CN103314948B - 一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法。将星斑川鲽的精液与抗冻液按体积比1:3的比例混合，在0-4℃孵育8-9分钟，孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存。冷冻后精液用自然海水激活，获得复活的冻精活力高于70%。本发明的星斑川鲽精子长期冷冻保存方法对于星斑川鲽人工繁育、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。

Description

一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法。
背景技术
星斑川鲽(Platichthys stellatus)隶属鲽形目(Pleuronectiformes)鲽科(Pleuronectidae)鲽亚科(Pleu-ronectinae)川鲽属(Platichthys)，俗称珍珠鲽、沼鲽等，英文名Starry flounder(繁星鲽)。星斑川鲽分布于北太平洋的亚洲和美洲沿岸(30°～70°N)海域，主要有北冰洋、东西伯利亚海、白令海峡、鄂霍次克海、朝鲜海峡、日本海、北极的阿拉斯加海湾、波弗特海、楚科奇海、加冕海湾、拉普捷夫海、加利福尼亚海域。主要分布国有加拿大、美国、俄罗斯联邦、中国、朝鲜、韩国和日本等。星斑川鲽目前已经成为重要的养殖鱼种，是具有极高商业开发价值的比目鱼类。日本、前苏联、韩国、加拿大等国家对于星斑川鲽的研究较多；我国对星斑川鲽的研究仅见对星斑川鲽的分类学进行了少量报道。美国和日本对星斑川鲽早期发育作了详细系统的描述。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对星斑川鲽种质需求的不断扩大，星斑川鲽的精子冷冻技术急需建立起来。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。鱼类精液的超低温保存可以使种质的长距离运输得以实现，同时有利于鱼类的杂交、选育、优良性状的获得以及基因多样性的保护。因此，建立星斑川鲽精子大容量超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，将星斑川鲽的精液与抗冻液按体积比1:3的比例混合，在0℃孵育6-8分钟，孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存；
所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为100mM蔗糖，100mM KHCO3，25mM NaHCO3；抗冻剂为终浓度8%的（V/V）DMSO（二甲基亚砜）和终浓度7%的（V/V）Gly（甘油）；添加剂：5mM还原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%蛋黄（V/V）。
所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。所述冻存管为2ml或5ml的冻存管。
所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。
将混合抗冻液和精液的冻存管置于碎冰中（0℃）轻轻震荡混匀6min，使之充分混匀，然后置于0℃平衡2min；而后以分段降温方式处理，即以-8℃/min的降温速率降温至-60℃，然后再以-15℃/min的降温速率降温至-120℃平衡2分钟。
所述星斑川鲽的精液是采集处于繁殖期的星斑川鲽雄鱼，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔、擦净，轻轻挤压腹部获得新鲜精液，而后将活力高于85%的精液与抗冻液混合。
将经液氮处理分装保存的星斑川鲽冻精进行解冻，将其直接放入37℃水浴100s，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。
所述冻精进行解冻直接放入37℃水浴100s，期间不断摇动冻存管。
上述解冻后的冻精采用自然海水激活，载玻片上滴一滴自然海水，置于显微镜下，用牙签的尖部轻轻沾取冻精，在载玻片上的海水里混匀，经计算机辅助分析解冻后精子活率高于70%。
本发明具有如下优点：
1.本发明把星斑川鲽精子经过抗冻剂处理、降温冷冻、置于液氮中长期保存的过程；其冷冻保存方式冻存管容积较大，保存精液量大；
2.本发明采用二甲亚砜（DMSO）与甘油（Gly）混合为抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
3.本发明的抗冻液中加入了还原型谷胱甘肽5mM；牛磺酸50mM；10%蛋黄（V/V），对精子的质膜起到很好的保护作用；
4.本发明冷冻方式在降温前，鲜精与抗冻液进行了充分的震荡混匀、孵育6-8min，使得鲜精在程序降温冷冻前得到充分的脱水和保护；
5.本发明冷冻分段降温时，采用以-8℃/min速度降温，使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后采用-15℃/min的降温速率快速进入稳定状态-120℃，然后投入液氮；
6.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用二步解冻法，37℃和20℃两步解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤；
7.本发明冷冻处理过程中降温程序精密，重复性稳定性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于70%。
具体实施方式
实施例1：
1）2013年三月份正值星斑川鲽生殖期，于山东日照增养殖站，亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得新鲜精液10ml，存于干净的离心管中，避光，显微镜检测活力高于85%的精液置于冰盒中带回实验室进行冷冻保存；
2）抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为100mM蔗糖，100mM KHCO3，25mM NaHCO3；抗冻剂为8%（V/V）DMSO（二甲基亚砜）和7%（V/V）甘油（Gly）；添加剂：5mM还原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%（V/V）蛋黄。所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，称取34.2g蔗糖，10g KHCO3，8.4g NaHCO3，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂，其中含8%DMSO（V/V）和7%Gly（V/V）作为抗冻剂（即100mL含8mLDMSO，及7mLGly）；然后将已配置好的抗冻剂作为基础液，加入0.153g还原型谷胱甘肽，0.625g牛磺酸,10mL蛋黄，定容至100mL。
3）将上述鲜精与抗冻液以体积1:3的比例混合，而后在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀6min，分装至2ml或5ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；
4）将冻存管置于降温仪中0℃平衡2min，而后以分段方式降温处理；即以-8℃/min降温至-60℃，然后以-15℃/min降温至-120℃，平衡2分钟；将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一按顺序放入冻存盒中，然后放入液氮容器中长期贮存（-196℃）；
5）将上述冷冻保存2周后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入37℃水浴锅中，轻轻摇动100s后在室温（20℃）条件下置于振荡器震荡30s至完全融解；
6）将上述融解后精液用自然海水激活，激活后在显微镜检测冻精活力高于70%，其中大部分精子都做快速的直线运动，且在显微镜下可持续快速运动30s-1min。
7）将冻精与卵子以1:200(v/v)的比例，即5μ冻精加入1mL卵子，进行人工授精，受精率、孵化率均高于80%。
实施例2
1）2010年1-2月份正值星斑川鲽生殖生殖期，于日照增养殖站，亲鱼养殖车间，捞取性腺发育较好的雄鱼20余尾，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得新鲜精液于离心管中，置于冰盒中运回实验室；经显微镜检测活力高于85%用于冷冻保存。
2）将上述鲜精与预先配置的抗冻液以体积比1:3的比例混合，而后在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀6min，分装至2ml或5ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；
3）将冻存管置于降温仪中0℃平衡2min，而后以分段方式降温处理；即以-8℃/min降温至-60℃，然后以-15℃/min降温至-120℃，平衡2分钟；
4）将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后按顺序逐一放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存（-196℃）；
5）将上述冷冻保存的冻精分别在2010年5月份，2011年5月份，2012年5月份，任意选取1个冻存管解冻，按照37℃水浴锅中，轻轻摇动100s，然后在室温（20℃）条件下放置于振荡器震荡30s至完全融解，融解后精液用自然海水激活，激活后在显微镜检测冻精活力均高于70%，且三次解冻后活力差异不显著，其中大部分精子都做快速的直线运动，且在显微镜下可持续快速运动30s-1min。

Claims (7)

1.一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：将星斑川鲽的精液与抗冻液按体积比1:3的比例混合，在0℃孵育6-8分钟，孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮，分装保存；
将混合抗冻液和精液的冻存管置于碎冰中轻轻震荡混匀6min，使之充分混匀，然后置于0℃平衡2min；而后以分段降温方式处理，即以-8℃/min的降温速率降温至-60℃，然后再以-15℃/min的降温速率降温至-120℃平衡2分钟；
所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为100mM蔗糖，100mM KHCO3，25mM NaHCO3；抗冻剂为终浓度8%的DMSO和终浓度7%的Gly；添加剂：5mM还原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%蛋黄。
2.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。
3.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：冻存管为2ml或5ml的冻存管。
4.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。
5.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述星斑川鲽的精液是采集处于繁殖期的星斑川鲽雄鱼，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔、擦净，轻轻挤压腹部获得新鲜精液，而后将活力高于85%的精液与抗冻液混合。
6.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：将经液氮处理分装保存的星斑川鲽精液进行解冻，将其直接放入37℃水浴100s，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。
7.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述冻精进行解冻直接放入37℃水浴100s，期间不断摇动冻存管。
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