CN105052893B - 一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法，其特征是选择海区捕获性成熟的棘头梅童鱼雄鱼获取精巢，用剪刀将精巢破碎，沾取精液于海水中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，有活动能力精子数占总精子数的比例在50％以上的精液用于超低温冷冻保存；破碎后的精巢按体积比1:4‑1:5与冷冻保护液混匀，去除精巢碎块后将精子混合液分装于2ml冻存管中，每管装入1.5ml；将装有精子混合液的冻存管室在温下平衡2min，液氮面上方10‑15cm的液氮蒸汽中平衡15min后放入液氮‑196℃中冷冻保存；冷冻精子于37℃水浴中解冻复活，解冻后光学显微镜下检查精子活力。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类低温生物学技术领域，尤其是一种在超低温状态下保存鱼类配子的方法。
背景技术
棘头梅童鱼(Collichthy lucidus)隶属鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Percoidei)、石首鱼科(Sciaenidae)、梅童鱼属(Collichthys)，其温度、盐度适应范围较广，在我国南北沿海均有分布，是我国近海常见的小型经济鱼类。棘头梅童鱼肉质细嫩鲜美，是沿海居民喜食的海洋水产品之一。近年国内已对棘头梅童鱼的人工育苗进行了研究(浙江省海洋水产研究所，浙江海洋学院学报，单乐州等，2006；上海市水产研究所，水产科技情报，陈林等，2012)，但仅局限于实验阶段，未达到生产规模，受精卵的获得完全依赖于海区采集野生亲本进行人工授精，然而由于每次海区采捕野生棘头梅童鱼数量有限、雄鱼精液量较少及雌雄性腺发育不同步等原因，使得同时获得成熟精子和成熟卵子较为困难，大大限制了海区人工授精的进行，严重阻碍了人工育苗技术研究的进展。
鱼类精子超低温冷冻保存技术是长期保存鱼类种质资源的一种方法，该方法能有效保护鱼类遗传多样性，防止鱼类品种的灭绝，在鱼类的杂交育种、雌核发育及人工繁育等方面也有较广泛的应用。自1949年Polge用甘油作为抗冻剂成功保存精子以来，鱼类精子超低温冷冻保存技术研究取得了很大进展。在石首鱼科鱼类精子超低温冷冻保存上，肖志忠等对大黄鱼精子超低温冷冻保存进行了研究(中国科学院海洋研究所，水产渔业，肖志忠等，2007)，戴同仁对大黄鱼和鮸鱼精子超低温冷冻保存进行了研究(温州医学院，硕士学位论文，戴同仁，2012)，但未见棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存的方法，以解决野生棘头梅童鱼人工授精过程中，由于雄鱼精液量少、雌雄发育相对不同步，同时获得成熟精子和成熟卵子较为困难的问题。
本发明的技术方案包括棘头梅童鱼精子采集及活力检测、精子冷冻保护液的配制、精子与冷冻保护液的混合、降温及冷冻保存、精子解冻复活，其特征是：
1)棘头梅童鱼精子采集及活力检测通过以下方法实现：选择海区捕获性成熟的棘头梅童鱼雄鱼获取精巢，用剪刀将精巢破碎，沾取精液于海水中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，有活动能力精子数占总精子数的比例在50％以上的精液用于超低温冷冻保存；
2)精子冷冻保护液的配制通过以下方法实现：在每升蒸馏水中加入NaCl 4.0g、NaH2PO40.2g、NaHCO30.2g、KCl 0.4g、CaCl2·2H2O 0.1g、MgCl2·6H2O 0.2g、葡萄糖10g配制成稀释液，在稀释液中加入体积比为10％的DMSO配制成精子冷冻保护液；
3)精子与冷冻保护液的混合通过以下方法实现：破碎后的精巢按体积比1:4-1:5与冷冻保护液混匀，去除精巢碎块后将精子混合液分装于2ml冻存管中，每管装入1.5ml；
4)降温及冷冻保存通过以下方法实现：将装有精子混合液的冻存管室温下平衡2min，液氮面上方10-15cm的液氮蒸汽中平衡15min后放入液氮中-196℃冷冻保存；
5)精子解冻复活通过以下方法实现：冷冻精子于37℃水浴中解冻复活，解冻后光学显微镜下检查精子活力。
本发明的棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存的方法由五个关联的部分构成，发明人在多年对棘头梅童鱼繁育生物学的研究中发现，自然海区捕获到的同一批次棘头梅童鱼中，在能获得成熟卵子的情况下，几乎没有发现雄鱼能用常规挤压的方法使精液顺利排出的现象，因此，只能采取获取精巢后，利用精巢内发育成熟的少量精子用于人工授精。本发明特别适用于解决野生棘头梅童鱼人工授精过程中，由于雄鱼精液量少、雌雄发育相对不同步，而使同时获得成熟精子和成熟卵子较为困难的问题；棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存解冻后精子成活率与冷冻前鲜精精子成活率之比达到70-85％，为棘头梅童鱼的人工繁育和种质资源能够长期保存提供了可靠的技术保障。
具体实施方式
本发明根据低温生物学原理，将棘头梅童鱼精子与冷冻保护液按一定比例混合，通过快速冷冻方法使精子细胞进入超低温(-196℃)环境，细胞代谢活动基本停止，从而使精子得以长期保存。为了使本发明实施的技术手段易于明白了解，下面结合具体实例进一步阐述：
实施例1：
一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法包括以下步骤：精子采集及活力检测，精子冷冻保护液的配制，精子与冷冻保护液的混合，降温及冷冻保存，精子解冻复活。
1)棘头梅童鱼精子采集及活力检测通过以下方法实现：选择海区捕获性成熟的棘头梅童鱼雄鱼获取精巢，用剪刀将精巢破碎，沾取精液于海水中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，精子活力(有活动能力精子数占总精子数的比例)在50％以上的精液用于超低温冷冻保存；
2)精子冷冻保护液的配制通过以下方法实现：在每升蒸馏水中加入NaCl 4.0g、NaH2PO40.2g、NaHCO30.2g、KCl 0.4g、CaCl2·2H2O 0.1g、MgCl2·6H2O 0.2g、葡萄糖10g配制成稀释液，在稀释液中加入体积比为10％的DMSO配制成精子冷冻保护液；
3)、精子与冷冻保护液的混合通过以下方法实现：破碎后的精巢按体积比1:4-1:5与冷冻保护液混匀，去除精巢碎块后将精子混合液分装于2ml冻存管中，每管装入1.5ml；
4)、降温及冷冻保存通过以下方法实现：将装有精子混合液的冻存管在室温下平衡2min，液氮面上方10-15cm的液氮蒸汽中平衡15min后放入液氮(-196℃)中冷冻保存；
5)、精子解冻复活通过以下方法实现：冷冻精子于37℃水浴中解冻复活，解冻后光学显微镜下检查精子活力。
实施例2：
1)精子采集及活力检测通过以下方法实现：选用长江口海区捕获的性成熟雄性棘头梅童鱼，获取成熟精巢放于洁净的容器中，用剪刀将精巢剪碎，沾取精液以自然海水激活后立即在光学显微镜下观察精子活力，精子活力在50％以上的精液用于超低温冷冻保存；
2)精子冷冻保护液的筛选通过以下方法实现：在蒸馏水中加入不同比例NaCl、NaH2PO4、NaHCO3、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、葡萄糖配制成5种冷冻稀释液(表1)，在5种稀释液A、B、C、D、E中分别加入体积比为10％的DMSO配制成精子冷冻保护液。将剪碎的精巢与5种冷冻保护液按体积比1:4-1:5的比例混匀，去除精巢碎块，分装于2ml冻存管中，每管装入1.5ml，室温下平衡2min后将冻存管装于纱布袋内放入液氮罐中，在液氮面上方10-15cm处平衡15min，然后放入液氮(-196℃)中冷冻保存；
表1 5种稀释液配方
3)精子与冷冻保护液的混合方法与实施例1中的精子与冷冻保护液的混合方法相同；
4)降温及冷冻保存方法与实施例1中的降温及冷冻保存方法相同；
5)冻存效果检查：将冷冻保存12小时的冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴中快速解冻，解冻后沾取精液以海水激活后在光学显微镜下观察精子活力，并与冷冻前鲜精对比，计算精子复活率(解冻后精子成活率与冷冻前鲜精精子成活率之比)。
5种冷冻稀释液冻存后棘头梅童鱼精子的复活率见表2。
表2 利用5种冷冻稀释液冻存的棘头梅童鱼精子复活率(n＝3，p<0.05)
由表2可知，利用冷冻稀释液E冻存的棘头梅童鱼精子复活率(解冻后精子成活率与冷冻前鲜精精子成活率之比)最高，为76.67±10.41，显著高于另外4种稀释液冻存的棘头梅童鱼精子复活率。
实施例3：
1)精子采集及活力检测与实施例2中的精子采集及活力检测方法相同；
2)精子冷冻保护液的配制：利用实施例2筛选出的冷冻稀释液E为棘头梅童鱼精子大量冻存的稀释液，即在每升蒸馏水中加入NaCl 4.0g、NaH2PO40.2g、NaHCO30.2g、KCl0.4g、CaCl2·2H2O 0.1g、MgCl2·6H2O 0.2g、葡萄糖10g配制成稀释液；在稀释液中加入体积比为10％的DMSO配制成精子冷冻保护液；
3)精子与冷冻保护液的混合方法与实施例1中的精子与冷冻保护液的混合方法相同；
4)降温及冷冻保存：将装有精子混合液的冻存管室温下平衡2min，然后将冻存管装于纱布袋放入液氮罐，在液氮面上方10-15cm的液氮蒸汽中平衡15min，然后投入液氮(-196℃)中冷冻保存；
5)精子解冻复活：冷冻精子于37℃水浴中解冻复活，解冻后光学显微镜检查精子活力。以此方法冻存棘头梅童鱼精液45ml，解冻后检查精子复活率(解冻后精子成活率与冷冻前鲜精精子成活率之比)为70-85％。
Claims (1)
1.一种棘头梅童鱼精子超低温冷冻保存方法，包括棘头梅童鱼精子采集及活力检测、精子冷冻保护液的配制、精子与冷冻保护液的混合、降温及冷冻保存、精子解冻复活，其特征是棘头梅童鱼精子采集及活力检测通过以下方法实现：选择海区捕获性成熟的棘头梅童鱼雄鱼获取精巢，用剪刀将精巢破碎，沾取精液于海水中激活后，立即在光学显微镜下观察精子活力，有活动能力精子数占总精子数的比例在50％以上的精液用于超低温冷冻保存；精子冷冻保护液的配制通过以下方法实现：在每升蒸馏水中加入NaCl 4.0g、NaH2PO40.2g、NaHCO30.2g、KCl 0.4g、CaCl2·2H2O 0.1g、MgCl2·6H2O 0.2g、葡萄糖10g配制成稀释液，在稀释液中加入体积比为10％的DMSO配制成精子冷冻保护液；精子与冷冻保护液的混合通过以下方法实现：破碎后的精巢按体积比1:4-1:5与冷冻保护液混匀，去除精巢碎块后将精子混合液分装于2ml冻存管中，每管装入1.5ml；降温及冷冻保存通过以下方法实现：将装有精子混合液的冻存管室温下平衡2min，液氮面上方10-15cm的液氮蒸汽中平衡15min后放入液氮中-196℃冷冻保存；精子解冻复活通过以下方法实现：冷冻精子于37℃水浴中解冻复活，解冻后光学显微镜下检查精子活力。
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