CN104663649A - 人类卵母细胞冷冻保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液。本发明联合应用了丙二醇和乙二醇两种渗透性冷冻保护剂，并应用海藻糖（Trehalose,α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside，C12H22O11）作为非渗透性保护剂为基础开发了本发明。本发明开发了一种适合于人类卵母细胞冷冻的非渗透性冷冻保护剂，不仅能抑制细胞内冰晶的形成，而且能使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵母细胞的发育潜能，临床结果证明冻融后卵母细胞的受精率、卵裂率、优质囊胚率大大改善。
Description
技术领域
本发明涉及人类卵母细胞冷冻保护剂，属于生殖医学工程领域。
背景技术
2006年1月，我国首例、全球第二例“三冻（冻卵、冻精、冻胚胎，再解冻移植入母体子宫内）”试管婴儿在北京大学第三医院诞生。目前，中国ART（辅助生殖技术）衍生技术的应用范围和技术水准已处于世界前列。随着全球性不孕人口上升，女性育龄的推迟、癌症患者的增加，女性生育能力保存的需求也日益增加。卵子冷冻技术也已逐步应用于临床，与冷冻胚胎相比较，冷冻卵子一方面可使许多宗教、法律及伦理问题得以解决，另一方面对于因生殖系统疾病导致卵巢功能损伤甚至散失的妇女，如早发性卵巢衰竭、子宫内膜异位症及接受化学治疗或放射线治疗恶性肿瘤的患者，卵子冷冻是保存此类妇女生育能力的有效途径。
尽管人类卵子冷冻技术近年来取得了较大的突破，成活率大大提高，但卵子冷冻至今仍未能像胚胎及精子冷冻在辅助生殖技术领域常规开展。根本原因是由于成熟卵母细胞（卵子）体积大、所含水分多、膜的渗透性低，冷冻过程中易形成冰晶，对卵子产生损伤，并且对染色体的重新排列产生影响，导致纺锤体异常，所以冻融后的卵子受精率不高，卵裂率低，胚胎发育潜能低下，造成卵子冷冻技术进展较为缓慢 。因此开发一种高效安全的人类卵子冷冻保护剂是解决人类卵子冷冻效果低下的唯一路径。
现有的卵子冷冻保护剂均选用蔗糖为非渗透性保护剂，和选用丙二醇（propanediol， PROH）、乙二醇（ethylene glycol，EG）或二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等为渗透性抵抗剂。冷冻保护剂的广泛使用旨在防止卵子在冻融过程中细胞内因脱水不完全引发冰晶的形成，冰晶的形成会对卵子的亚细胞结构造成损伤。目前，国际上现有的卵子冷冻保护剂一般分两部分组成，即卵子冷冻液和卵子解冻液，冷冻液又分为平衡液和冷冻液两组，而解冻液根据所含非渗透性保护剂浓度的不同分别分为复苏液，稀释液1，稀释液2及清洗液等4组。现有的卵子冷冻保护剂的配方如下：
卵子冷冻液：
平衡液：75%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+ 7.5%PROH（V/V）+7.5%EG（V/V）;
冷冻液：60%缓冲液（V/V）+10%SPS（V/V）+15%PROH（V/V）+15%EG（V/V）+0.5mol/LSucrose(蔗糖)
卵子解冻液：
复苏液： 90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+1.0 mol/L Sucrose(蔗糖);
稀释液-1：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.5 mol/L Sucrose(蔗糖);
稀释液-2：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.25 mol/L Sucrose(蔗糖);
清洗液：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）。
缓冲液涵盖HTF 1024（SAGE, USA），HTF1023（SAGE, USA）, GMOPS（Vitrolife, Sweden）,及DPBS（SAGE, USA）,等；SPS（SAGE, USA）是人体血清替代物；蔗糖(Sucrose，SIGMA，USA)，另V/V代表体积比。
现有技术通常在渗透性冷冻保护剂中添加非渗透性保护剂及大分子的物质或联合应用几种冷冻剂，可在冷冻过程中保护卵母细胞膜，从而减少冷冻保护剂的毒性，提高卵母细胞的成活率。目前，蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂常规应用于卵子冷冻培养基中，但卵母细胞在冷冻过程中易形成冰晶，对卵子产生损伤，并且对染色体的重新排列产生影响，导致纺锤体异常，所以冻融后的卵子受精率不高，卵裂率低，胚胎发育潜能低下。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种人类卵母细胞冷冻保护剂，该保护剂以海藻糖作为非渗透性保护剂以卵子冷冻培养基冻融人类卵子。
本发明的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液（EM）：60%缓冲液（V/V）+ 20%人血清替代物（V/V）+ 10%PROH（V/V）
+10%EG（V/V），
冷冻液（VM）：40%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+20%PROH（V/V）
+20%EG（V/V）+0.65mol/L 海藻糖；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液（TM）：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+1.0 mol/L海藻糖，
稀释液-1（DM-1）：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+0.5 mol/L海藻
糖，
稀释液-2（DM-2）：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+0.2 mol/L海藻
糖，
清洗液（WM）：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）。
所述缓冲液选自HTF 1024（SAGE, USA）、HTF1023（SAGE, USA）、GMOPS（Vitrolife, Sweden）或DPBS（SAGE, USA）。
所述人血清替代物选自SPS（SAGE, USA）、SSS（IrovineScientific，USA）或HAS（Vitrolife, Sweden），更优选SSS（IrovineScientific，USA）。
缓冲液涵盖HTF 1024（SAGE, USA）、HTF1023（SAGE, USA）、GMOPS（Vitrolife, Sweden）及DPBS（SAGE, USA）等；人血清替代物涵盖SPS（SAGE, USA）、SSS（Irovine Scientific，USA）及HSA（Vitrolife, Sweden）；PROH（1，2-Propanediol，MERCK，USA）；EG（Ethylene glycol，MERCK，USA）；海藻糖（Trehalose，α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside，C12H22O11 ≥99.0，FLUKA，USA）。另V/V代表体积比。
以冷冻液（VM）为例（其他溶液的配制同此），其配制方法为，按缓冲液、人血清替代物、PROH、EG的体积比4：2：2：2配成混合液，以该配比的混合液来配制含海藻糖0.65mol/L的溶液即可。
本发明联合应用了丙二醇（propanediol， PROH）和乙二醇（ethylene glycol，EG）两种渗透性冷冻保护剂，并应用海藻糖（Trehalose,α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside，C12H22O11）作为非渗透性保护剂为基础开发了本发明。
本发明开发了一种适合于卵母细胞冷冻的非渗透性冷冻保护剂，不仅能抑制细胞内冰晶的形成，而且能使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵母细胞的发育潜能，临床结果证明冻融后卵母细胞的受精率、卵裂率、囊胚率大大改善。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
本发明的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液（EM）：60% HTF 1024（V/V）+ 20% SSS（V/V）+ 10%PROH（V/V）+10%EG（V/V），
冷冻液（VM）：40% HTF 1024（V/V）+20% SSS（V/V）+20%PROH（V/V）+20%EG（V/V）+0.65mol/L 海藻糖；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液（TM）：80% HTF 1024（V/V）+20% SSS（V/V）+1.0 mol/L海藻糖，
稀释液-1（DM-1）：80% HTF 1024（V/V）+20% SSS（V/V）+0.5 mol/L海藻糖，
稀释液-2（DM-2）：80% HTF 1024（V/V）+20% SSS（V/V）+0.2 mol/L海藻糖，
清洗液（WM）：80% HTF 1024（V/V）+20% SSS（V/V）。
卵母细胞冻融技术的实施如下：
冷冻过程:
将卵母细胞移至平衡液（EM），放置15 min 后, 转移至冷冻液（VM）液中1 min，随后将卵母细胞转移至特定的载体上并迅速投入液氮, 最后再将含有卵母细胞的载体移入液氮罐中-196°C保存。
解冻过程:
将含卵母细胞的载体从液氮罐中取出，迅速将载体插入复苏液（TM）中，卵母细胞在TM液中自动脱落，快速将卵母细胞转移至稀释液-1（DM-1），室温下放置3 min后依次转至稀释液-2（DM-2）和清洗液，各3 min，最后，卵母细胞被移入配子培养液，在37°C、6% CO2 及饱和湿度条件下培养。
卵母细胞体外培养3小时后，挑出存活的卵母细胞行ICSI（单精子卵胞浆内注射）授精，18~22小时后观察卵母细胞受精状况，受精卵被挑出和依次入分裂期胚胎培养液和囊胚培养液行分裂期胚胎培养和囊胚培养。体外环境均为37°C、6% CO2 及饱和湿度条件下培养。观察和记录卵母细胞存活状况、受精状况、胚胎发育状况及囊胚发育状况。
本实例共收集卵母细胞300枚，卵子冻融后，存活285枚，存活率95.00%以上，受精268枚，受精率约94.04%，裂263枚，卵裂率约98.13%，获得囊胚132枚,囊胚率约50.19%左右，胚胎移植后临床妊娠率50%左右，接近冻融胚胎移植后的临床妊娠率。
实施例2
仅将人血清替代物SSS调整为HSA，其他同实施例1，本例共收集卵母细胞70枚，解冻70枚，存活64枚，卵子冻融后存活率91.43%，受精60枚，受精率93.75%，卵裂58枚，卵裂率96.67%，囊胚率39.67%左右，胚胎移植后临床妊娠率45%左右。
实施例3
仅将人血清替代物SSS调整为SPS，其他同实施例1，本例共收集卵母细胞70枚，解冻70枚，存活63枚，卵子冻融后存活率90.0%，受精58枚，受精率92.06%，卵裂56枚，卵裂率96.55%，囊胚率39.26%左右，胚胎移植后临床妊娠率45%左右。
对比例1
本例的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
卵子冷冻液：
平衡液：75%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+ 7.5%PROH（V/V）+7.5%EG（V/V）;
冷冻液：60%缓冲液（V/V）+10%SPS（V/V）+15%PROH（V/V）+15%EG（V/V）
+0.5mol/LSucrose(蔗糖)
卵子解冻液：
复苏液： 90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+1.0 mol/L Sucrose(蔗糖);
稀释液-1：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.5 mol/L Sucrose(蔗糖);
稀释液-2：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.25 mol/L Sucrose(蔗糖);
清洗液：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）。
本例共收集卵母细胞70枚，卵子冻融后，存活55枚，存活率78.6%，受精50枚，受精率约90.9%，卵裂40枚，卵裂率约80.0%，获得囊胚16枚，囊胚率约40.0%，胚胎移植后临床妊娠率40%左右。
对比例2
仅将冷冻液（VM）中的海藻糖浓度替换为0.5mol/L，其他同实施例1，本例共收集卵母细胞65枚，解冻65枚，存活59枚，卵子冻融后存活率90.77%，受精53枚，受精率89.83%，卵裂51枚，卵裂率96.23%左右，囊胚率39.22%左右，胚胎移植后临床妊娠率45%左右。
对比例3
仅将冷冻液（VM）中的海藻糖浓度替换为0.8mol/L，其他同实施例1，本例共收集卵母细胞65枚，解冻65枚，存活58枚，卵子冻融后存活率89.2%，受精52枚，受精率89.66%，卵裂50枚，卵裂率96.15%左右，囊胚率38.9%左右，胚胎移植后临床妊娠率45%左右。
对比例4
本例的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液（EM）：65%HTF 1024（V/V）+ 20%HSA（V/V）+ 7.5%PROH（V/V）+7.5%EG（V/V），
冷冻液（VM）：50%HTF 1024（V/V）+20% HSA（V/V）+15%PROH（V/V）+15%EG（V/V）+0.5mol/L 海藻糖；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液（TM）：80%HTF 1024（V/V）+20% HSA（V/V）+1.0 mol/L海藻糖，
稀释液-1（DM-1）：80% HTF 1024（V/V）+20% HSA（V/V）+0.5 mol/L海藻糖，
稀释液-2（DM-2）：80% HTF 1024（V/V）+20% HSA（V/V）+0.2 mol/L海藻糖，
清洗液（WM）：80% HTF 1024（V/V）+20% HSA（V/V）。
卵母细胞冻融技术的实施采用与实例1相同的方式：本例共收集卵母细胞75枚，解冻75枚，存活67枚，卵子冻融后存活率89.3%，受精63枚，受精率94.03%左右，卵裂60枚，卵裂率95.2%左右，囊胚率35.3%左右，胚胎移植后临床妊娠率45%左右。
Claims (3)
1.人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，其特征在于，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：
平衡液：60%缓冲液（V/V）+ 20%人血清替代物（V/V）+ 10%PROH（V/V）
+10%EG（V/V），
冷冻液：40%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+20%PROH（V/V）
+20%EG（V/V）+0.65mol/L 海藻糖；
所述卵子解冻液包括复苏液、稀释液-1、稀释液-2和清洗液，其组成为：
复苏液：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+1.0 mol/L海藻糖，
稀释液-1：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+0.5 mol/L海藻糖，
稀释液-2：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+0.2 mol/L海藻糖，
清洗液：80%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）。
2.如权利要求1所述人类卵母细胞冷冻保护剂，其特征在于，所述缓冲液选自HTF 1024（SAGE, USA）、HTF1023（SAGE, USA）、GMOPS（Vitrolife, Sweden）或DPBS（SAGE, USA）。
3.如权利要求1所述人类卵母细胞冷冻保护剂，其特征在于，所述人血清替代物选自SPS（SAGE, USA）、SSS（IrovineScientific，USA）或HSA（Vitrolife, Sweden）。
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