CN110786321A - 一种金钱鱼精子冷冻保存方法 - Google Patents

一种金钱鱼精子冷冻保存方法 Download PDF

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CN110786321A CN201911235004.7A CN201911235004A CN110786321A CN 110786321 A CN110786321 A CN 110786321A CN 201911235004 A CN201911235004 A CN 201911235004A CN 110786321 A CN110786321 A CN 110786321A
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Abstract

本发明公开了一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其包括精液采集、精液稀释、精子冷冻保存和精子解冻四个步骤，先挑选雄性金钱鱼在背肌注射人绒毛膜促性腺激素，然后再采用人工腹部挤压法采集金钱鱼的精液，然后将精液与抗冻液混合得到金钱鱼精子的保存液，所述稀释液为TS‑2稀释液、TS‑19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种与二甲亚砜混合配制的；接着将精子保存液注入冻存管中，再采用分段逐步降温法进行冷冻，然后浸入液氮长期保存；取用时将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后置于温度为42℃的水浴锅中解冻。本发明方法能够长期保存金钱鱼的精子，且解冻复苏后精子成活率和授精率高。

Description

一种金钱鱼精子冷冻保存方法
技术领域
本发明属于生物学低温冷冻保存技术领域，具体涉及一种金钱鱼精子冷冻保存方法。
背景技术
南海是世界第三大陆缘海，面积约350万km2，其中我国管辖海域面积约201万km2。由于其海域辽阔、水质优良、海洋资源丰富，鱼、虾、贝、藻等海洋生物种类、品种众多，总计约有4168种，约占全国相应类群种类的52.2％。随着全球经济的加快及南海周边国家竞相发展海洋经济，我国也加快南海区海洋资源的开发步伐。但是伴随着海洋经济的加快发展，我国已出现了渔业种质资源衰退；海域污染情况日趋严重；赤潮频频；近海生态环境恶化等问题，这些严重影响和制约我国海洋经济的健康发展。因此，保护好海洋生态环境的同时，我们也要注重保护原有野生资源、注重种质保存，为今后实现可持续发展提供途径。
金钱鱼（Scatophagus argus），又名金鼓鱼，原产于东南亚的沿海地区，其体长为25～30cm，适宜生活在水温为22～25℃的环境中，金钱鱼属于金钱鱼科，体略呈椭圆形，侧扁而高，背鳍硬棘与软条间具有深缺刻，体表呈褐色，腹缘银白色，鱼体上有许多深色圆斑。金钱鱼为沿岸岩礁区的鱼，能以纯淡水饲养，但最好还是加些盐分，以使其发育得更好。金钱鱼作为一种常见的食材，能为人体补充多种营养，特别是蛋白质和维生素以及氨基酸，另外微量元素也是金钱鱼中最重要的存在，平时人们食用它以后能吸收镁、钙、铁以及磷等多种微量元素，可以满足身体各器官对这些营养成分的需要，对提高身体素质有很大的好处，同时金钱鱼还因为其背部独特花纹，现在许多人喜欢将金钱鱼的稚鱼作为观赏鱼饲养。随着人们对金钱鱼的需求增加，许多地区都开始进行人工养殖，而且养殖规模不断增加，使得金钱鱼种苗的需求也逐渐增大，对金钱鱼种苗的品质也逐年提高。尽管人工繁殖可以使金钱鱼集中产卵，提高鱼卵受精率、孵化率和鱼苗成活率，并做到有计划地生产。但因为金钱鱼的繁育具有季节性，而且存在雌雄性腺发育不同步、雄性一般先于雌性成熟的现象，这些都增加了人工繁殖的难度。如果能在繁育季节采集并长期保存金钱鱼的精子，就能克服这些困难，从而满足金钱鱼全年的繁育生产需要，提高金钱鱼在非繁育季节时的人工授精效率和育苗成活率，但是目前少有能够长期保存金钱鱼精子的方法。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种金钱鱼精子冷冻保存方法，能够长期保存金钱鱼的精子，且解冻复苏后精子成活率和授精率高。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为190～220g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产20h以上，期间观察雄鱼精液量的变化，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：5～15%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-2稀释液，TS-19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3～5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
进一步的，步骤（2）中所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖。
进一步的，所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分：10g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，37.65g/LSucrose，1.21g/L Tris，所述TS-2稀释液的pH为8.2；所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分：4.56g/L NaC1，2.1g/L NaHCO3 ，3.5g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，7.13g/LGlucose，17g/L Sucrose，1.21g/L Tris，所述TS-19的pH为9.56；所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分：8.01g/L NaC1，0.4g/L KCI，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35g/L NaHCO3 ，0.06g/L KH2PO4，0.1g/L MgCl·6 H2O ，0.1g/L MgSO4·7 H2O，0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ，10g/L Glucose，所述Hank’s稀释液的pH为6.8；所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分：7.25g/L NaC1，0.38g/L KCI，0.18g/L CaCl2·2H2O，1g/L NaHCO3，0.23g/L MgSO4·7H2O，0.41g/L NaH2PO4·H2O，1g/L Glucose，所述Cortland稀释液的pH为7。
进一步的，步骤（2）中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
1、本发明根据金钱鱼的精子特性，将稀释液和二甲亚砜按照比例进行混合配制抗冻液，然后将金钱鱼的精液和抗冻液混合后进行低温冷冻保存，所用的抗冻液能防止精子受到冰晶和氧化损伤而影响精子保存效果和解冻后精子的成活率和受精率，同时严格控制抗冻液中二甲亚砜的浓度，使其在金钱鱼精子所适应的浓度范围内，不会因为二甲亚砜浓度过高造成金钱鱼精子中毒；同时本发明在抗冻液中还加入了海藻糖，海藻糖能够对金钱鱼精子起到保护作用，减少金钱鱼精子细胞的损伤，从而提高了金钱鱼精子的活力。
2、本发明冷冻保存过程中设定了多种不同稀释液进行抗冻液的配制，同时采用分步降温方法、严格控制单一变量进行冷冻条件筛选，所得冷冻保存条件组合更适合金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后金钱鱼精子的活力能够达到80%以上。
3、本发明降温前将稀释液与抗冻保护剂混合配制成抗冻液，并置于4℃冰箱保存备用，操作简便快捷，节省了时间。
4、本发明方法选择体重为190～220g的2龄金钱鱼雄鱼进行精液提取和保存，是因为这样选择的雄鱼的生殖系统发育较完善、机制较健全，比较适合人工繁殖，而且在注射人绒毛膜促性腺激素后能够在一个时间段内集中产卵排精，以提高鱼类人工繁殖效率。
5、本发明方法操作简单、冷冻保存效果好、成本低，可以长期保存金钱鱼的精子，实现金钱鱼种质资源的永久保存，而且能够在金钱鱼的繁育季节大量挑选保存优质精液，用于金钱鱼全年的人工繁育生产。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为200g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产20h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为Hank’s液；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分：8.01g/L NaC1，0.4g/L KCI，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35g/L NaHCO3 ，0.06g/LKH2PO4，0.1g/L MgCl·6 H2O ，0.1g/L MgSO4·7 H2O，0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ，10g/LGlucose，所述Hank’s稀释液的pH为6.8；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为90.118%。
实施例2：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为210g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产24h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为灭菌海水；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为91.70%。
实施例3：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为220g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产36h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：8%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-2稀释液；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分：10g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，37.65g/LSucrose，1.21g/L Tris，所述TS-2稀释液的pH为8.2；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为83.522%。
实施例4：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为190g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产32h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-19稀释液；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分：4.56g/L NaC1，2.1g/L NaHCO3 ，3.5g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，7.13g/LGlucose，17g/L Sucrose，1.21g/L Tris，所述TS-19的pH为9.56；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为86.310%。
实施例5：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为208g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产48h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为Cortland稀释液；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分：7.25g/L NaC1，0.38g/L KCI，0.18g/L CaCl2·2H2O，1g/L NaHCO3，0.23g/L MgSO4·7H2O，0.41g/L NaH2PO4·H2O，1g/L Glucose，所述Cortland稀释液的pH为7；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为81.127%。
实施例6：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为215g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产28h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为灭菌海水；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为94.871%。
实施例7：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为190g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产30h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为Hank’s液；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分：8.01g/L NaC1，0.4g/L KCI，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35g/L NaHCO3 ，0.06g/L KH2PO4，0.1g/L MgCl·6 H2O ，0.1g/LMgSO4·7 H2O，0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ，10g/L Glucose，所述Hank’s稀释液的pH为6.8；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为95.008%。
实施例8：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为195g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产24h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：8%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-2稀释液；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分：10g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，37.65g/LSucrose，1.21g/L Tris，所述TS-2稀释液的pH为8.2；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为90.112%。
实施例9：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为220g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产40h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-19稀释液；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分：4.56g/L NaC1，2.1g/LNaHCO3 ，3.5g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，7.13g/L Glucose，17g/L Sucrose，1.21g/L Tris，所述TS-19的pH为9.56；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为88.020%。
实施例10：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为195g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产56h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：10%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为Cortland稀释液；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分：7.25g/L NaC1，0.38g/LKCI，0.18g/L CaCl2·2H2O，1g/L NaHCO3，0.23g/L MgSO4·7H2O，0.41g/L NaH2PO4·H2O，1g/L Glucose，所述Cortland稀释液的pH为7；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为82.712%。
实施例11：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为215g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产32h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：5%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为Hank’s液；所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分：8.01g/L NaC1，0.4g/L KCI，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35g/L NaHCO3 ，0.06g/L KH2PO4，0.1g/L MgCl·6 H2O ，0.1g/LMgSO4·7 H2O，0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ，10g/L Glucose，所述Hank’s稀释液的pH为6.8；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为86.433%。
实施例12：
一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为205g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产20h，期间观察雄鱼精液量的变化，并且每间隔2～3h可以取样精液0.5ml按照常规方法进行一次精子活力和寿命等参数的测定，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：15%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为灭菌海水；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼精子的冷冻保存，解冻后用海水激活金钱鱼的精子，置于精子质量分析系统中连接的显微镜下观察，同时利用精子质量分析系统（CASA）进行精子质量的计算机辅助检测，利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术，对精子的动静态特征进行全面的量化分析，检测得到解冻精子的活力为89.065%。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：挑选体重为190～220g的2龄金钱鱼，在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜促性腺激素，在水温27～28℃条件下催产20h以上，期间观察雄鱼精液量的变化，然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液，所述抗冻液包括以下体积分数的组分：5～15%二甲亚砜，余量为稀释液；所述稀释液为TS-2稀释液，TS-19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min，接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃，然后在-20℃下平衡5min，再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃，然后在-80℃下平衡5min，接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中，在-196℃下长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3～5min，然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：步骤（2）中所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖。
3.根据权利要求1所述的金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分：10g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，37.65g/LSucrose，1.21g/L Tris，所述TS-2稀释液的pH为8.2；所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分：4.56g/L NaC1，2.1g/L NaHCO3 ，3.5g/L KHCO3 ，3.13g/L BSA，7.13g/L Glucose，17g/L Sucrose，1.21g/L Tris，所述TS-19的pH为9.56；所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分：8.01g/L NaC1，0.4g/L KCI，0.14 g/L CaCl2·2H2O，0.35g/L NaHCO3 ，0.06g/L KH2PO4，0.1g/L MgCl·6 H2O ，0.1g/L MgSO4·7H2O，0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ，10g/L Glucose，所述Hank’s稀释液的pH为6.8；所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分：7.25g/L NaC1，0.38g/L KCI，0.18g/L CaCl2·2H2O，1g/L NaHCO3，0.23g/L MgSO4·7H2O，0.41g/L NaH2PO4·H2O，1g/L Glucose，所述Cortland稀释液的pH为7。
4.根据权利要求1所述的金钱鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：步骤（2）中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。
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