CN110839615A - 一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于卵母细胞冷冻技术领域，具体涉及一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法。该卵母细胞冷冻保存液包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，本发明聚焦卵母细胞的细胞结构，针对常规冷冻体系进行优化，改良了冷冻组分配比，添加了特异性冷冻保护剂，创新性的设计出卵母细胞特异性冷冻试剂，经鼠胚及废弃人卵母细胞冷冻实验验证，效果较现有胚胎冷冻试剂有较大提升。
Description
技术领域
本发明属于卵母细胞冷冻技术领域，具体涉及一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法。
背景技术
卵母细胞冷冻保存可为由年龄及医疗因素引起的卵巢功能衰退的妇女保存生育能力，有利于改善卵母细胞捐赠程序及缓解胚胎冻存引发的一系列问题。目前进行卵母细胞冷冻主要采用玻璃化冷冻技术，这种方式能够显著降低卵母细胞冷冻时冰晶形成所带来的细胞损伤，尽管如此，冷冻保存后卵母细胞的发育潜能仍明显低于新鲜卵母细胞。有研究表明，冷冻过程中温度和渗透压的剧烈改变以及冷冻保护剂的毒性等将导致细胞骨架的损伤，微管破坏和纺锤体损伤，使染色体异常率增高，胚胎非整倍体发生率上升，胚胎的发育潜力下降。因此，进一步优化冷冻体系，减轻冷冻对卵母细胞的损伤，使冷冻复苏后的卵母细胞仍保持较高的发育潜能，是当前生殖医学研究热点问题，也是亟待解决的问题。
目前为止，市面上并没有专门的卵母细胞冷冻解冻试剂，进行卵母细胞冷冻主要采用商品化的胚胎玻璃化冷冻试剂，如进口试剂(日本KITAZATO，瑞典Vitrolife，美国SAGE等)，国产试剂(瑞柏，捷鹰等)。现有商品化的玻璃化冷冻液主要采用由平衡液(equilibrium solution,ES)、玻璃化液(vitrificationolution,VS)和基础液(basalsolution,BS)组成，主要以渗透性保护剂和非渗透性保护剂合理配比为主。
由于卵母细胞与胚胎结构不一致，对于冷冻的耐受程度不一样，与胚胎相比，卵母细胞表面积与体积的比例较小，在冷冻的过程中容易脱水不充分，形成细胞内结晶，冷冻过程引起渗透性休克；此外，由于冷冻保护剂的种类较多，各自的细胞毒性和保护潜能也不相同。现有的胚胎冷冻体系应用于卵母细胞冷冻仍然存在一定的弊端，不具有卵母细胞冷冻的特异性，采用胚胎冷冻试剂行卵母细胞冷冻后，其复苏存活率、后续受精及胚胎发育均不理想。
发明内容
针对现有技术缺乏针对卵母细胞特性的冷冻体系的问题，本发明提供一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法，以解决上述技术问题。本发明聚焦卵母细胞的细胞结构，针对常规冷冻体系进行优化，改良了冷冻组分配比，添加了特异性冷冻保护剂，创新性的设计出卵母细胞特异性冷冻试剂，经鼠胚及废弃人卵母细胞冷冻实验验证，效果较现有胚胎冷冻试剂有较大提升。
本发明的技术方案为：
一种卵母细胞冷冻保存液，包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，
所述平衡液一包括基础液、2-3％乙二醇、1-1.5％二甲基亚砜、1.5-2.0％丙二醇，上述百分数均为体积百分比；
所述平衡液二包括基础液、7-8％乙二醇、3.5-4.0％二甲基亚砜、3.5-4.0％丙二醇、5-30μM(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比；
所述玻璃化液包括基础液、14-16％乙二醇、7-8％二甲基亚砜、7-8％丙二醇、0.4-0.6M(mol/L)蔗糖、5-25μΜ(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比。
作为优选，所述卵母细胞冷冻保存液，包括以下重量份的组分：平衡液一1份、平衡液二1份和玻璃化液1份，由于对于卵母细胞的处理为一个连续的过程，为了便于使用，三个组分各自独立包装，并放置在一个包装盒内。
作为优选，所述的卵母细胞冷冻保存液还包括基础液1份。
作为优选，所述基础液为含有质量分数21-22％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂；进一步优选，所述基础液为含有质量分数20％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂。
作为优选，所述基础试剂为Earle's平衡盐溶液。
作为优选，所述平衡液一包括基础液、2.5％乙二醇、1.25％二甲基亚砜、1.75％丙二醇。
作为优选，所述平衡液二包括基础液、7.5％乙二醇、3.75％二甲基亚砜、3.75％丙二醇、10μM(μmol/L)染料木黄酮。
作为优选，所述玻璃化液包括基础液、15％乙二醇、7.5％二甲基亚砜、7.5％丙二醇、0.5M(mol/L)蔗糖、10μΜ(μmol/L)染料木黄酮。
本发明还提供了一种卵母细胞冷冻保存方法，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
本发明还提供了一种卵母细胞冷冻保存方法，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在基础液中预平衡1-2分钟，然后在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
本发明的有益效果在于，
本发明聚焦卵母细胞的细胞结构，针对常规冷冻体系进行优化，改良了冷冻组分配比，添加了特异性冷冻保护剂(染料木黄酮)，创新性的设计出卵母细胞特异性冷冻试剂，减少了不必要的冷冻损伤和冷冻毒性，经鼠胚及废弃人卵母细胞冷冻实验验证，其复苏存活率、后续受精及胚胎发育效果均较现有胚胎冷冻试剂有较大提升。
本发明所述卵母细胞冷冻保存液，可有效提高卵母细胞冷冻的存活率和发育潜能。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
SPS(血清蛋白替代品)的购买厂家，美国SAGE。
实施例1
一种卵母细胞冷冻保存液，包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，所述平衡液一包括基础液、2.5％乙二醇、1.25％二甲基亚砜、1.75％丙二醇。
所述平衡液二包括基础液、7.5％乙二醇、3.75％二甲基亚砜、3.75％丙二醇、10μM(μmol/L)染料木黄酮。
所述玻璃化液包括基础液、15％乙二醇、7.5％二甲基亚砜、7.5％丙二醇、0.5M(mol/L)蔗糖、10μΜ(μmol/L)染料木黄酮。
所述基础液为含有质量分数20％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂。
所述基础试剂为Earle's平衡盐溶液。
一种卵母细胞冷冻保存方法，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
实施例2
一种卵母细胞冷冻保存液，包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，基础液1份；
所述平衡液一包括基础液、2.5％乙二醇、1.25％二甲基亚砜、1.75％丙二醇。
所述平衡液二包括基础液、7.5％乙二醇、3.75％二甲基亚砜、3.75％丙二醇、10μM(μmol/L)染料木黄酮。
所述玻璃化液包括基础液、15％乙二醇、7.5％二甲基亚砜、7.5％丙二醇、0.5M(mol/L)蔗糖、10μΜ(μmol/L)染料木黄酮。
所述基础液为含有质量分数20％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂。
所述基础试剂为Earle's平衡盐溶液。
一种卵母细胞冷冻保存方法，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在基础液中预平衡1-2分钟，然后在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
实验例1
采用鼠胚及废弃人卵母细胞进行冷冻实验，具体实验方法如下。
1.冷冻：
把本卵母细胞冷冻保存液从冰箱中取出恢复至室温，室温下平衡20分钟以上，在培养皿中做成0.5ml的小滴，把需要冷冻的2-4枚卵母细胞转移至基础液中放置1min，转移至平衡液一放置1-2分钟，随后转移至平衡液二中，仔细观察卵母细胞的皱缩、复张，一般经过皱缩,又复张至原体积的80％左右，待细胞膜恢复平滑即可(大约6-8分钟)，然后将卵母细胞移至玻璃化液中放置30秒-1分钟，转移至标记好的Cryotop载杆上，快速投入液氮中，液氮中套Cryotop外管，转移至液氮罐中保存。
常规冷冻组采用市售(日本加藤)卵裂胚冷冻液，采用推荐的与上述冷冻方式进行卵母细胞冷冻保存。
2.解冻
解冻前准备37℃操作台和室温操作台。1ml 1.0M庶糖溶液放入37℃无CO2培养箱中预温。分别取0.8-1.0ml的0.5M庶糖溶液、0.25M蔗糖糖溶液和基础液复温至室温，于解冻前在培养皿中做成合适大小的液滴。
解冻时，从液氮中去除Cryotop外管，迅速并使带有卵母细胞的Cryotop顶端载片部分浸入1.0M蔗糖溶液中，看到卵母细胞进入液体后即可丢弃Cryotop(可适当吹吸促进卵母细胞自载片脱落)，胚胎在1.0M庶糖溶液中保持1min，转移至0.5M蔗糖溶液3分钟，0.25M蔗糖溶液5分钟，随后转入BS中后缓慢升温5-10分钟。
3.胚胎发育评价
胚胎解冻后，计算卵子存活率，后行卵胞浆内单精子注射，评价受精率，卵裂率及囊胚形成率。
具体分组包括以下三组：
(1)新鲜组。
(2)市售(日本加藤)胚胎冷冻液组。
(3)本发明冷冻液。
表1.鼠卵母细胞冷冻实验结果
经废弃人卵冷冻母细胞冷冻实验也获得了较为改善的结果；与市售胚胎冷冻试剂相比，复苏存活率为91％，受精率为65％，卵裂率为93％，优胚率达16％，显著高于市售常规冷冻组。
尽管通过参考并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种卵母细胞冷冻保存液，包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，
所述平衡液一包括基础液、2-3％乙二醇、1-1.5％二甲基亚砜、1.5-2.0％丙二醇，上述百分数均为体积百分比；
所述平衡液二包括基础液、7-8％乙二醇、3.5-4.0％二甲基亚砜、3.5-4.0％丙二醇、5-30μM(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比；
所述玻璃化液包括基础液、14-16％乙二醇、7-8％二甲基亚砜、7-8％丙二醇、0.4-0.6M(mol/L)蔗糖、5-25μΜ(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述卵母细胞冷冻保存液，包括以下重量份的组分：平衡液一1份、平衡液二1份和玻璃化液1份。
3.根据权利要求2所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述的卵母细胞冷冻保存液还包括基础液1份。
4.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述基础液为含有质量分数21-22％SPS的基础试剂；进一步优选，所述基础液为含有质量分数20％SPS的基础试剂。
5.根据权利要求4所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述基础试剂为Earle's平衡盐溶液。
6.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述平衡液一包括基础液、2.5％乙二醇、1.25％二甲基亚砜、1.75％丙二醇。
7.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述平衡液二包括基础液、7.5％乙二醇、3.75％二甲基亚砜、3.75％丙二醇、10μM(μmol/L)染料木黄酮。
8.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存液，其特征在于，所述玻璃化液包括基础液、15％乙二醇、7.5％二甲基亚砜、7.5％丙二醇、0.5M(mol/L)蔗糖、10μΜ(μmol/L)染料木黄酮。
9.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存方法，其特征在于，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
10.根据权利要求1所述的卵母细胞冷冻保存方法，其特征在于，采用浓度递进法进行冷冻，包括以下步骤：卵母细胞先放置在基础液中预平衡1-2分钟，然后在平衡液一中放置1-2分钟，再在平衡液二中放置6-8分钟，最后在玻璃化液中放置30-60秒，之后放入液氮中保存。
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