CN110036950B - 一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，包括如下步骤：(1)选取国内冷水性的淡水养殖的虹鳟亲本为父本，选取从国外引进的三倍体硬头鳟，从三倍体中甄选可育二倍体鳟鱼亲本作为母本；(2)由于繁殖时间不一致，采用精液冷冻方法保存淡水养殖的虹鳟精液，冷冻保存之前，镜检观察精液活化情况，将镜检合格的精液进行冻存；(3)选取体格健壮的性成熟的雌性个体，采集卵子，将复苏的冷冻精液与卵子混匀，洗去多余精液；将授精后的卵子置于塑料容器中，采用流水培养，期间不断剔除授精失败发白的卵子，直至发眼卵出现。本发明的优点是实现了海水养殖鳟鱼的国产化，解决了冷水性海水鱼养殖苗种供应不足的难题。
Description
技术领域
本发明属于冷水性鱼类育种技术领域，具体涉及一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法。
背景技术
随着黄海冷水团深远海养殖设备的快速发展，我国北方优质海水性冷水鱼品种严重短缺，亟需解决优质冷水性海水鱼苗种供应的问题。虹鳟属于优质的冷水性鱼类，目前，从挪威、美国、丹麦等国家进口的海水鳟鱼的鱼苗是经过优选的三倍体不育系，鱼苗价格受到市场变动和贸易壁垒波动极大。我国当前的虹鳟养殖主要是在内陆山区的淡水资源养殖虹鳟，缺少适于海水养殖的虹鳟品种，尤其是适于黄海冷水团大型养殖网箱设备养殖的优质虹鳟品种。因此，亟需自主开发适于我国海域养殖的优良的鳟鱼品系，助力深远海养殖业发展和水产养殖种业发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种海水养殖鳟鱼新品系的育种方法，从而实现海水养殖鳟鱼的国产化，解决冷水性海水鱼养殖苗种供应不足的难题。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，包括如下步骤：
(1)选取国内冷水性的淡水养殖的虹鳟亲本为父本，选取从国外引进的三倍体硬头鳟，从三倍体中甄选可育二倍体鳟鱼亲本作为母本，进行国内虹鳟和国外进口鳟鱼的杂交；
(2)在国内淡水虹鳟繁殖期，挑选体格强健的2-3龄、体重600-800g的雄性虹鳟，采集精液，采用精液冷冻方法保存淡水养殖的虹鳟精液，冷冻保存之前，镜检观察精液活化情况，将镜检合格的精液进行冻存；
(3)将冻存的精液在人工授精前运输至全雌二倍体鳟鱼养殖车间，选取体格健壮的性成熟的雌性个体，采集卵子，将复苏的冷冻精液与卵子混匀，轻轻搅动使精卵混合均匀，然后洗去多余精液；将授精后的卵子置于塑料容器中，卵子距离水面3-5cm，采用流水培养，期间不断剔除授精失败发白的卵子，保持水温维持9℃-12℃，直至发眼卵出现。
本发明利用精液冷冻保存技术进行淡水虹鳟精子冷冻保存，解决了淡水虹鳟与国外鳟鱼繁殖不同步的弊端。此外，本发明通过利用精液冷冻保存技术，冷冻精液可随时获取，在国外鳟鱼繁殖季节可实现多组别多批次受精实验，尽可能多的获得可用于商品的新品系鳟鱼养殖苗种。本发明以杂交选育为基础手段，以冷水性的淡水养殖的虹鳟亲本为父本，以国外海水鳟鱼品系中人工优选的可育二倍体鳟鱼为母本，有利于海水驯养管理，实现了鳟鱼新品系冷水性海水养殖，实现了海水养殖鳟鱼的国产化，解决了冷水性海水鱼养殖苗种供应不足的难题。
进一步地，步骤(1)中，国内冷水性的淡水养殖的虹鳟可以从山东西部山区购进。
进一步地，步骤(1)中，三倍体硬头鳟可以从丹麦等地引进。
进一步地，步骤(1)中，通过生长指数和流式细胞仪连用的方法，从三倍体中甄选可育二倍体鳟鱼亲本作为母本。
进一步地，步骤(2)中，精液冷冻保存的方法如下：配制冷冻液，将冷冻液提前放在4℃预冷，对镜检合格的精液进行冻存，冻存的方法为：将镜检合格的精液与提前预冷的4℃的冷冻液按照1:3的体积比混合，稀释精液，放入冻存管中，2-10min后，将冻存管置于液氮表面以上4厘米处10分钟，然后后投入液氮中；所述冷冻液的配方为：6.52mg/ml NaCl，0.8mg/ml KCl，2mg/ml NaHCO3，2mg/ml葡萄糖，4mg/ml牛血清白蛋白，12％V/V DMSO，3％V/V甘油。
目前，国内淡水虹鳟精液冷冻保存领域尚属空白，本发明在实验的基础上获得了冷冻液配方，通过本发明的冷冻精液保存技术可以实现复苏后40-75％的精子保证足够的活力，达到用于生产的精液量的要求。
进一步地，步骤(2)中，镜检合格的精液是指精子运动活力百分率大于90％的精液。
进一步地，步骤(2)中，镜检方法为：用65mM/L NaHCO3和50mM/L Tris，pH 8.8组成的活化液活化精液，用显微镜在10倍镜下镜检，排除精子运动活力百分率≤90％的精液。
进一步地，步骤(2)中，镜检方法为：配制活化液，将新鲜采集的精液与活化液按照1：50-100的体积比混合，镜检保证活动的精子比例达到90％以上；所述活化液配方为：65mM/L NaHCO3，50mM/L Tris，pH＝8.8。
进一步地，步骤(3)中，精液复苏的方法为：精液从液氮取出后，置于液氮上方5cm处放置5分钟，然后将精液置于温水浴中5-10s后取出，将精液与活化液按照2：1的体积比混合，轻轻摇动，在显微镜下镜检活力，当60％的精液出现活力时，可以使用。所述活化液配方为：65mM/L NaHCO3，50mM/L Tris，pH＝8.8。通过上述精液复苏方法，本发明的冷冻精液复苏后与雌性配子受精后，通过统计发眼卵的数量，计算受精成活率可达55％左右，利于后续海水驯化、全面生产需要。
进一步地，步骤(3)中，流水培养的水温维持在10℃。
进一步地，所述海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，还包括步骤(4)：进行盐度驯化，获得海水养殖鳟鱼新品系。
目前我国严重缺少海水养殖鳟鱼品系，生产中所用品种主要以国外引进的选育种为主，且苗种为全雌三倍体不育种，而国内虹鳟品系均为淡水繁养殖品种，虽已形成早产和快速生长的品系，但均不适合海水养殖，因此本发明研究人员自主开发专门用于海水养殖的鳟鱼品种是解决当前冷水性海水鱼养殖苗种问题的关键。本发明以杂交选育为基础手段，首先从国外海水鳟鱼品系中人工优选的可育二倍体个体中获得卵子，同时，利用国内雄性淡水鳟鱼获得精子，进而进行杂交，并对获得后代进行盐度驯化，最终获得海水养殖鳟鱼新品系，新品系充分利用杂种优势，有助于产生性状优良的后代。
与现有技术相比，本发明的优点是：(1)突破了以往虹鳟繁育中仅有本土品系自交的技术局限。早期培育的虹鳟品系多为人工选育的淡水养殖种或野生种驯养而来，不仅造成了严重的近交衰退，种群的异质性降低，而且并不适合冷水性海水养殖，本发明利用淡水虹鳟为父本，国外优选性成熟雌性海水鳟鱼为母本，充分利用杂种优势，进行杂交选育，有利于海水驯养管理，进而实现鳟鱼新品系冷水性海水养殖，实现了海水养殖鳟鱼的国产化，解决了冷水性海水鱼养殖苗种供应不足的难题。(2)本发明充分利用精液冷冻保存技术进行淡水虹鳟精子冷冻保存，解决了淡水虹鳟与国外鳟鱼繁殖不同步的弊端。(3)冷冻精液可随时获取，在国外鳟鱼繁殖季节可实现多组别多批次受精实验，尽可能多的获得可用于商品的新品系鳟鱼养殖苗种。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，包括如下步骤：
(1)选取临沂淡水虹鳟养殖基地养殖的冷水性的淡水养殖的虹鳟亲本为父本；选取从丹麦购进的三倍体硬头鳟，在日照养殖基地培育暂养至性成熟，通过生长指数和流式细胞仪连用的方法，从三倍体中甄选可育二倍体鳟鱼亲本作为母本；
(2)在12月份国内淡水虹鳟繁殖期，挑选体格强健的2-3龄、体重600-800g的雄性虹鳟，用普罗匹星麻醉后，对雄鱼进行腹部按摩，收集精液，期间防止精液与尿、粪便、血液、粘液或水等混合造成污染，将干净可用的精液收集到棕色试剂瓶中，放在冰上直到下一步操作。
由于繁殖时间不一致，采用精液冷冻方法保存淡水养殖的虹鳟精液，精液冻存所需物品为冻存管、枪头、活化液、冷冻液等，冷冻液提前放在4℃预冷。
冷冻保存之前，对采集的精液进行抽样镜检，观察精子运动活力情况，镜检方法为：配制活化液，将新鲜采集的精液与活化液按照1：50-100的体积比混合，用显微镜在10倍镜下镜检，排除精子运动活力百分率≤90％的精液；所述活化液配方为：65mM/L NaHCO3，50mM/L Tris，pH＝8.8。
将镜检合格的精液进行冻存，冷冻保存的方法为：按照精液与提前预冷的4℃的冷冻液的体积比为1:3的比例(精液：冷冻液＝1:3)，将精液加入提前预冷的4℃冷冻液中稀释，放入冻存管中，2-10min后，将冻存管置于液氮表面以上4厘米(约-180℃)处10分钟，然后投入液氮中。冷冻液配方为：6.52mg/ml NaCl，0.8mg/ml KCl，2mg/ml NaHCO3，2mg/ml葡萄糖，4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，12％v/v DMSO，3％v/v甘油。
(3)将液氮保存的精液在人工授精前运输至全雌二倍体鳟鱼养殖车间，选取体格健壮的性成熟的雌性个体，麻醉后轻轻按摩腹部采集卵子到塑料容器中，将复苏的冷冻精液与卵子混匀，用鹅毛或软的胶棒轻轻搅动使精卵混合均匀，大约维持1-2分钟后，用干净的泉水洗去多余精液；将授精后的卵子置于浅的塑料容器中，卵子距离水面3-5cm，采用流水培养，期间不断剔除授精失败发白的卵子，保持水温维持10℃，直至发眼卵出现。
精液复苏方法如下：精液从液氮取出后，置于液氮上方5cm处放置5分钟，后将精液置于37℃的温水浴中5-10s后快速取出，将精液与活化液按照2：1(精液：活化液＝2：1)的体积比混合，轻轻摇动，在显微镜下镜检活力，活化20分钟后精液复苏逐渐明显，当60％的精液出现活力时，可以使用；
所述活化液配方为：65mM/L NaHCO3，50mM/L Tris，pH＝8.8。
目前，国内淡水虹鳟精液冷冻保存领域尚属空白，本发明在实验的基础上获得了冷冻液配方，通过本发明的冷冻精液保存技术可以实现复苏后40-75％的精子保证足够的活力，达到用于生产的精液量的要求。此冷冻精液复苏后与雌性配子受精后，通过统计发眼卵的数量，计算受精成活率可达55％左右，本次实验获得了鱼苗1031尾，突破了目前海淡水鳟鱼杂交品系的技术难题，利于后续海水驯化，全面生产需要。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)选取国内冷水性的淡水养殖的虹鳟亲本为父本，选取从国外引进的三倍体硬头鳟，通过生长指数和流式细胞仪连用的方法，从三倍体中甄选可育二倍体鳟鱼亲本作为母本，进行国内虹鳟和国外进口鳟鱼的杂交；
(2)在国内淡水虹鳟繁殖期，挑选体格强健的2-3龄、体重600-800g的雄性虹鳟，采集精液，采用精液冷冻方法保存淡水养殖的虹鳟精液，冷冻保存之前，镜检观察精液活化情况，将镜检合格的精液进行冻存；
精液冷冻保存的方法如下：配制冷冻液，将冷冻液提前放在4℃预冷，对镜检合格的精液进行冻存，冻存的方法为：将精液与提前预冷的4℃的冷冻液按照1:3的体积比混合，稀释精液，放入冻存管中，2-10min后，将冻存管置于液氮表面以上4厘米处10分钟，然后投入液氮中；所述冷冻液的配方为：6.52mg/ml NaCl，0.8mg/ml KCl，2mg/ml NaHCO3，2mg/ml葡萄糖，4mg/ml牛血清白蛋白，12％v/v DMSO，3％v/v甘油；
镜检方法为：用65mM/L NaHCO3和50mM/LTris，pH 8.8组成的活化液活化精液，用显微镜在10倍镜下镜检，排除精子运动活力百分率≤90％的精液；
(3)将冻存的精液在人工授精前运输至全雌二倍体鳟鱼养殖车间，选取体格健壮的性成熟的雌性个体，采集卵子，将复苏的冷冻精液与卵子混匀，轻轻搅动使精卵混合均匀，然后洗去多余精液；将授精后的卵子置于塑料容器中，卵子距离水面3-5cm，采用流水培养，期间不断剔除授精失败发白的卵子，保持水温维持9℃-12℃，直至发眼卵出现；
精液复苏的方法为：精液从液氮取出后，置于液氮上方5cm处放置5分钟，然后将精液置于温水浴中5-10s后取出，将精液与活化液按照2：1的体积比混合，轻轻摇动，在显微镜下镜检活力，当60％的精液出现活力时，可以使用；所述活化液由65mM/L NaHCO3和50mM/LTris配制而成，pH为8.8。
2.根据权利要求1所述的海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：步骤(1)中，所述国内冷水性的淡水养殖的虹鳟从山东西部山区购进。
3.根据权利要求1所述的海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：步骤(1)中，所述三倍体硬头鳟从丹麦引进。
4.根据权利要求1所述的海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：步骤(2)中，镜检合格的精液是指精子运动活力百分率大于90％的精液。
5.根据权利要求1所述的海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：步骤(3)中，流水培养的水温维持在10℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，其特征在于：所述海水养殖虹鳟的人工杂交育种方法，还包括步骤(4)：进行盐度驯化，获得海水养殖鳟鱼新品系。
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