CN103314949B

CN103314949B - 太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法

Info

Publication number: CN103314949B
Application number: CN201310214264.2A
Authority: CN
Inventors: 刘清华; 李军; 于道德; 官曙光
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103314949A

Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体的说是一种太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法。将太平洋鳕鱼精液与抗冻液以1∶4-1∶3的体积比例混合，混合后在0-4℃孵育平衡8-10分钟；孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存；所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂组成，本发明的太平洋鳕鱼精子长期冷冻保存方法对于太平洋鳕鱼人工繁育、种质保存及可持续养殖等方面有着重要意义。

Description

太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体的说是一种太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法。

背景技术

太平洋鳕Gadus macrocephalus又名大头鳕，分布于太平洋北部沿岸海域，从北太平洋西南部的黄海，经韩国至白令海峡和阿留申群岛，沿太平洋东海岸的阿拉斯加、加拿大至美国的洛杉矶一带沿海，太平洋鳕是典型的冷水性海水鱼类。我国太平洋鳕主要产于黄海，最高年产量达26000吨，是我国北方乃至世界的重要海洋经济鱼类之一。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。鱼类精液的超低温保存可以使种质的长距离运输得以实现，同时有利于鱼类的杂交、选育、优良形状的获得以及基因多样性的保护。太平洋鳕鱼精子冷冻保存方法国内外至今未见报道，因此，建立太平洋鳕鱼精子超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种太平洋鳕鱼精子超低温冷冻保存方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法：将太平洋鳕鱼精液与抗冻液以1:4-1:3的体积比例混合，混合后在0-4℃孵育平衡8-10分钟；孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮(-196℃)，分装保存；

进一步的说，采集处于繁殖期的太平洋鳕鱼雄鱼，将生殖孔微微发红的雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔3次，用洁净的纸巾擦净，拇指与食指轻轻沿着精巢的位置从后向前挤压，用5ml的一次性吸管采集新鲜精液鱼5ml的离心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80％精液，保存待用。

所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂组成，其中稀释液为：NaCl8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O0.6g/L，KH₂PO₄0.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗冻剂为终浓度10％(V/V)的丙二醇(PG)；添加剂为：终浓度5％(V/V)的蛋黄和终浓度5％BSA(V/V)。抗冻液的配制进一步的说，首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl8g，Na₂HPO4·2H₂O0.6g，KH₂PO₄0.6g，海藻糖37.8g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂，其中含10％PG(V:V)(即100mL含10mL PG)；然后将已配置好的抗冻剂作为基础液，加入5mL蛋黄和5mLBSA,定容至100mL。

所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。所述经抗冻液混合的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的冻存管中。

所述采集处于繁殖期的太平洋鳕鱼雄鱼，将生殖孔微微发红的雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，用洁净的纸巾擦净，拇指与食指轻轻沿着精巢的位置从后向前挤压，用5ml的一次性吸管采集新鲜精液鱼5ml的离心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80％精液，保存待用。

所述太平洋鳕鱼的精液与抗冻液在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀3-5min，然后以-5℃/min降温至-60℃，然后再以-10℃/min降温至-120℃平衡3min直接投入到液氮(-196℃)中保存。

将经液氮冷冻保存的太平洋鳕鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-40℃水浴90-120s，然后置于室温18-20℃完全融解，而后于自然海水中激活。

通过计算机辅助分析系统检测冻精活力，将载玻片上滴一滴自然海水，然后将载玻片置于显微镜下，用牙签的尖部轻轻沾取冻精，在载玻片上的海水里混匀，显微镜目镜调至20倍，观察冻精的运动状态，将运动速度高于20um/s的精子定义为运动的精子，经显微测冻精的运动率均高于85％；

解冻后的精子经过超微结构分析显示70％以上的冻精的结构与鲜精的结构一致，均保持了结构的完整性。

本发明具有如下优点：

1.本发明冷冻保存方法中抗冻液采用丙二醇(PG)为抗冻剂，渗透性好而且毒性小；同时加入5％(V/V)蛋黄和5％BSA(V/V)，对精子的质膜起到很好的保护作用，而且稀释液中的海藻糖对精子的在平衡处理及冷冻过程中的氧化损伤有预防和修复作用；

2.本发明冷冻保存过程中采用5ml冻存管容积较大，保存精液量大；对于太平洋鳕鱼这种海水鱼类的育种、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义，并且降温前鲜精与抗冻液进行了充分的混匀、孵育8min，使得鲜精在程序降温冷冻前得到充分的脱水和保护；再以分段降温方式，采用以-5℃/min速度降温，使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后采用-10℃/min的降温速率快速进入稳定状态-120℃，然后投入液氮；

3.本发明所得冷冻精子从液氮中取出后，直接放入35-40℃中水温解冻，快速度过重结晶区，减少重结晶对精子的损伤；并且重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于80％；

具体实施方式

实施例1

1)2013年2月份正值太平洋鳕鱼生殖生殖期，于日照养殖场亲鱼培育，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔3次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得新鲜精液，存于干净的离心管中，并通过计算机辅助分析系统，显微镜检测活力高于90％，置于碎冰上带回实验室进行冷冻保存；

2)抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂(稀释液+10％PG+10％蛋黄+5％BSA)，配置后置于0-4℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液成分为：NaCl8g/L，Na₂HPO₄·2H2O0.6g/L，KH₂PO40.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗冻剂为10％(V/V)(添加后的终浓度)的丙二醇(PG)；添加剂为：5％(V/V)(添加后的终浓度)蛋黄和5％BSA(V/V)(添加后的终浓度)，所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。

抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl8g，Na₂HPO4·2H2O0.6g，KH₂PO40.6g，海藻糖37.8g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂，其中含10％PG(V:V)(即100mL含10mLPG)；然后将已配置好的抗冻剂作为基础液，加入5mL蛋黄和5mLBSA,定容至100mL。

3)将上述鲜精与抗冻液以体积1:4的比例混合，而后在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀3min，分装至2ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；

4)将冻存管置于降温仪中0℃平衡5min，而后以分段方式降温处理；即-5℃/min降温至-60℃，然后以-10℃/min降温至-120℃，平衡2分钟，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一顺序放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；

5)将上述冷冻保存的精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存管快速从液氮容器中取出放入40℃水浴锅中，轻轻摇动100s，然后放置室温完全融化，自然海水激活。

6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后在计算机辅助分析检测冻精活力，观察冻精的运动状态，将运动速度高于20um/s的精子定义为运动的精子，经显微测冻精的运动率均高于85％；解冻后的精子经过超微结构分析显示70％以上的冻精的结构与鲜精的结构一致，均保持了结构的完整性。其冻精活力的检测通过计算机辅助分析系统，即将载玻片上滴一滴自然海水，然后将载玻片置于显微镜下，用牙签的尖部轻轻沾取冻精，在载玻片上的海水里混匀，显微镜目镜调至20倍，观察冻精的运动状态，将运动速度高于20um/s的精子定义为运动的精子，经显微测冻精的运动率均高于85％；

实施例2

1)2013年3月份正值太平洋鳕鱼生殖生殖期，于日照养殖场亲鱼培育，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔3次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得新鲜精液，共采集四尾雄鱼，获得新鲜精液80mL，显微镜初步检测冻精活力85-90％，然后置于碎冰上带回实验室进行冷冻保存；

2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和水组成(稀释液+10％PG+10％蛋黄+5％BSA)，配置后置于0-4℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液成分为：NaCl8g/L，Na₂HPO4·2H2O0.6g/L，KH₂PO40.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗冻剂为10％(V/V)(添加后的终浓度)的丙二醇(PG)；添加剂为：5％(V/V)(添加后的终浓度)蛋黄和5％BSA(V/V)(添加后的终浓度)，所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。

抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl8g，Na₂HPO4·2H₂O0.6g，KH₂PO40.6g，海藻糖37.8g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂，其中含10％PG(V:V)(即100mL含10mL PG)；然后将已配置好的抗冻剂作为基础液，10mL蛋黄和10mLBSA,定容至200mL。

3)将上述鲜精与抗冻液以体积1:3的比例混合，而后在碎冰中(0-4℃)轻轻震荡、充分混匀5min，分装至5ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；

5)1上述冷冻保存的精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存管快速从液氮容器中取出放入37℃水浴锅中，轻轻摇动100s，然后放置室温完全融化，自然海水激活。

6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后在计算机辅助分析检测冻精活力，观察冻精的运动状态，经显微检测冻精的运动率均高于80％；经过超微结构分析显示70％以上的冻精的结构与鲜精的结构一致，均保持了结构的完整性。

Claims

1.一种太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：

将太平洋鳕鱼精液与抗冻液以1:4-1:3的体积比例混合，混合后在0-4℃孵育平衡8-10分钟；孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮-196℃，分装保存；

所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂组成，其中稀释液为：NaCl 8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗冻剂为终浓度10％V/V的丙二醇PG；添加剂为：终浓度5％V/V的蛋黄和终浓度5％BSA V/V；

所述太平洋鳕鱼的精液与抗冻液在碎冰中0℃轻轻震荡、充分混匀3-5min，然后以-5℃/min降温至-60℃，然后再以-10℃/min降温至-120℃平衡3min直接投入到液氮-196℃中保存。

2.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。

3.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液与太平洋鳕鱼的精液混匀后置于2ml或5ml的冻存管中。

4.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：采集处于繁殖期的太平洋鳕鱼雄鱼，将生殖孔微微发红的雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，用洁净的纸巾擦净，拇指与食指轻轻沿着精巢的位置从后向前挤压，用5ml的一次性吸管采集新鲜精液于5ml的离心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80％精液，保存待用。

5.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将经液氮冷冻保存的太平洋鳕鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-40℃水浴90-120s，然后置于室温18-20℃完全融解，而后于自然海水中激活。