CN108739796A - 一种玻璃化冷冻液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玻璃化冷冻液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。包括平衡液和冷冻液；所述平衡液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；所述冷冻液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖和蔗糖溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。本发明不仅可以有效地保存卵子、胚胎及组织细胞的活力，而且还可以保存DNA的完整性，增加卵子、胚胎存活率和相应的成功率，从而提高辅助生殖技术的成功率，同时，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
Description
技术领域
本发明涉及一种玻璃化冷冻液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。
背景技术
人类辅助生殖技术中，玻璃化冷冻液主要应用于卵子、胚胎以及睾丸、卵巢组织的冷冻等流程。目前，临床使用的常规的玻璃化冷冻液为仅以HEPES或者MOPS或者碳酸氢钠为缓冲的基础盐溶液，不能完整有效地保持精子、卵子、胚胎的活力和DNA的完整性，尤其对卵子的冷冻保存，存活率很低。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种各项质控达标的玻璃化冷冻液，不仅可以有效地保持精子、卵子和胚胎的活力，提高辅助生殖技术的成功率，而且也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种玻璃化冷冻液，其特征在于：包括平衡液和冷冻液；所述平衡液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；所述冷冻液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖和蔗糖溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。
优选的：所述平衡液中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为7-8％，二甲基亚砜的终浓度为7.5％。
优选的：所述冷冻液中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为15-16％，二甲基亚砜的终浓度为15-16％，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.4-0.6mol/L。
优选的：所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-15μg/mL。
优选的：所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
优选的：所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mmol/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS 18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为6-15mg/mL。
本发明所述玻璃化冷冻液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
2、检测步骤1所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
3、按照预配制的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为6-15mg/mL补充到盐溶液中，得到含蛋白的基础盐缓冲溶液；
4、制备平衡液：将乙二醇或者丙二醇按照终浓度为7-8％、二甲基亚砜按照终浓度为7.5％溶解在步骤3制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到平衡液；
5、制备冷冻液：将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜按照终浓度为15-16％，聚蔗糖、海藻糖、蔗糖按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.4-0.6mol/L分别溶解在步骤3制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到冷冻液；
6、将步骤4、5所得平衡液、冷冻液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
平衡液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶1水稀释液的渗透压为1150-1755mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
冷冻液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶3水稀释液的渗透压为1100-1712mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
7、将步骤4、5所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
有益效果：与现有技术相比，本发明所述的冷冻液内添加有乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖、蔗糖，不仅可以有效地保存卵子、胚胎及组织细胞的活力，而且还可以保存DNA的完整性，增加卵子、胚胎存活率和相应的成功率，从而提高辅助生殖技术的成功率，同时，也为辅助生殖技术的安全性提供了有力保证。
具体实施方式
下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明。
本发明所述的玻璃化冷冻液，包括平衡液和冷冻液。
所述平衡液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成，其中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为7-8％，二甲基亚砜的终浓度为7.5％。
所述冷冻液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖和蔗糖解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；其中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为15-16％，二甲基亚砜的终浓度为15-16％，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.4-0.6mol/L。
所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-15μg/mL；所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mmol/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS 18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为6-15mg/mL。
本发明所述玻璃化冷冻液的制备方法，包括以下步骤：
1、配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
2、检测步骤1所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
3、按照预配制的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为6-15mg/mL补充到盐溶液中，得到含蛋白的基础盐缓冲溶液；
4、制备平衡液：将乙二醇或者丙二醇按照终浓度为7-8％、二甲基亚砜按照终浓度为7.5％溶解在步骤3制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到平衡液；
5、制备冷冻液：将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜按照终浓度为15-16％，聚蔗糖、海藻糖、蔗糖按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.4-0.6mol/L分别溶解在步骤3制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到冷冻液；
6、将步骤4、5所得溶液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
平衡液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶1水稀释液的渗透压为1150-1755mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
冷冻液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶3水稀释液的渗透压为1100-1712mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
7、将步骤4、5所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
【存储说明和稳定性】
存储：将分装好的平衡液、冷冻液分别于2℃-4℃的环境中冷藏；避免液体暴露于CO2环境和空气中，防止pH降低到7.0或更低的水平；不要暴露在高于39℃的温度下。
稳定性：产品稳定性可以直到标签上显示的到期日期；使用无菌程序除去所需体积的产品，一旦移除，不要将任何量的产品返回原始容器；如果产品变色、浑浊或有微生物污染迹象，请勿使用；为避免污染问题，使用无菌技术进行处理，并在完成操作后丢弃瓶子或小瓶中剩余的任何多余产品。
【具体使用方法】
1、将平衡液、冷冻液从2℃-4℃冰箱中取出，平衡至室温(23-27℃)；
2、准备好液氮容器并确保内部的液氮有足够的深度来浸没冷冻支架，放置于显微镜附近；
3、将患者必要的信息标记在每个无菌培养皿(falcon 3002)和载杆(或-EZ)上；
4、在无菌操作下，取两滴平衡液(每滴100-150μL)分别置于培养皿的上半部分，分别记为ES1和ES2液滴；
5、将卵母细胞或者胚胎转置于ES1滴中6分钟，移动卵母细胞或者胚胎一次，然后将细胞在ES2中再平衡6分钟，不可扰动(注意：卵母细胞或胚胎会收缩，然后逐渐恢复到原始大小，表明平衡完成)；
6、在上述平衡期间，无菌条件下取两滴冷冻液(50-100μL)分别置于同一培养皿的下半部分，记为VS1和VS2液滴；
7、将卵母细胞和胚胎以最小体积的液滴从ES2转移至VS1中静置30秒，然后再置于VS2中30秒；
8、将载杆放在显微镜下(iVitri标志朝上)，然后，调整焦点于顶部的黑色标记处；再把卵母细胞或胚胎(1～3个)置于黑色标记附近，同时去除过量的冷冻液，使所含冷冻液体积保持最小(≤1.0μL)；黑色标记使加外套盖更容易；
9、握住载杆手柄端，将载杆迅速地插入到新鲜的液氮中；
10、用长镊子(非手术钳)夹住外套，将其插入液氮中直到停止起气泡后，盖入载杆并轻轻拧紧，注意不要将载杆从液氮中取出；
11、将载杆放在冷冻支架中，使其外套端朝下并储存在液氮中；
12、补充说明：若冷冻卵母细胞时，需提前将卵子置于基础盐缓冲溶液(含12mg/mL白蛋白)：平衡液(1∶1)混合液滴中平衡4分钟。
Claims (7)
1.一种玻璃化冷冻液，其特征在于：包括平衡液和冷冻液；所述平衡液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成；所述冷冻液是将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜、聚蔗糖、海藻糖和蔗糖溶解于含有抗菌素和指示剂的基础盐缓冲溶液中配制而成。
2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述平衡液中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为7-8％，二甲基亚砜的终浓度为7.5％。
3.根据权利要求2所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述冷冻液中，乙二醇或者丙二醇的终浓度为15-16％，二甲基亚砜的终浓度为15-16％，聚蔗糖的终浓度为5-15mg/mL，海藻糖的终浓度为0.20-0.70mol/L，蔗糖的终浓度为0.4-0.6mol/L。
4.根据权利要求3所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述抗菌素为庆大霉素，终浓度为5-15μg/mL。
5.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述指示剂为酚红，终浓度4.5-10.0μg/mL。
6.根据权利要求5所述的玻璃化冷冻液，其特征在于：所述基础盐缓冲溶液是以HEPES或MOPS为缓冲剂，以钠、钾、镁、钙离子为基础，并以葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、白蛋白为能量物质的化合物溶液；其中包含：氯化钠97.00-102.00mmol/L、氯化钾4.50-4.70mmol/L、硫酸镁0.10-0.25mmol/L、氯化钙1.90-2.20mmol/L、碳酸氢钠3.80-4.20mmol/L、HEPES或MOPS18.00-22.00mmol/L、葡萄糖2.60-2.88mmol/L、丙酮酸钠0.28-0.35mmol/L、乳酸钠21.00-22.66mmol/L、磷酸二氢钾0.35-0.39mmol/L；所述白蛋白为重组人血清白蛋白，是采用医疗级的重组人血清白蛋白干粉溶解于盐水溶液中制备而成，终浓度为6-15mg/mL。
7.如权利要求6所述玻璃化冷冻液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制基础盐缓冲溶液：先按照基础盐缓冲溶液的各组分及用量称量好各种组分，备用；然后，将除了抗菌素、指示剂、碳酸氢钠以外的各组分溶于超纯注射级用水中，溶解过程中遵循先固体后液体的原则；所述超纯注射级用水经0.1-0.2μM滤膜过滤，内毒素＜0.015EU/mL；再依次加入称量好的抗菌素、指示剂、碳酸氢钠，制得基础盐缓冲溶液；
(2)检测步骤(1)所得基础盐缓冲溶液的渗透压和pH值，并记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持为265-285mOsm/Kg，所述pH值保持为7.30-7.50；
(3)按照预配制的容量，将重组人血清白蛋白按终浓度为6-15mg/mL补充到盐溶液中，得到含蛋白的基础盐缓冲溶液；
(4)制备平衡液：将乙二醇或者丙二醇按照终浓度为7-8％、二甲基亚砜按照终浓度为7.5％溶解在步骤(3)制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到平衡液；
(5)制备冷冻液：将乙二醇或者丙二醇、二甲基亚砜按照终浓度为15-16％，聚蔗糖、海藻糖、蔗糖按照终浓度为5-15mg/mL、0.20-0.70mol/L、0.4-0.6mol/L分别溶解在步骤(3)制得的含蛋白的基础盐缓冲溶液中，得到冷冻液；
(6)将步骤(4)、(5)所得平衡液、冷冻液分别经过0.2μm滤膜过滤灭菌后，取样测试；测试参数如下：
平衡液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶1水稀释液的渗透压为1150-1755mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
冷冻液：15-25℃条件下pH值为7.10-7.90；1∶3水稀释液的渗透压为1100-1712mOsm/Kg；内毒素为＜1.0EU/mL；一细胞鼠胚培养到96小时：≥80％的囊胚形成率；
(7)将步骤(4)、(5)所得溶液分别在百级GMP车间进行无菌分装和标签。
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