CN112931488A - 一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物技术领域，具体地说是一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法。将多鳞白甲鱼的精液与抗冻液按体积比1:35的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(‑196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成。本发明获得的冻精对于多鳞白甲鱼人工繁育、种质保存、遗传多样性保护及可持续养殖等方面有着重要意义。

Description

一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
技术背景
多鳞白甲鱼(Scaphesthes macrolepis)是鲤科、白甲鱼属的一种鱼类。体较细长，侧扁。背部稍隆起，腹部圆。多鳞白甲鱼为暖温性淡水鱼类。生活在海拔270-1500米、水质清澈、砂石底质的高山溪流中。杂食性，主要摄食体壁较薄的水生昆虫(如摇蚊的幼虫或成虫、黑纹石蚕的幼虫或茧、白川谷蜉蝣的稚虫、石蚕的幼虫、黑蚂蚁)等无脊椎动物，也摄食藻类(如螺带水绵、短发状绿苔)。取食砾石表面的藻类时，先用下颌猛铲，然后翻转身体，把食饵嬲人口中。主要分布于中国嘉陵江水系和汉水水系的中上游、淮河上游、渭河水系、伊河、洛河、海河上游的滹沱和山东泰山的溪涧。多鳞白甲鱼肉质鲜美，具有较高的营养价值。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对多鳞白甲鱼种质需求的不断扩大，多鳞白甲鱼的精子冷冻技术急需建立起来。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义：可以使种质的长距离运输得以实现，有利于鱼类的杂交、选育以及基因多样性的保护。随着我国经济的飞速发展及淡水污染的日益加剧，重要淡水养殖优良品种种质保存已成为我国淡水养殖业中亟待解决的问题。建立多鳞白甲鱼精子的超低温冷冻技术，无论是对其遗传多样性的保护，还是开展生物技术育种以及海水养殖业的可持续发展，都有着迫切的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
将多鳞白甲鱼的精液与抗冻液按体积比1:35的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由甲液、乙液组成，抗冻剂为35％(抗冻剂的终浓度；V/V)甘油，添加剂是10.0g/L海藻糖。
所述稀释液由甲液、乙液组成。其中，甲液：取NaCl 2.5g，KCl 0.02g，CaCl2·6H2O0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，用双蒸水配成950mL，热压消毒，冷却。乙液：取NaHCO3 0.25g，Na2CO3 0.05g溶于100mL双蒸水，过滤消毒。取甲液95mL，加入乙液5mL，配成100mL，即成稀释液。
所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为35％甘油(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
选用5.0mL的冻存管，每管加入120μL鲜活精液，再加入4.2mL的抗冻液(混合比1:35)，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。
称取0.0432g添加剂海藻糖，加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min。
将分装后的精液采用两步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-60℃区间，-20℃/min，-60～-100℃区间，-40℃/min。
将分装保存于液氮中的多鳞白甲鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，轻轻摇晃至没有明显液氮珠残留，然后迅速将冻存管放入50℃恒温水浴锅中水浴解冻，待只剩一点冰核时取出。
吸取精液，在淡水鱼生理盐水(取NaCl 7.5g，KCl 0.2g，CaCl2 0.2g，NaHCO3 0.2g，用蒸馏水配成1L)中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标，随机取3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子的比例，经检测解冻后精子运动率与鲜精差异不显著，90％以上的解冻后精子做快速的直线运动。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
一、本发明冷冻保存过程中采用甘油作抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
二、本发明冷冻保存过程中采用5.0ml冻存管，容积较大，保存精液量大；
三、降温前将抗冻保护剂与稀释液混合，制成混合液，并置于4℃冰箱备用，节省了时间，操作简便易行；
四、精子与抗冻液按比例每管加入120μL鲜活精液，再加入4.2mL的抗冻液(混合比1:35)，称取0.0432g添加剂海藻糖，加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min，使抗冻保护剂充分渗入细胞中，使抗冻剂充分渗入细胞中起保护作用，具有重要生产意义。
五、本发明冷冻保存过程分段降温时，将分装后的精液采用两步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-60℃区间，-20℃/min，-60～-100℃区间，-40℃/min。后直接投入到液氮中长期保存至激活，适宜的降温速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”的关键，整个保存过程时间较短；冷冻保存降温程序简便易操作，重复性稳定性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于90％，与鲜精活力差异不显著；
六、本发明冷冻精子从液氮中取出后，将解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，轻轻摇晃至没有明显液氮珠残留，然后迅速将冻存管放入50℃恒温水浴锅中水浴解冻，待只剩一点冰核时取出，既可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的精子结构损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)2020年06月，自嘉陵江水系捕获精巢发育良好的活体雄鱼12条，体重每条800g-1200g，用手轻轻挤压腹部有精液流出。将其置于干燥纱布上，蒸馏水冲洗生殖孔三次至无尿液、黏液残留，干净卫生纸擦净，轻轻在腹部沿鱼头至鱼尾方向挤压，将未经污染的精液收集在50mL离心管中。用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测精子运动率，选择运动率高于90％的样品进行冷冻保存。
(2)将多鳞白甲鱼的精液与抗冻液按体积比1:35的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由甲液、乙液组成，抗冻剂为35％(抗冻剂的终浓度；V/V)甘油，添加剂是10.0g/L海藻糖。
(3)选用5.0mL的冻存管，每管加入120μL鲜活精液，再加入4.2mL的抗冻液(混合比1:35)，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。
(4)称取0.0432g添加剂海藻糖，加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min。
(5)将分装后的精液采用两步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-60℃区间，-20℃/min，-60～-100℃区间，-40℃/min。
将分装保存于液氮中的多鳞白甲鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，轻轻摇晃至没有明显液氮珠残留，然后迅速将冻存管放入50℃恒温水浴锅中水浴解冻，待只剩一点冰核时取出。
(6)吸取精液，在淡水鱼生理盐水(取NaCl 7.5g，KCl 0.2g，CaCl2 0.2g，NaHCO30.2g，用蒸馏水配成1L)中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。激活后用显微镜检测冻精运动率＞90％，接近鲜精水平。
实施例2
(1)2019年5-6月份正值多鳞白甲鱼生殖期，于淮河上游，多鳞白甲鱼亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集多鳞白甲鱼40余尾，共计鲜精80ml，显微镜检测活力高于80％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存；
(2)将多鳞白甲鱼的精液与抗冻液按体积比1:35的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由甲液、乙液组成，抗冻剂为35％(抗冻剂的终浓度；V/V)甘油，添加剂是10.0g/L海藻糖。
(3)所述稀释液由甲液、乙液组成。其中，甲液：取NaCl 2.5g，KCl 0.02g，CaCl2·6H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，用双蒸水配成950mL，热压消毒，冷却。乙液：取NaHCO30.25g，Na2CO3 0.05g溶于100mL双蒸水，过滤消毒。取甲液95mL，加入乙液5mL，配成100mL，即成稀释液。
(4)所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为35％甘油(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
(5)选用5.0mL的冻存管，每管加入120μL鲜活精液，再加入4.2mL的抗冻液(混合比1:35)，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。
(6)称取0.0432g添加剂海藻糖，加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min。
(7)将分装后的精液采用两步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-60℃区间，-20℃/min，-60～-100℃区间，-40℃/min。
(8)将分装保存于液氮中的多鳞白甲鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，轻轻摇晃至没有明显液氮珠残留，然后迅速将冻存管放入50℃恒温水浴锅中水浴解冻，待只剩一点冰核时取出。
(9)按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：吸取精液，在淡水鱼生理盐水(取NaCl 7.5g，KCl 0.2g，CaCl2 0.2g，NaHCO3 0.2g，用蒸馏水配成1L)中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。
(10)将冻精用于人工授精，受精率、孵化率均在80％以上，苗种成活率与鲜精无显著差异。

Claims (8)

1.一种多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：
将多鳞白甲鱼的精液与抗冻液按体积比1:35的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)中分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由甲液、乙液组成，抗冻剂为35％(V/V)甘油，添加剂是10.0g/L海藻糖。
2.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述稀释液由甲液、乙液组成。其中，甲液：取NaCl 2.5g，KCl 0.02g，CaCl2·6H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，用双蒸水配成950mL，热压消毒，冷却。乙液：取NaHCO30.25g，Na2CO30.05g溶于100mL双蒸水，过滤消毒。取甲液95mL，加入乙液5mL，配成100mL，即成稀释液。
3.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为35％甘油(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
4.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：选用5.0mL的冻存管，每管加入120μL鲜活精液，再加入4.2mL的抗冻液(混合比1:35)，充分混匀，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。
5.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：称取0.0432g添加剂海藻糖，加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷15min。
6.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将分装后的精液采用两步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-60℃区间，-20℃/min，-60～-100℃区间，-40℃/min。
7.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将分装保存于液氮中的多鳞白甲鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，轻轻摇晃至没有明显液氮珠残留，然后迅速将冻存管放入50℃恒温水浴锅中水浴解冻，待只剩一点冰核时取出。
8.按权利要求1所述的多鳞白甲鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：吸取精液，在淡水鱼生理盐水(取NaCl 7.5g，KCl 0.2g，CaCl20.2g，NaHCO30.2g，用蒸馏水配成1L)中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。
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