CN111869656A - 一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法 - Google Patents

一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法，包括在繁殖季节，选取雄鱼进行精液采集，精液和抗冻液按体积比1:3混合，所述抗冻液包括稀释液和抗冻剂，抗冻剂和稀释液的体积比为1:10，将所述精子稀释液进行逐段降温放入液氮中进行长期保存。将精子进行冷冻保存，建立种质资源库，有助于绿鳍马面鲀的种质资源保护，还可以提高育种的可操作性和效率，加快选育进程。

Description

一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及冷冻保存领域，具体地说，是涉及一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法。
背景技术
绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)俗称“扒皮鱼”、“耗儿鱼”，为我国沿海常见的经济性鱼类，主要分布于渤海、黄海和东海，东海为主产区。建立高效稳定的精子冷冻保存方法对于绿鳍马面鲀渔业资源保护和养殖产业的健康发展具有重要意义。
我国沿海的绿鳍马面鲀资源量曾十分充足，由于过度捕捞，近年来绿鳍马面鲀的自然资源遭到严重破坏，渔获量显著下降，目前年产量仅维持在几千吨。冷冻保存不同群体的绿鳍马面鲀精子样本，建立种质资源库，有助于绿鳍马面鲀的种质资源保护。
绿鳍马面鲀养殖性状优良，具有养殖模式多样、养殖周期短、抗病性强、越冬条件宽松等特性，十分适合开展全人工养殖。近年来，规模化苗种繁育和养殖技术获得突破，养殖规模不断扩大。经过多代养殖，养殖群体在生长速度、抗病性等方面表现出一定程度的种质退化。为推动绿鳍马面鲀养殖产业的持续健康发展，急需综合群体选育、家系选育等方法针对快速生长、抗逆等经济性状开展选育工作。建立绿鳍马面鲀精子超低温冷冻保存方法，可以有效保存精子，提高育种的可操作性和效率，加快选育进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明包括以下步骤：
A在繁殖季节，选取生长良好、体形正常、游动活跃、无外伤、精巢发育成熟的雄鱼进行精液采集，挤压绿鳍马面鲀成熟雄鱼的腹部得到精液，并对得到的精液进行精子活力鉴定；
B精液和抗冻液按体积比1:3进行混合，所述抗冻液包括稀释液和抗冻剂,抗冻剂和稀释液的体积比为1:10，将精液与抗冻液混匀后制成精子稀释液，17～22℃静置10～15min；
C将所述精子稀释液进行逐段降温放入液氮中进行长期保存；
D解冻：用37℃的恒温水浴将长期保存在液氮中装有所述精子稀释液的容器解冻1～2min，17～22℃静置至完全融解；
E激活精子：精子稀释液和灭菌海水按照体积比1:50混合后将精子激活，最终获得具有受精能力的精子。
进一步地，所述精子活力鉴定的方法包括自然海水激活精子，通过光学显微镜观察精子活力，计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分数。
进一步地，所述稀释液的配方组成成分为：KCl 0.60～0.90g/L、NaCl 9.00～10.00g/L、CaCl2 0.10～0.20g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.20g/L、葡萄糖0.40～0.80g/L、BSA10.00g/L，所述稀释液pH值调整至7.4～8.0。
进一步地，所述抗冻剂为二甲基亚砜(DMSO)。
进一步地，所述精子降温的方法包括将抗冻液置于17～22℃的水浴中预热。将采集的鲜精和抗冻液以体积1:3的比例混合，充分混匀，在17～22℃的水浴中放置10～15min，随后分装至冻存管中。将冻存管置于液氮液面上方5cm处5min，接着置于液面上5min，最后放入液氮中长期保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明可以高效、长时间地贮存精液，稀释液中添加牛血清白蛋白(BSA)，具抗氧化作用，消除氧化应激产生的自由基，从而保护精子细胞膜免受脂质过氧化的影响；并且BSA与细胞膜接触，防止精子细胞间相互粘连，减少抗冻剂和冷冻过程对于精子的伤害，提高了冷冻复苏后的精子活力。
2.经本方法冷冻保存的精子在复苏后，表现出很强的精子活力，人工授精的受精率和孵化率高，可以用于种质资源库建设和人工选育，有助于绿鳍马面鲀的种质资源保护和养殖产业的健康发展。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1：
2017年6月12日，正值绿鳍马面鲀生殖期，开展了精子的超低温冷冻保存工作。
(1)稀释液和抗冻液的制备
稀释液：由KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)和去离子水组成。各组份浓度为KCl 0.80g/L、NaCl 9.50g/L、CaCl2 0.15 g/L、MgSO4·7H2O 0.18g/L、葡萄糖0.60g/L、BSA 10.00g/L，pH值调整至7.6。
称取KCl 0.80g、NaCl 9.50g、CaCl2 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.18g、葡萄糖0.60g、BSA 10.00g，溶于去离子水至总体积1L。通过10％Na2HCO3调整溶液pH至7.6，放置于4℃冰箱中保存备用。
抗冻液：由稀释液和抗冻剂组成，抗冻剂为二甲基亚砜(DMSO)，将稀释液和抗冻剂混合，使DMSO体积占总体积的10％，充分混匀，现用现配。
(2)精液采集和精子质量评估
精液采集：选取生长良好、体形正常、游动活跃、无外伤、精巢发育成熟的雄鱼进行精液采集。将成熟雄鱼从亲鱼池捞出，腹部用毛巾擦干，用蒸馏水冲洗生殖孔，纸巾擦干。轻轻按压腹部，操作过程尽量避免亲鱼粪便和尿液的污染，获得新鲜精液6ml。
精子质量评估：吸取1～2μl精液置于载玻片上，加入50μl孵化用自然海水激活精子，通过光学显微镜观察精子活力，计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分数。由于精子快速游动的时间仅10秒左右，因而质量评估需要在精子激活后30秒内完成。保留精子活力90％以上的精液用于后续冷冻保存。
(3)精子冷冻保存
采集精液前15min，抗冻液置于20℃的水浴中预热。将采集的鲜精和抗冻液以体积1:3的比例混合，充分混匀，在20℃的水浴中放置10min，随后分装至2ml冻存管中。将冻存管置于液氮液面上方5cm处5min，接着置于液面上5min，最后放入液氮中长期保存。
(4)精子解冻复苏和质量评估
精子解冻复苏：12个月后对精液进行解冻，取出冻存管放入37℃水浴锅中1min，随后转入20℃水浴中至完全融解。
质量评估：吸取1～2μl融解后的精液置于载玻片上，加入50μl孵化用自然海水激活精子。光学显微镜检测精子活力，观察和计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分比，质量评估过程在精子激活后30秒内完成。检测结果表明冻精经复苏后精子活力达到82％。
选取成熟雌鱼，轻压腹部获取卵子，分离出约1000个卵子与200μl融解后的精液混合，50ml孵化用自然海水激活，随后放入2L烧杯中孵化。烧杯水温18～21℃，盐度28～32，连续充气，溶解氧5.0～8.0mg/L，PH 7.8～8.2。12小时后，随机捞取100个受精卵，计数发育至原肠胚的受精卵个数，获得受精率为62％。60小时后，计数孵化仔鱼的个数，获得孵化率为47％。
实施例2：
2017年6月13日，在绿鳍马面鲀生殖期中开展了精子的超低温冷冻保存工作。
(1)稀释液和抗冻液的制备
稀释液：由KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、葡萄糖、BSA和去离子水组成。各组份浓度为KCl 0.70g/L、NaCl 9.20g/L、CaCl2 0.20 g/L、MgSO4·7H2O 0.15g/L、葡萄糖0.50g/L、BSA 10.00g/L，pH值调整至7.8。
称取KCl 0.70g、NaCl 9.20g、CaCl2 0.20 g、MgSO4·7H2O 0.15g、葡萄糖0.50g、BSA 10.00g，溶于去离子水至总体积1L。通过10％Na2HCO3调整溶液pH至7.8，放置于4℃冰箱中保存备用。
抗冻液：将DMSO与稀释液混合，使DMSO体积占总体积的10％，充分混匀，现用现配。
(2)精液采集和精子质量评估
精液采集：选取生长良好、体形正常、游动活跃、无外伤、精巢发育成熟的雄鱼进行精液采集。将成熟雄鱼从亲鱼池捞出，腹部用毛巾擦干，用蒸馏水冲洗生殖孔，纸巾擦干。轻轻按压腹部，操作过程尽量避免亲鱼粪便和尿液的污染，获得新鲜精液5ml。
精子质量评估：吸取1～2μl精液置于载玻片上，加入50μl孵化用自然海水激活精子，通过光学显微镜计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分数，质量评估在精子激活后30秒内完成。保留精子活力90％以上的精液用于后续冷冻保存。
(3)精子冷冻保存
采集精液前15min，抗冻液置于17℃的水浴中预热。将采集的鲜精和抗冻液以体积1:3的比例混合，充分混匀，在17℃的水浴中放置10min，随后分装至2ml冻存管中，将冻存管置于液氮液面上方5cm处5min，接着置于液面上5min，最后放入液氮中长期保存。
(4)精子解冻复苏和质量评估
精子解冻复苏：12个月后对精液进行解冻，取出冻存管放入37℃水浴锅中1min，随后转入18℃水浴中至完全融解。
质量评估：吸取1～2μl融解后的精液置于载玻片上，加入50μl孵化用自然海水激活精子。光学显微镜检观察和计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分比，活力检测在精子激活后30秒内完成。检测结果表明冻精经复苏后精子活力达到79％。
选取成熟雌鱼，轻压腹部获取卵子，分离出约1000个卵子与200μl融解后的精液混合，50ml孵化用自然海水激活，随后放入2L烧杯中孵化。烧杯水温18～21℃，盐度28～32，连续充气，溶解氧5.0～8.0mg/L，PH 7.8～8.2。12小时后，随机捞取100个受精卵，计数发育至原肠胚的受精卵个数，获得受精率为57％。60小时后，计数孵化仔鱼的个数，获得孵化率为48％。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
A在繁殖季节，选取生长良好、体形正常、游动活跃、无外伤、精巢发育成熟的雄鱼进行精液采集，挤压绿鳍马面鲀成熟雄鱼的腹部得到精液，并对得到的精液进行精子活力鉴定；
B精液和抗冻液按体积比1:3进行混合，所述抗冻液包括稀释液和抗冻剂,抗冻剂和稀释液的体积比为1:10，将精液与抗冻液混匀后制成精子稀释液，17～22℃静置10～15min；
C将所述精子稀释液进行逐段降温放入液氮中进行长期保存；
D解冻：用37℃的恒温水浴将长期保存在液氮中装有所述精子稀释液的容器解冻1～2min，17～22℃静置至完全融解；
E激活精子：精子稀释液和灭菌海水按照体积比1:50混合后将精子激活，最终获得具有受精能力的精子。
2.按照权利要求1所述的绿鳍马面鲀精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述精子活力鉴定的方法包括自然海水激活精子，通过光学显微镜观察精子活力，计算视野内快速前向游动精子占全部精子的百分数。
3.按照权利要求1所述的绿鳍马面鲀精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述稀释液的配方组成成分为:KCl 0.60～0.90g/L、NaCl 9.00～10.00g/L、CaCl20.10～0.20g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.20g/L、葡萄糖0.40～0.80g/L、BSA 10.00g/L，所述稀释液pH值调整至7.4～8.0。
4.按照权利要求1所述的绿鳍马面鲀精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻剂为二甲基亚砜(DMSO)。
5.按照权利要求1所述的绿鳍马面鲀精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述精子降温的方法包括将抗冻液置于17～22℃的水浴中预热。将采集的鲜精和抗冻液以体积1:3的比例混合，充分混匀，在17～22℃的水浴中放置10～15min，随后分装至冻存管中。将冻存管置于液氮液面上方5cm处5min，接着置于液面上5min，最后放入液氮中长期保存。
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