C, por exemplo, 37 °C. Por exemplo, meio de cultura pré-aquecido (por exemplo, a 37 °C) pode ser adicionado diretamente ao material biológico resfriado, de um modo preferido vitrificado. Subsequentemente, a composição líquida para criopreservação como ensinada neste documento pode ser substancialmente separada do material biológico descongelado, por exemplo, por centrifugação.
Posteriormente, o material biológico pode ser colocado em contato com meio de cultura fresco e colocado em cultura.
[00137] O termo "meio de crescimento" ou "meio de cultura", conforme usado neste documento, refere-se a um sólido, líquido ou semissólido projetado para suportar o crescimento de células ou tecido. O meio de crescimento normalmente compreende macronutrientes (por exemplo, nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio ou enxofre), micronutrientes (por exemplo, ferro, manganês, zinco, boro, cobre, molibdênio), vitaminas, aminoácidos, um ou mais açúcares (por exemplo, glicose), sais inorgânicos e/ou proteínas (por exemplo, transferrina). Os meios de crescimento são bem conhecidos na técnica e podem variar dependendo do tipo de célula ou tecido cultivado, bem como da finalidade da cultura (por exemplo, diferenciação, expansão ou manutenção). Exemplos não limitativos de meios de crescimento incluem Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM), Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio Essencial Mínimo modificado alfa (alfa-MEM), Meio Básico Essencial (BME), Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), Meio BGJb, mistura de nutrientes F-12 (Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, meio de Eagle modificado essencial (EMEM), RPMI-1640, meio 199, MB 752/1 de Waymouth ou meio E de Williams, Meio basal de células-tronco mesenquimais e modificações e/ou combinações dos mesmos.
[00138] Os presentes inventores constataram que a composição líquida como descrita neste documento é especialmente benéfica no aquecimento a taxa lenta (por exemplo, incluindo aquecimento do ar ou aquecimento em banho-maria (por exemplo, a uma temperatura de 37 °C)) de material biológico, como embriões de camundongo, em comparação com uma solução de criopreservação de controle.
[00139] Em modalidades particulares, o aquecimento do material biológico compreende aquecer o material biológico resfriado, de um modo preferido vitrificado, expondo o material biológico resfriado, de um modo preferido vitrificado, a um banho de água com uma temperatura de 15 °C a 37 °C (por exemplo, a uma temperatura de cerca de 37 °C) por um período de no máximo 10 segundos, antes de contatar o material biológico com o meio de cultura para cultivar o referido material biológico, em que o referido meio de cultura tem uma temperatura de pelo menos 25 °C, pelo menos 26 °C, pelo menos 27 °C, pelo menos 28 °C, pelo menos 29 °C, pelo menos 30 °C, pelo menos 31 °C, pelo menos 32 °C, pelo menos 33 °C, pelo menos 34 °C, pelo menos 35 °C, pelo menos 36 °C ou pelo menos 37 °C, por exemplo, 37 °C.
[00140] Em modalidades particulares, o aquecimento do material biológico compreende contatar o material biológico com pelo menos uma solução hiperosmótica composta de um crioprotetor não penetrante, como sacarose ou trealose, antes de contatar o material biológico com o meio de cultura para cultivar o referido material biológico com uma temperatura de pelo menos 25 °C.
[00141] Em modalidades particulares, o aquecimento do material biológico compreende contatar o material biológico com pelo menos uma solução de sacarose antes de contatar o material biológico com o meio de cultura para cultivar o referido material biológico com uma temperatura de pelo menos 25 °C, em que pelo menos um solução de sacarose é uma solução de sacarose 1 M, 0,75 M, 0,6 M, 0,5 M, 0,25 M, 0,2 M e/ou 0,1 M, de um modo preferido em uma solução salina balanceada, de um modo mais preferido em
PBS, de um modo ainda mais preferido em D-PBS.
[00142] Em modalidades particulares, o aquecimento do material biológico compreende subsequentemente contatar o material biológico com uma solução de sacarose 1 M, 0,75 M, 0,5 M e 0,25 M antes de contatar o material biológico com o meio de cultura para cultivar o referido material biológico com um temperatura de pelo menos 25 °C.
[00143] Em modalidades particulares, os métodos ensinados neste documento permitem que o material biológico permaneça viável após ser aquecido (por exemplo, aquecido ou descongelado).
[00144] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com suas modalidades específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para aqueles versados na técnica à luz da descrição anterior. Por conseguinte, destina-se a abranger todas as alternativas, modificações e variações como segue na essência e no amplo escopo das reivindicações anexas.
[00145] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar melhor modalidades particulares e não devem ser considerados limitativos do pedido. O pedido é limitado apenas pelas reivindicações.
EXEMPLOS Exemplo 1. As composições da presente invenção permitem criopreservar com sucesso células, gametas e embriões
Materiais e métodos Composição da solução de criopreservação (CDCS)
[00146] A Solução de Criopreservação Quimicamente Definida (CDCS) é composta conforme indicado na tabela 1 para sua concentração de estoque de referência (1x concentrada). De acordo com os protocolos, esta solução central pode ser usada não diluída ou diluída para atender a requisitos metodológicos/criobiológicos peculiares. As quantidades de cada um dos componentes da CDCS no estoque não diluída podem variar relativamente entre si dentro dos intervalos indicados na tabela 1, sem alterar significativamente as propriedades de condicionamento ou de crioproteção.
Tabela 1: Composição da solução estoque CDCS (1x concentrada) faixas relativas Componente Composição final preferidas D-PBS ou solução osmoticamente e fisiologicamente Diluente Diluente equivalente Dimetilsulfóxido 17,7% v/v 13,3 a 22,1% v/v (DMSO) Etilenoglicol (EG) 17,7% v/v 13,3 a 22,1% v/v Sacarose (SUC) 22,7% p/v 9,1 a 30,3% p/v Dextrano 1 (D1) 0,88% p/v 0,2 a 8,8% p/v Dextrano 40 (D40) 0,88% p/v 0,2 a 8,8% p/v Dextrano 70 (D70) 0,88% p/v 0,2 a 8,8% p/v Álcool 0,88% p/v 0,3 a 3,5% p/v polivinílico (PVA) Composição da solução de vitrificação de referência (VSE)
[00147] Uma solução de vitrificação de embriões de referência comumente usada (VSE, Vanderzwalmen et al., 2013) tem sido usada como um ponto de comparação para várias propriedades de CDCS. A Tabela 2 compara as composições de CDCS e VSE. Esta solução de referência é muito semelhante às soluções comerciais comumente usadas em TRA (por exemplo, FertiVit™ da Fertipro).
Tabela 2: Comparação da solução estoque CDCS (1x concentrada) e VSE CDCS (1x), Componente VSE, composição final composição final D-PBS ou solução osmoticamente e Diluente Diluente fisiologicamente equivalente Dimetilsulfóxido 17,7% v/v 20% v/v (DMSO) Etilenoglicol (EG) 17,7% v/v 20% v/v Sacarose (SUC) 22,7% p/v 17,1% p/v Dextrano 1 (D1) 0,88% p/v - Dextrano 40 (D40) 0,88% p/v - Dextrano 70 (D70) 0,88% p/v - Álcool 0,88% p/v - polivinílico (PVA) Ficoll 400 - 1% p/v Soro fetal de - 10% v/v vitela (FCS) Sulfato de - 0,005% p/v streptomicina Monossulfato de - 0,01% p/v kanamicina Teste físico da capacidade de vitrificação da CDCS
[00148] A capacidade de vitrificação da CDCS não diluída (ou seja, sua solidificação sem formação de cristais) após o resfriamento e a ausência ou a formação de cristais após o aquecimento subsequente foi avaliada usando um teste físico. VSE, CDCS(-) (uma solução intimamente relacionada à CDCS, mas sem PVA, que foi desenvolvida por nós como um precursor menos eficiente) e CDCS foram aspiradas com uma seringa em canudos francesas de sêmen de 250 l (Minitube ref. 13407/0010) que foram posteriormente fechadas com um tampão em sua extremidade inferior. Os canudos foram mergulhadas e agitadas em nitrogênio líquido (LN2) e a seguir aquecidas em banho-maria a 37 °C. O estado de vitrificação/cristalização após o resfriamento e o subsequente aquecimento foi avaliado por exame visual: uma solução submetida ao resfriamento ou ao aquecimento ao longo de sua temperatura de transição vítrea permanece límpida e transparente após a vitrificação, enquanto a cristalização induz um aspecto branco/leitoso.
Ensaios de estabilidade da CDCS
[00149] A CDCS foi submetida a ensaios de estabilidade quando mantida (i) a 4 °C, (ii) à temperatura ambiente (22 +/- 4 °C), (iii) durante duas semanas à temperatura ambiente seguido de armazenamento à 4 °C, (iv) a 37 °C e (v) durante duas semanas a 37 °C seguido de armazenamento à 4 °C. As alíquotas foram testadas um dia após a fabricação (D1) e subsequentemente em vários momentos abrangendo o dia 7 (D7), D14 e após um (M1), dois (M2), três (M3) e seis (M6) meses. Os parâmetros registrados foram (i) aspecto normal/anormal após exame visual (turbidez, precipitados...) e (ii) eficiência da vitrificação de embrião de murino em uma etapa, conforme descrito a seguir (cepa FVB/N).
Criopreservação de embriões, oócitos e células com CDCS Embriões de camundongo Produção e cultura
[00150] Camundongos consanguíneos C57BL6/JRj (Janvier Labs, França) foram usados neste exemplo. Oócitos fertilizados foram fornecidos pela Central Mouse Facility da University of Liège. Zigotos com dois pró-núcleos e citoplasma de aparência normal foram mantidos para uso posterior. Se aplicável, foram cultivados em gotas de 50 l de meio M16 sob óleo mineral, em atmosfera saturada de água a 37 °C sob 5% de CO2 até o tratamento. Os embriões no estágio de 2 células foram submetidos à vitrificação ou mantidos como controles não criopreservados.
Vitrificação
[00151] A vitrificação de embriões foi realizada usando um método de uma etapa usando a CDCS ou a VSE divulgada acima. Resumidamente, os embriões são colhidos do seu meio de cultura e transferidos para uma gota de 500 l de CDCS ou VSE. Eles são movidos várias vezes para a solução de vitrificação para eliminar a ganga do meio de cultura. Em seguida, eles são colhidos em 0,3 a 1 l do meio de vitrificação em um carreador (VitriVet™, Vitrimed, Bregenz, Áustria), que é inserido em um canudo protetor. A canudo é selada e diretamente mergulhada e agitada em LN2.
Desde a transferência dos embriões para a CDCS ou a VSE até o seu mergulho no LN2, não leva mais de 60 segundos.
Aquecimento
[00152] O aquecimento foi realizado pelo menos 24 horas após o resfriamento. O carreador VitriVet™ foi extraído de seu canudo protetor enquanto ainda estava pendurado no LN2. A calha de VitriVet™ é (i) agitada suavemente ao ar livre durante 10 segundos e, subsequentemente, imersa em meio de cultura quente (37 °C), ou então (ii) diretamente imersa no meio de cultura sem a etapa de aquecimento do ar.
Cultura e parâmetros
[00153] Os parâmetros registrados foram a sobrevivência precoce e o desenvolvimento até o estágio de blastocisto. A sobrevivência precoce foi avaliada avaliando a morfologia da zona pelúcida e blastômeros uma hora após o aquecimento. O desenvolvimento até o estágio de blastocisto foi observado e registrado no dia 5 de desenvolvimento (D5).
Oócitos metafase 2 de camundongo (MII)
[00154] Camundongos consanguíneos FVB/NRj e
C57BL6/JRj (Janvier Labs, França) foram usados neste estudo. Oócitos MII foram colhidos, submetidos à mesma vitrificação e aquecimento dos embriões, mas apenas com CDCS e aquecimento direto no meio de cultura.
Posteriormente, foram submetidos à fertilização in vitro (FIV) com esperma congelado. Os oócitos fertilizados foram colocados em cultura por 48 horas a 5 dias. Embriões em estágios de duas células obtidos após 48 horas foram autorizados a continuar seu desenvolvimento até o estágio de blastocisto (D5) ou transferidos para o oviduto de mães pseudo-grávidas B6CBAF1/JRj (Janvier Labs, França) usando procedimentos padrão (Nagy A.; Vintersten K.; Behringer R.
2003). A fertilização bem-sucedida, o desenvolvimento para os estágios de 2 células e blastocisto e as taxas de natalidade após a transferência foram registrados como parâmetros.
Embriões humanos e oócitos MII
[00155] A vitrificação de embriões em estágio de blastocisto aneuploide e de oócitos humanos MII foi realizada em conformidade com os regulamentos legais e éticos em vigor. A CDCS foi usada em várias diluições em D- PBS e na forma não diluída, seguindo um protocolo de equilíbrio de várias etapas antes do resfriamento. Após o aquecimento, os procedimentos de equilíbrio de várias etapas em soluções SUC foram aplicados antes da cultura.
Blastocistos
[00156] Vinte blastocistos aneuploides previamente vitrificados e aquecidos usando um procedimento clássico foram subsequentemente revitrificados com CDCS usando o sistema de portador fechado VitriSafe® (VitriMed, Áustria).
Antes do resfriamento, os embriões foram equilibrados em várias diluições (em D-PBS) de CDCS e, finalmente, em CDCS não diluída. Resumidamente, os blastocistos foram imersos por 5 minutos em 50 l de CDCS 25% (v/v) seguido por 4 a 6 minutos em 50 l de CDCS 50% (v/v). Posteriormente, os blastocistos foram transferidos em uma gota de CDCS não diluída de 100 l por aproximadamente 60 segundos, o que inclui o tempo necessário para carregar os embriões no carreador em uma microgotícula de 0,3 l a 1,0 l de CDCS, inserir em um canudo protetor, selar e mergulhar em LN2.
[00157] Para aquecimento, os carreadores VitriSafe® foram removidos usando uma ferramenta extratora. As pontas dos carreadores foram imersas em 1 ml de solução SUC 1 M (em D-PBS) à temperatura ambiente. Após 30 segundos, os blastocistos foram transferidos em SUC 0,75 M por mais 30 segundos, seguido por 1 minuto em SUC 0,5 M e 2 minutos em SUC 0,25 M. Os blastocistos foram finalmente transferidos para o meio de cultura apropriado.
[00158] O estado morfológico e de “saúde” dos blastocistos tratados foram registrados imediatamente após o aquecimento e após 18 horas em cultura.
Oócitos MII
[00159] Dez oócitos MII foram submetidos a um protocolo de vitrificação semelhante aos blastocistos, mas com pequenas modificações nas etapas de pré-resfriamento e equilíbrio de aquecimento. Antes do resfriamento, os oócitos foram imersos sequencialmente em gotículas de 50 l de CDCS diluído (em D-PBS) como segue: 3 minutos em CDCS 6,25% (v/v), 3 minutos em 12,5%, 3 minutos em 25% (v/v) e 5 minutos em 50%. Posteriormente, eles foram transferidos em uma gota de CDCS não diluída de 100 l por aproximadamente 60 segundos antes de serem mergulhados em LN2 da mesma maneira descrita aqui acima para blastocistos.
[00160] Para o aquecimento, a ponta do carreador foi imersa em 1 ml de SUC 1 M e os embriões foram transferidos nessa solução por 1 minuto, seguido por SUC 0,5 M por 3 minutos, SUC 0,25 M por 2 minutos e SUC 0,125 M por 2 minutos. Os oócitos foram finalmente transferidos para o meio de cultura apropriado. O estado morfológico e de “saúde” dos oócitos tratados foram registrados imediatamente após o aquecimento e após 18 horas em cultura.
Células-tronco mesenquimais equinas
Isolamento e cultura
[00161] As células-tronco mesenquimais isoladas de cadáveres equinos (EC-MSCs, presente do Prof N. Antoine, U.
Liège) foram mantidas em DMEM + GlutaMAX (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) e 1% Pen/Strep (Gibco) a 37 °C com 5% de CO2. A uma confluência de 70 a 80%, as células foram passadas usando Tripsina-EDTA a 0,05% (Gibco).
Vitrificação e aquecimento
[00162] Para a vitrificação em um formato de uma etapa, as células foram destacadas e alíquotas de 106 células foram preparadas. Após a centrifugação, os pellets celulares foram ressuspensos em 220 l de CDCS (previamente equilibrada à temperatura ambiente), transferidos para criotubos de 1,8 ml (Nunc) e mergulhados em LN2 durante a agitação, respeitando um intervalo de tempo de 30 s entre o primeiro contato das células com CDCS e imersão em LN2. As células foram armazenadas em tanque de LN2 por pelo menos 24 h. Para cada experimento, alíquotas de células não tratadas foram semeadas e analisadas, referidas como controles não vitrificados.
[00163] As células vitrificadas foram subsequentemente aquecidas retirando os criotubos do LN2, trazendo e mantendo sua parte inferior em banho-maria a 37 °C enquanto adicionava diretamente 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (37 °C) e pipetava suavemente para cima e para baixo. As suspensões de células foram então transferidas para tubos cônicos contendo 3 ml de meio de cultura completo, centrifugadas, ressuspensas em meio fresco e semeadas em placas de 6 poços.
Congelamento lento (SLF) e descongelamento
[00164] Para SLF, as células foram destacadas e igualmente distribuídas em quatro grupos. Após a centrifugação, os pellets celulares foram ressuspensos em qualquer meio de cultura (controle não criopreservado), 10% de DMSO no meio de cultura (Ref.) ou em uma diluição de 25% ou 50% de CDCS em D-PBS a uma concentração de 106 células/ml. Alíquotas de 1 ml (106 células) foram então distribuídas em criotubos de 1,8 ml (Nunc) que foram colocados durante a noite em dispositivos Mr Frosty™ (Nalgene) em um freezer a -80 °C antes do armazenamento em LN2. As células foram armazenadas no tanque de LN2 por pelo menos 4 h. As células não tratadas foram semeadas e analisadas, referidas como controles não criopreservados.
[00165] As células congeladas foram posteriormente aquecidas retirando os criotubos do LN2, trazendo e mantendo sua parte inferior em banho-maria a 37 °C.
Imediatamente após o descongelamento, foi adicionado 1 ml de meio de cultura e misturado pipetando para cima e para baixo. As suspensões de células foram então transferidas para tubos cônicos contendo 3 ml de meio de cultura. Cada amostra foi ajustada para 10 ml pela adição de meio de cultura, centrifugada, ressuspensa em 1 ml de meio fresco e semeada em placas de 6 poços.
Gravação de parâmetros
[00166] A viabilidade celular foi avaliada 24 horas após o descongelamento ou pós-passagem (para controles não vitrificados) em células destacadas após tripsinização usando um ensaio de exclusão de azul de tripano (TC20 Cell Counter, Bio-Rad).
[00167] A confluência foi avaliada nos momentos indicados analisando 5 imagens aleatórias por poço usando a câmera de microscópio DP22 junto com o software CKX-CCSW Confluency Checker (Olympus).
Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) Origem das células e cultura
[00168] Uma linhagem hiPSC (dKIPs, presente do Prof.
Dr F. Edenhofer, U. Bonn) foi submetida a congelamento lento usando CDCS. Elas foram cultivadas em placas de cultura de células de 6 poços revestidas com vitronectina, em meio Essential 8™ Flex (Gibco) suplementado com 0,5% de Pen/Strep (Gibco) a 37 °C com 5% de CO2.
Congelamento lento (SLF)
[00169] Para SLF, as placas de cultura foram lavadas suavemente com D-PBS, as células foram separadas como agregados dos poços usando ReLeSR™ (StemCell Technologies), suspensas em meio Essential 8™ -Flex, agrupadas e igualmente distribuídas em três grupos. Um grupo não recebeu nenhum tratamento e foi colocado de volta em cultura diretamente (controle não criopreservado). Após a centrifugação, os pellets celulares foram ressuspensos em CryoStor® CS10 (STEMCELL Technologies) ou em uma diluição de 50% de CDCS em D-PBS a uma concentração correspondente a 1 poço de cultura/ml. Alíquotas de 1 ml (equivalente à quantidade de células em 1 poço) foram então distribuídas em criotubos de 1,8 ml (Nunc) que foram colocados durante a noite em dispositivos Mr Frosty™ (Nalgene) em um freezer a -80 °C antes do armazenamento em LN2. As células foram armazenadas no tanque de LN2 por pelo menos 4 h.
Descongelamento
[00170] As células congeladas foram posteriormente aquecidas retirando os criotubos do LN2, trazendo e mantendo sua parte inferior em banho-maria a 37 °C.
Imediatamente após o descongelamento, 1 ml de meio de cultura Essential 8™ Flex foi adicionado e misturado pipetando suavemente para cima e para baixo. As suspensões de células foram então transferidas para tubos cônicos contendo 3 ml de meio de cultura. Cada amostra foi ajustada para 10 ml adicionando meio de cultura, centrifugado e ressuspenso em 1 ml de meio fresco. Cada amostra foi semeada em quatro poços de placas de 6 poços revestidas com vitronectina.
Gravação de parâmetros
[00171] A viabilidade celular foi avaliada 24 horas após o descongelamento (ou pós-passagem para controles não congelados) em células destacadas (StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, Gibco) usando um ensaio de exclusão de azul de tripano (TC20 Cell Counter, Bio-Rad).
[00172] A confluência foi avaliada nos momentos indicados analisando 5 imagens aleatórias por poço usando a câmera de microscópio DP22 junto com o software CKX-CCSW Confluency Checker (Olympus).
Resultados Teste físico da capacidade de vitrificação da CDCS
[00173] Conforme mostrado na tabela 3, a CDCS não sofre qualquer cristalização após o resfriamento em LN2 nem após o aquecimento em um banho de água a 37 °C. Nas mesmas condições padronizadas, VSE sofre cristalização após resfriamento em metade das amostras, enquanto todas as amostras de CDCS(-) (precursor de CDCS sem PVA) sofrem cristalização após aquecimento. Em conclusão, tanto a solução de VSE de referência quanto a CDCS(-) (CDCS sem PVA) não permitem a vitrificação consistente e permitem a formação rápida de cristais no resfriamento (VSE) ou aquecimento (CDCS(-)) no sistema proposto com relativamente alta inércia térmica. Espera-se que esta cristalização rápida de VSE e CDCS(-) seja deletéria para as células que pode conter. CDSC, portanto, é demonstrado ser uma solução inibidora de cristal de gelo forte, ainda mais forte do que uma composição de vitrificação renomada (VSE, cuja composição é muito semelhante às soluções comerciais usadas em Procriação com Assistência Médica (MAP)), e em condições que causam taxas de resfriamento e aquecimento mais lentas do que geralmente recomendado.
Tabela 3: Testes de vitrificação física de VSE, CDCS(-) e
CDCS Solução de ID do canudo Resfriamento Aquecimento vitrificação VSE VSE1 V V VSE2 C C VSE3 C C VSE4 V V CDCS(-) CDCS(-)1 V C CDCS(-)2 V C CDCS(-)3 V C CDCS(-)4 V C CDCS CDCS1 V V CDCS2 V V CDCS3 V V CDCS4 V V Esta tabela relata os resultados de um teste de vitrificação física padronizado. Três soluções de vitrificação (VSE, CDCS(-) e CDCS) foram aspiradas e seladas em 250 l de canudo francês, resfriadas em LN2 e posteriormente aquecidas em banho-maria a 37 °C. Os estados vitrificados ou cristalizados foram avaliados no resfriamento e aquecimento por exame visual. “V” significa vitrificação e “C” significa cristalização.
Ensaios de estabilidade de CDCS
[00174] A CDCS foi submetida a ensaios de estabilidade quando armazenada por várias semanas a 4 °C, temperatura ambiente, 37 °C e combinações de temperatura ambiente ou 37 °C com posterior armazenamento à 4 °C.
Conforme mostrado na tabela 4, e apesar da ausência de qualquer agente antimicrobiano, nenhuma alteração perceptível de CDCS foi observada ao longo do tempo, sejam quais forem as condições de armazenamento, conforme avaliado por inspeção visual da solução (sem turvação nem precipitados) ou sua eficácia na vitrificação de embriões.
[00175] Em conclusão, as propriedades da composição de CDCS são notavelmente estáveis ao longo do tempo, mesmo em condições de temperatura desfavoráveis e apesar da ausência de qualquer agente antimicrobiano. Na verdade, o armazenamento à 4 °C, bem como 37 °C (e, também, em condições de temperatura intermediária e mista) por até 6 meses não altera seu aspecto óptico/físico, nem sua alta eficiência na vitrificação de embriões de murinos.
Tabela 4: Testes de estabilidade da CDCS em várias condições de armazenamento Armazenamento à 4 °C No. de No. de % de No. de % de Inspeção Momento Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos visual D1 21 21 100% 14 67% OK D7 21 21 100% 14 67% OK
D14 19 19 100% 19 100% OK M1 20 20 100% 19 95% OK M2 21 21 100% 19 90% OK M3 20 20 100% 18 90% OK M6 20 20 100% 14 70% OK
Armazenamento à temperatura ambiente No. de No. de % No. de % Inspeção Momento Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos visual D7 21 21 100% 13 62% OK D14 20 20 100% 12 60% OK M1 21 21 100% 16 76% OK M3 21 21 100% 14 67% OK M6 20 20 100% 17 85% OK
Armazenamento à temperatura ambiente (14D) depois 4°C No. de No. de % No. de % Inspeção Momento Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos visual D14 21 21 100% 13 62% OK M1 21 21 100% 18 86% OK M3 21 21 100% 13 62% OK M6 17 17 100% 14 82% OK
Armazenamento à 37°C No. de No. de % No. de % Inspeção Momento Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos visual D7 21 21 100% 12 57% OK D14 21 20 95% 14 70% OK M1 20 20 100% 19 95% OK M2 21 21 100% 16 76% OK M3 18 18 100% 15 83% OK M6 20 20 100% 20 100% OK
Armazenamento à 37°C (14D) depois 4°C No. de No. de % No. de % Inspeção Momento Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos visual D14 21 21 100% 17 81% OK M1 20 20 100% 20 100% OK M3 12 12 100% 11 92% OK M6 21 21 100% 20 95% OK Esta tabela mostra os resultados dos testes de estabilidade realizados em alíquotas de CDCS em várias condições de armazenamento (4 °C, temperatura ambiente, temperatura ambiente durante 14 dias seguido de armazenamento à 4 °C, 37 °C e 37 °C durante 14 dias seguido por armazenamento à 4 °C). Os momentos para registros foram 7 dias (D7), 14 dias (D14), 1, 2, 3 ou 6 meses (M1, M2, M3, M6) após a fabricação da solução. Após a inspeção visual das alíquotas avaliando o aspecto normal, ela foi usada como uma solução de vitrificação para vitrificação em uma etapa de embriões FVB/N de murinos no estágio de 2 células.
Para cada ponto final, o número de embriões vitrificados, sua sobrevivência imediata após o aquecimento e seu desenvolvimento até o estágio de blastocisto foram registrados.
Criopreservação de embriões, oócitos MII e células com CDCS Embriões de camundongo
[00176] Embriões de camundongo em estágio de duas células da cepa C57BL6/JRj foram submetidos a dois protocolos de vitrificação/aquecimento usando a solução de vitrificação VSE de referência ou CDCS não diluída.
Resumidamente, o resfriamento era o mesmo (uma etapa) para ambos os protocolos, mas o aquecimento era diferente. O aquecimento foi em taxa rápida mergulhando diretamente a gota vitrificada contendo os embriões em meio de cultura aquecido ou em taxa mais lenta devido a uma primeira etapa de aquecimento ao ar livre durante 10 segundos antes da imersão no meio (ver M&M). Conforme mostrado na tabela 5, após aquecimento lento (ar), a sobrevivência embrionária inicial foi melhor com CDCS do que com VSE (p = 0,026).
Tabela 5: Vitrificação e aquecimento rápido/lento de embriões de camundongo com CDCS
No. de No. de % No. de % Tratamento/sessão Embriões Sobrevivência Sobrevivência Blastocistos Blastocistos CDCSmed/1 19 13 68% 8 42% CDCSmed/2 36 34 94% 28 78% CDCSmed/Total 55 47 85% 36 65% CDCSair/1 19 18 95% 12 63% CDCSair/2 36 32 89% 22 61% CDCSair/Total 55 50a 91% 34 62% VSEmed/1 20 13 65% 5 25% VSEmed/2 36 32 89% 25 69% VSEmed/Total 56 45 80% 30 54% VSEair/1 19 11 58% 6 32% VSEair/2 37 31 84% 26 70% VSEair/Total 56 42b 75% 32 57% Control/1 16 16 100% 11 69% Control/2 24 24 100% 23 96% Control/Total 40 40 100% 34 85% Esta tabela mostra os resultados da vitrificação e do aquecimento de embriões em estágio de 2 células de camundongo
C57BL6/JRj.
Junto com controles não criopreservados, dois experimentos separados foram conduzidos (sessões 1 e 2). A CDCS foi comparada à VSE em protocolos de vitrificação de uma etapa seguida de aquecimento por imersão direta do embrião no meio de cultura (med) ou por aquecimento de taxa mais lenta no ar seguido por imersão no meio (ar). São indicados os números de embriões submetidos aos testes (No. de Embriões) juntamente com os que sobreviveram ao tratamento (No. de Sobrevivência),
evoluindo para a fase de blastocisto no D5 (No. de
Blastocistos). Quando relevante, os valores de sobrevivência e de desenvolvimento foram marcados com sobrescrito, comparados entre si usando um teste de Qui quadrado (1 df) e os valores de
P correspondentes foram calculados: ab: 0,026.
Oócitos MII de camundongo
[00177] Camundongos das cepas C57BL6/JRj e FVB/NRj foram submetidos à vitrificação em uma etapa com CDCS não diluída. Posteriormente, foram fertilizados in vitro com espermatozoides congelados e foram deixados se desenvolver in vitro até o estágio de blastocisto ou transferidos para mães pseudo-grávidas para monitorar seu desenvolvimento in vivo (parâmetro = nascimento de recém-nascidos vivos).
Conforme mostrado na tabela 6, a vitrificação de oócitos com CDCS permite a fertilização in vitro eficiente, bem como o desenvolvimento in vitro e in vivo dos embriões resultantes em taxas semelhantes às observadas com protocolos de vitrificação usuais (F.J. Ectors, comunicação pessoal).
Tabela 6: Desenvolvimento de embriões produzidos após FIV de oócitos vitrificados com CDCS Tratamento/ Oócitos Zigotos 2 células Blastocistos Recém-nascidos No. de No. de Cepa No. No. % No. % No. % No. % início transf. C57BL6/JRj 382 362a 95% 191c 50% 105 85e 81% 50 29g 58% NV controle 466 447b 96% 310d 67% 132 102f 77% 65 32h 49% FVB/NRj 414 337i 81% 230k 56% 124 69m 56% 80 29o 36% NV controle 514 501j 97% 400l 78% 185 163n 88% 65 31p 47% Esta tabela mostra os resultados do desenvolvimento de C57BL6/JRj e FVB/NRj de embriões produzidos por FIV de oócito de camundongo vitrificado em uma etapa com CDCS. Os controles não vitrificados (NV) foram produzidos da mesma forma com oócitos frescos não vitrificados. Os números de oócitos submetidos aos testes são indicados (No. de Oócitos) juntamente com os zigotos resultantes (No. de Zigotos) e embriões em estágio de 2 células (No. de 2 células). Alguns embriões em estágio de 2 células foram mantidos em cultura (No. de início) para avaliar o desenvolvimento até o estágio de blastocisto (No. de Blastocistos), ou foram transferidos (No. de transf.) Para avaliar o número de recém-nascidos resultantes (No. de recém- nascidos). Todas as percentagens correspondentes em relação ao número inicial de oócitos são indicadas. Os valores de desenvolvimento após a vitrificação dos oócitos foram comparados aos controles NV, e foram marcados com sobrescrito, comparados entre si usando um teste de Qui quadrado (1 df) e os valores de P correspondentes foram calculados: ab: 0,423; cd: 1,121 x 10-6; ef: 0,490; gh: 0,350; ij: 1,987 x 10-16; kl: 5,153 x 10-13; mn: 1,002 x 10-10; op: 0,164.
Blastocistos humanos
[00178] Conforme mostrado na tabela 7, alíquotas de CDCS diluídas e não diluídas foram usadas em um procedimento de várias etapas para vitrificar blastocistos aneuploides. A partir de 20 embriões, 18 e 17 pareceram saudáveis e intactos diretamente após o aquecimento e após 18 horas de cultura, respectivamente.
Tabela 7: Vitrificação de blastocistos aneuploides humanos com CDCS Protocolo (Blastocistos aneuploides humanos D5) Resfriamento CDCS em D-PBS 25 50
(%) Tempo de exposição 4 a 5 4 (min) Aquecimento SUC em HTF/HSA (8/2; 1 0,75 0,5 0,25 M) Tempo de exposição 0,5 0,5 1 2 (min) Resultados (Blastocistos aneuploides humanos D5) Número total tratado Sobrevivência pós-aquecimento no tempo t=0 t=18 horas 20 18 intacto 17 intacto Esta tabela mostra o protocolo de resfriamento aplicado com diluições de CDCS (quadro superior) e o protocolo de aquecimento com SUC. As diluições de CDCS são expressas em % (v/v) e o conteúdo de SUC como uma molaridade (M). HTF é um meio de cultura para embriões, HSA significa albumina de soro humano. A sobrevivência/integridade dos blastocistos diretamente após o aquecimento e após 18 horas de cultura é mostrada no quadro inferior.
Oócitos MII humanos
[00179] Conforme mostrado na tabela 8, alíquotas de CDCS diluídas e não diluídas foram usadas em um procedimento de várias etapas para vitrificar oócitos MII humanos. Todos os 10 oócitos submetidos ao estudo pareciam saudáveis e intactos logo após o aquecimento e após 18 horas de cultivo, respectivamente.
Tabela 8: Vitrificação de oócitos MII humanos com CDCS Protocolo (oócitos MII humanos) Resfriamento
CDCS em D-PBS 6,25 12,5 25 50 100 (%) Tempo de exposição 3 3 3 5 1 (min) Aquecimento SUC em HTF/HSA (8/2; 1 0,5 0,25 0,125 M) Tempo de exposição 1 3 2 2 (min) Resultados (oócitos MII humanos) Número total tratado Sobrevivência pós-aquecimento no tempo t=0 t=18 horas 10 10 intacto 10 intacto Esta tabela mostra o protocolo de resfriamento aplicado com diluições de CDCS (quadro superior) e o protocolo de aquecimento com SUC. As diluições de CDCS são expressas em % (v/v) e o conteúdo de SUC como uma molaridade (M). HTF é um meio de cultura para embriões, HSA significa albumina do soro humano. A sobrevivência/integridade dos oócitos diretamente após o aquecimento e após 18 horas de cultura é mostrada no quadro inferior.
Células-tronco mesenquimais equinas Vitrificação e aquecimento em uma etapa
[00180] A vitrificação em uma etapa seguida por procedimentos de aquecimento em uma etapa foram realizados em EC-MSCs usando CDCS em criotubos. Vinte alíquotas de 106 células foram submetidas ao procedimento de vitrificação/aquecimento junto com 17 controles não vitrificados. Os valores de viabilidade celular e de confluência (que é um indicador composto de viabilidade e capacidade de proliferação) de amostras vitrificadas foram muito semelhantes aos controles (Figura 1), embora as viabilidades fossem estatisticamente diferentes, provavelmente devido à alta repetibilidade dos resultados (SD reduzido) e perda de células inevitável durante o próprio processo de manipulação. Além disso, os aspectos morfológicos das culturas de EC-MSCs após a vitrificação em uma etapa usando CDCS ou como controles não vitrificados são indistinguíveis (Figura 2).
Congelamento e descongelamento lentos
[00181] O SLF foi realizado em EC-MSCs usando CDCS diluídas 2x e 4x, bem como um método de referência comumente usado (10% DMSO, v/v). A Fig. 3 mostra que ambas as diluições de CDCS são tão eficientes quanto o método de referência, terminando com viabilidade celular quase igual à das células não criopreservadas 24 horas após o aquecimento. O mesmo se aplica para a confluência de células onde todos os três tratamentos dão resultados semelhantes, exibindo um atraso de confluência de aproximadamente 1 dia em comparação com células não criopreservadas.
Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs)
[00182] O SLF foi realizado em hiPSCs usando CDCS diluída 2x e uma solução comercial otimizada (CryoStor® CS10). Como mostrado na Fig. 4, a viabilidade celular usando CDCS diluída é em média de 29,6% 24 horas após o descongelamento, que é a mesma ordem após o uso do CryoStor CS10 (41,8%), embora estatisticamente diferente. Além disso, a confluência permanece semelhante ao longo do tempo (1 a 7 dias), atingindo o nível de células não criopreservadas no dia 5.
[00183] Os resultados fornecidos neste documento demonstram que as composições da presente invenção fornecem soluções eficientes, estáveis, biologicamente seguras e reproduzíveis para criopreservar células vivas, embriões e gametas de vários organismos, incluindo humanos, seguindo vários métodos, usando vários dispositivos e em formas diluídas ou não diluídas.
Exemplo 2: As composições da presente invenção (CDCS) permitem uma criopreservação mais eficiente de embriões de murinos do que as soluções Ref1 e Ref2 Materiais e métodos Composições de soluções de criopreservação
[00184] A Solução de Criopreservação Quimicamente Definida (CDCS) é composta conforme indicado na tabela 1 para sua concentração de estoque de referência (1x concentrada). De acordo com os protocolos, esta solução central pode ser usada não diluída ou diluída para atender a requisitos metodológicos/criobiológicos peculiares. As quantidades de cada um dos componentes da CDCS no estoque não diluída podem variar relativamente entre si dentro dos intervalos indicados na tabela 1, sem alterar significativamente as propriedades de condicionamento ou de crioproteção.
[00185] Solução de criopreservação de referência 1 (também referida aqui como "solução Ref1") se refere a uma solução de criopreservação conforme descrito no pedido de patente internacional WO 2010/046949 A1 tendo uma composição conforme descrito na tabela 9.
Tabela 9: Composição da solução Ref1 Componente Concentração Etilenoglicol 7,5% DMSO 7,5% Sacarose 0,5M PVA 0,1% Ficoll 1% Hialuronano 0,05% Solução de cultura tamponada em
[00186] Solução de criopreservação de referência 2 (também referida neste documento como "solução Ref2") se refere a uma solução descrita em "Lopez M. et al, Chemically defined and xeno-free cryopreservation of human adiose-derived stem cells, 2016, PLOS ONE, vol. 11 (3): 1 a 15” tendo uma composição conforme descrito na tabela 10.
Tabela 10: Composição da solução Ref2 Componente Concentração Etilenoglicol 3,5% DMSO 3,5% Meio de cultura tamponada em HEPES contendo Trealose 0,25M PVA 2%
Ficoll 5% EGTA 0,1mM Teste físico da capacidade de vitrificação
[00187] As capacidades de vitrificação de CDCS, solução Ref1 e solução Ref2 (isto é, sua solidificação sem formação de cristal) após resfriamento e a ausência ou formação de cristal após aquecimento subsequente foram avaliadas usando um teste físico. CDCS, solução Ref1 ou solução Ref2 foram aspiradas com uma seringa em canudos franceses de 250 l (Minitube ref. 13407/0010) que foram posteriormente fechados com um tampão na sua extremidade inferior. Os canudos foram mergulhados e agitados em nitrogênio líquido (LN2) e a seguir aquecidos em banho- maria a 37 °C.
Embriões de camundongo
[00188] Camundongos FVB/N x CD1 foram usados neste exemplo. Oócitos fertilizados foram fornecidos pela Central Mouse Facility da University of Liège. Zigotos com dois pró-núcleos e citoplasma de aparência normal foram mantidos para uso posterior. Se aplicável, foram cultivados em gotas de 50 l de meio M16 sob óleo mineral, em atmosfera saturada de água a 37 °C sob 5% de CO2 até o tratamento.
Embriões na fase de blastocisto (~5 dias de desenvolvimento) foram submetidos ao processo de vitrificação/aquecimento.
Vitrificação e aquecimento
[00189] A vitrificação de embriões foi realizada usando um método de uma etapa usando a CDCS descrito acima, soluções de solução Ref1 ou solução Ref2 (doravante denominadas "soluções").
Pré-carregamento dos canudos
[00190] Canudos franceses de 0,25 ml (CryoBioSystem) foram usados como carreadores para vitrificar os embriões.
[00191] O canudo é conectado pelo lado do tampão de algodão a uma seringa de 1 ml. Cinquenta milímetros (mm) de DPBS (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) (doravante referido como DPBS-F10) são carregados, seguido por aspiração de 10 mm de ar. Os canudos preenchidos são dispostos horizontalmente em temperatura ambiente até o uso (carregamento dos embriões).
Condicionamento e resfriamento dos embriões
[00192] Resumidamente, grupos de no máximo 5 embriões são colhidos de seu meio de cultura e transferidos para uma gota de solução de 500 l. Eles são movidos várias vezes para a solução para eliminar sua ganga de meio de cultura. Em seguida, eles são colhidos e transferidos para gotas de solução de 50 l. Os embriões são carregados por aspiração no canudo juntamente com uma coluna de solução de 10 mm, seguida por 10 mm de ar e, finalmente, por DPBS-F10 até que o algodão se molhe com a coluna DPBS-F10 pré-
carregada. O canudo é selado e mergulhado diretamente e agitado em nitrogênio líquido (LN2). Desde a transferência dos embriões para as soluções até o seu mergulho no LN2, não leva mais de 60 segundos.
Aquecimento e cultivo dos embriões
[00193] O aquecimento foi realizado pelo menos 24 horas após o resfriamento. O canudo é retirado do LN2, deixado aquecer por 5 segundos ao ar e mergulhado diretamente em banho-maria a 37 °C por mais 5 segundos. O canudo é limpo e cortado com uma tesoura na sua extremidade selada. O conteúdo do canudo é expelido em uma gota de 800 l DPBS-F10 em temperatura ambiente com uma haste de metal empurrando o tampão de algodão. Os embriões são enxaguados, colhidos e transferidos para a lavagem final em outra gota DPBS-F10 de 200 l. Após o enxágue, os embriões são transferidos para uma gota de 50 l de meio M16 sob óleo mineral, em atmosfera saturada de água a 37 °C sob 5% de CO2 até análise posterior.
Gravação de parâmetros
[00194] Para o teste físico do potencial de vitrificação, o estado de vitrificação/cristalização das soluções após resfriamento e aquecimento subsequente foi avaliado por exame visual: uma solução vitrificada permanece límpida e transparente enquanto a cristalização induz um aspecto branco/leitoso.
[00195] Para os ensaios de vitrificação de embriões, os parâmetros registrados foram a sobrevivência em cultura 24 e 48 horas após o aquecimento e a eclosão da zona pelúcida em 48 horas. A sobrevivência foi avaliada avaliando a morfologia da zona pelúcida e dos blastômeros.
Resultados Comparação das capacidades de vitrificação de soluções
[00196] Conforme mostrado na tabela 11, a CDCS não sofre nenhuma cristalização após o resfriamento em LN2 nem após o aquecimento em um banho de água a 37 °C. Nas mesmas condições padronizadas, a solução Ref1 e a solução Ref2 sofrem cristalização durante o resfriamento e o aquecimento. Em conclusão, tanto a solução Ref1 quanto a solução Ref2 não permitem a vitrificação consistente e permitem a rápida formação de cristais no resfriamento e aquecimento no sistema proposto com inércia térmica relativamente alta. Espera-se que esta cristalização rápida da solução Ref1 e da solução Ref2 seja deletéria para as células que ela pode conter. A CDSC, portanto, é demonstrado ser uma solução inibidora de cristal de gelo forte em condições que causam taxas de resfriamento e aquecimento mais lentas (~1.000 °C/min) do que geralmente recomendado (~20.000 °C/min).
Tabela 11: Testes de vitrificação física de solução Ref1 e solução Ref2 e CDCS Solução de ID do canudo Resfriamento Aquecimento criopreservação Solução Ref1 Ref1-1 C C Ref1-2 C C Ref1-3 C C Ref1-4 C C Solução Ref2 Ref2-1 C C Ref2-2 C C Ref2-3 C C Ref2-4 C C CDCS CDCS1 V V CDCS2 V V CDCS3 V V CDCS4 V V Esta tabela relata os resultados de um teste de vitrificação física padronizado. Três soluções de vitrificação (solução Ref1, solução Ref2 e CDCS) foram aspiradas e seladas em 250 l de canudo francês, resfriadas em LN2 e posteriormente aquecidas em banho-maria a 37 °C. Os estados vitrificados ou cristalizados foram avaliados no resfriamento e no aquecimento por exame visual. “V” significa vitrificação e “C” significa cristalização.
Ensaios de vitrificação de embriões
[00197] Parece óbvio a partir dos resultados relatados na tabela 12 que, usando um procedimento de vitrificação de uma etapa em um sistema com uma inércia térmica relativamente alta, a CDCS garante uma sobrevivência e taxa de eclosão muito melhores do que as soluções Ref1 e Ref2.
Tabela 12: Vitrificação e aquecimento em taxa rápida de embriões de camundongo com solução Ref1, solução Ref2 e
Análise 24H pós-aquecimento Análise 48H pós-aquecimento No. de No. de % de No. de % de No. de % de Tratamento Embriões Sobrev.
Sobrev.
Sobrev.
Sobrev. eclodido eclodido CDCS 143 75a 52% 71d 50% 12g 8% Solução 137 2b 1% 0e 0% 0h 0% Ref1 Solução 140 2c 1% 0f 0% 0i 0% Ref2 Esta tabela mostra os resultados da vitrificação e do aquecimento de embriões em estágio de blastocisto de camundongo
FVB/NxCD1 (D5), realizados junto com controles não criopreservados.
A CDCS foi comparada com a solução Ref1 e a solução Ref2 em protocolos de vitrificação em uma única etapa,
seguido de aquecimento por expulsão direta do embrião no meio de cultura.
Os números de embriões submetidos aos testes são indicados (No. de Embriões) juntamente com os que sobreviveram ao tratamento 24 horas e 48 horas pós-aquecimento (No. de
Sobrev.), evoluindo para o estágio de blastocisto eclodido 48H pós-aquecimento (No. de eclodido). Valores com sobrescritos diferentes foram comparados entre si e os valores P correspondentes foram calculados usando testes de qui-quadrado:
a-b: 1,3 x 10-21; a-c: 5,3 x 10-22; d-e: 1,3 x 10-21; d-f: 5,8 x
10-22; g-h: 5,3 x 10-4; g-i: 4,6 x 10-4.
Claims (15)
1. Composição líquida para criopreservação de um material biológico, caracterizada pelo fato de compreender - um solvente polar aprótico selecionado a partir de dimetilsulfóxido (DMSO) e dimetilformamida (DMF), - um álcool monohídrico ou polihídrico selecionado a partir de etilenoglicol, propilenoglicol, glicerol, eritritol, sorbitol, manitol, xilitol, volemitol, metanol, etanol, isopropanol, butanol e pentanol; - um polissacarídeo não ramificado selecionado a partir do grupo que consiste em sacarose, trealose, lactulose, melibiose, lactobionato, rafinose e celulose, de um modo preferido sacarose; - dextrano; e - álcool polivinílico.
2. Composição líquida para criopreservação de um material biológico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender DMSO, etilenoglicol, sacarose, dextrano e álcool polivinílico.
3. Composição líquida, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende quantidades substancialmente iguais de DMSO e etilenoglicol e uma concentração de sacarose que é pelo menos 8 vezes a de dextrano.
4. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender - pelo menos 0,8% (v/v) de um solvente polar aprótico; - pelo menos 0,8% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico; - pelo menos 0,5% (p/v) de polissacarídeo não ramificado; - pelo menos 0,037% (p/v) de dextrano; - pelo menos 0,015% (p/v) de álcool polivinílico; e - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4.
5. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de compreender: - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v) de um solvente polar aprótico; - 13,0 a 23,0% (v/v), de um modo preferido 17,7% (v/v), de um álcool monohídrico ou polihídrico; - 9,0 a 31,0% (p/v), de um modo preferido 22,7% (p/v), de um polissacarídeo não ramificado; - 0,60 a 22,0% (p/v), de um modo preferido 2,64% (p/v), de dextrano; - 0,30 a 4,0% (p/v), de um modo preferido 0,88% (p/v), álcool polivinílico; e/ou - até 100% (v/v) de um diluente, de um modo preferido com pH 7,2 a 7,4; ou uma diluição da referida composição líquida no referido diluente.
6. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos 15% (v/v) de um solvente polar aprótico, pelo menos 15% (v/v) de um álcool monohídrico ou polihídrico, pelo menos 15% (p/v) de um polissacarídeo não ramificado, pelo menos 2% (p/v) de dextrano e cerca de 0,9% (p/v) de álcool polivinílico.
7. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido diluente é uma solução salina balanceada, de um modo preferido solução salina tamponada com fosfato (PBS).
8. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de que dextrano compreende um ou mais de Dextrano 1, Dextrano 40 e/ou Dextrano 70.
9. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de compreender - 17,7% (v/v) de DMSO; - 17,7% (v/v) de etilenoglicol; - 22,7% (p/v) de sacarose; - 0,88% (p/v) de Dextrano 1;
- 0,88% (p/v) de Dextrano 40; - 0,88% (p/v) de Dextrano 70; e - 0,88% (p/v) de álcool polivinílico.
10. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição líquida não compreende proteínas, polipeptídeos ou peptídeos.
11. Uso da composição líquida conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de ser para criopreservação de um material biológico, em que o congelamento é de um modo preferido realizado por um procedimento de congelamento, um procedimento de vitrificação de múltiplas etapas ou um procedimento de vitrificação de uma etapa.
12. Método para preservar um material biológico, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de - fornecer um material biológico; - contatar o material biológico com a composição líquida conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; - resfriar e/ou aquecer o material biológico na composição líquida conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender contatar o material biológico com pelo menos uma diluição de uma composição conforme qualquer uma das reivindicações 5, 6 ou 9, ou uma reivindicação dependente desta, antes de contatar o material biológico com a referida composição.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o referido resfriamento compreende o congelamento do material biológico ou a vitrificação do material biológico, de um modo preferido uma vitrificação em uma ou várias etapas do material biológico.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 11, ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o material biológico é selecionado a partir do grupo de células-tronco, gametas e embriões.
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