CN111406711B - 一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物繁育领域，具体涉及一种肉用山羊的人工繁殖‑杂交联合育种方法，选择肉用性能良好的山羊品种作为母本，选择体格大的山羊品种作为父本；将母本卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，将父本精液采用精子活力增强液浸泡处理后制成精子悬液；将成熟卵母细胞与精子悬液进行体外受精，培养至杂交囊胚形态，移植入母本体内使杂交囊胚在母本体内发育至自然分娩，获得杂种F1代；F1代与母本回交，回交后代与母本多次回交，直至满足育种目标时，横交固定，得到具有优良性状的新品种/系。本发明将人工辅助生殖技术与传统杂交技术相结合，可增加动物胚胎数量、提高动物胚胎成活率，在动物育种领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物繁育领域，具体涉及一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法。
背景技术
优良的家畜品种/系是高效畜牧业的基础。对肉羊而言，其繁殖力、产肉量和肉质品质直接决定经济效益的高低。因此，培育符合当前社会需求的肉羊新品种/系显得尤为重要。杂交育种是常用的新品种/系选育方法，其通过将优良性状的父本和母本杂交，获得具有综合性状的稳定子代，但是由于动物繁殖过程中胚胎数量的限制，每次杂交产生的子代数量非常有限，导致育种时间长，不能及时满足育种生产要求。
人工辅助生殖技术是通过人工手段诱发动物的卵巢和多个卵泡发育，促进超数排卵，帮助精卵结合。该技术可以增加动物胚胎数量，提高动物胚胎成活率，在动物育种领域具有良好的应用前景。然而该技术目前在肉用山羊育种方面应用较少，技术尚不成熟，限制了肉用山羊新品种/系的选育。
发明内容
本发明的目的是提供一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，可以增加动物胚胎数量、提高动物胚胎成活率，在动物育种领域具有良好的应用前景。
本发明提供的一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，包括以下步骤：
S1，选择肉用性能良好的山羊品种作为母本，选择体格大的山羊品种作为父本；
S2，将离体的母本卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；
将离体的父本精液采用精子活力增强液浸泡处理后离心，清洗精子沉淀后再次离心，最后将沉淀用精子上浮液悬浮，制成精子悬液，备用；
S3，将成熟卵母细胞与精子悬液进行体外受精，并将受精卵体外培养至杂交囊胚形态，最后将杂交囊胚移植入母本体内，使杂交囊胚在母本体内发育至自然分娩，获得杂种F1代；
S4，从杂种F1代中选择综合性状优良的个体作为父本，与母本回交，回交步骤参照S2-S3，获得回交一代；
S5，重复S4的步骤，即回交后代与母本多次回交，直至满足育种目标时，横交固定，得到具有优良性状的新品种/系。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，S1中选择的母本为吕梁黑山羊、太行黑山羊或者灵丘青背山羊；选择的父本为金堂黑山羊、沧山黑山羊或者云岭黑山羊。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，所述精子活力增强液的配方如下：胚胎培养水97ml、MgSO4·7H2O 0.02～0.03g、KCl 0.05～0.06g、链霉素0.005g、青霉素0.006g、NaHCO3 0.04～0.05g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g、FBS 3ml。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，所述精子活力增强液还包含0.5g的Hepes。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，所述精子上浮液的配方如下：胚胎培养水100ml、MgSO4·7H2O 0.02～0.03g、KCl 0.05～0.06g、NaHCO3 0.04～0.05g、丙酮酸钠0.004～0.005g、CaCl2·2H2O 0.02g。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，将父本离体的精液采用精子活力增强液浸泡30-40min后，2000rpm离心10-15min，精子活力增强液清洗精子沉淀后再次2000rpm离心10-15min，最后将沉淀用精子上浮液悬浮，制成精子悬液。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，体外受精方式为自然受精方式或者胞浆单精子注射ICSI方式。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，所述受精卵培养杂交囊胚之前进行冷冻-解冻处理步骤，具体条件为：将受精卵从室温以0.5℃/min降温至-15℃，再以0.5℃/min升温至室温，然后进行杂交囊胚培养。
优选的，上述肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，S2中，对母本进行促排卵处理后收集卵母细胞，然后将卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，备用。
与现有技术相比，本发明提供的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法至少具有以下有益效果：
1、本发明将人工辅助生殖技术与传统杂交技术相结合，可以增加动物胚胎数量，提高动物胚胎成活率，在动物育种领域具有良好的应用前景。
2、不同精子活力增强液对精子质量的影响结果显示，经本发明提供的精子活力增强液处理后，山羊精子活力高、畸形率低，具有较高的受精潜力。不同精子上浮液对精子质量的影响结果显示，经本发明提供的精子上浮液处理后，山羊精子活力高、畸形率低。受精卵培养杂交囊胚之前的冷冻-解冻处理步骤对受精卵、囊胚质量的影响结果显示，受精卵培养杂交囊胚之前的冷冻-解冻处理步骤可以淘汰掉质量差的受精卵，保证存活受精卵形成的杂交囊胚具有较好的杂交囊胚成活率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的试验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
下述实施例和实验中所用胚胎培养水为三蒸水。
实施例1
一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，包括以下步骤：
S1，选择肉用性能良好的吕梁黑山羊作为母本，选择体格大的金堂黑羊作为父本；
S2，(1)对母本用按常规方式进行促排卵处理(促排方法参考赵永聚,孙新明,何鹏,et al.不同胎次的母羊超数排卵处理效果的比较[J].中国草食动物科学,2005(s1).)，将离体的母本卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，共计收集13枚成熟卵母细胞，备用。
成熟卵母细胞收集的方法为：用含青链霉素合剂的灭菌生理盐水清洗离体卵巢3次，放入37℃的生理盐水中保温，用带有12号针头的10mL注射器从卵巢表面抽取卵泡进行未成熟卵丘卵母细胞复合体(COCs)的采集，将COCs捡至新的M199采卵液中；捡出的COCs用体外成熟液清洗三遍，最后置于含有体外成熟液的四孔板中，每500μL体外成熟液中含30枚COCs，38.5℃，5％CO2的培养箱中培养22h至成熟(排出第一极体)；24h后将COCs置于含有0.1g/100mL透明质酸酶的DPBS(市售磷酸盐缓冲液，pH7.0)中，挑出含有第一极体的卵母细胞置于体外成熟液中，含有第一极体的卵母细胞即为成熟卵母细胞。
M199采卵液配方：9.5g M199培养基粉末、5mmol NaHCO3、10mmol HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、10mmol HEPES-Na(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐)、10mL FBS、0.01g肝素钠和100×双抗(市售青链霉素混合液，Gibco货号15140-163)，超纯水定容至1L。
体外成熟液配方：0.4mmol丙酮酸钠、10mL FBS、10mg促卵泡素(FSH)、10mg促黄体素(LH)、20μg表皮生长因子(EGF)、1mg雌二醇，M199采卵液定容至1L。
(2)按照常规方式收集父本精液，将离体的父本精液采用精子活力增强液浸泡30min后，2000rpm离心10min，精子活力增强液清洗精子沉淀后再次2000rpm离心10min，最后将沉淀用精子上浮液悬浮，制成精子悬液，备用；
所述精子活力增强液的配方如下：胚胎培养水97ml、MgSO4·7H2O 0.02g、KCl0.05g、链霉素0.005g、青霉素0.006g、NaHCO3 0.04g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g、FBS 3ml。
所述精子上浮液的配方如下：胚胎培养水100ml、MgSO4·7H2O 0.02g、KCl 0.06g、NaHCO3 0.04g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g。
S3，将成熟卵母细胞与精子悬液采用胞浆单精子注射ICSI方式进行体外受精，并将受精卵体外培养至杂交囊胚形态，最后将杂交囊胚移植入母本体内，使杂交囊胚在母本体内发育至自然分娩，获得杂种F1代；需要说明的是，S3步骤采用常规的ICSI方法、常规杂交囊胚培养和移植方法；
S4，从杂种F1代中选择综合性状优良的个体作为父本，与母本回交，回交步骤参照S2-S3，获得回交一代；
S5，重复S4的步骤，即回交后代与母本多次回交，直至满足育种目标时，横交固定，得到具有优良性状的新品种(系)。
新品种(系)特性如下：周岁公羊体重35kg以上，体高60cm以上，体长66cm以上，胸围75.5cm左右；周岁母羊体重30.5kg以上，体高55cm以上，体长63cm以上，胸围70cm左右；10月龄公母羊平均屠宰率45％左右，净肉率35％左右；母羊产羔率180％以上。
母本(吕梁黑山羊)特性如下：全身被毛黑色，长而光亮；体质结实，体格中等；母羊周岁体重24.51kg，体高53.00cm，体长59.77cm，胸围67.62cm；母羊成年体重32.64kg，体高56.64cm，体长64.09cm，胸围82.86cm；羊肉肉质鲜美，10月龄公母羊平均屠宰率41％，净肉率33％；产羔率130％。
父本(金堂黑山羊)特性如下：全身被毛黑色，富有光泽；体型大，结构匀称；生长快，适应性和抗病力强；公羊周岁体重41.38kg，成年体重70.64kg；周岁公羊胴体重19.36kg，屠宰率48.10％，净肉率35.91％。
实施例2
一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，与实施例1的操作基本相同，区别在于：
所述精子活力增强液的配方如下：胚胎培养水97ml、MgSO4·7H2O 0.02g、KCl0.05g、链霉素0.005g、青霉素0.006g、NaHCO3 0.04g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g、FBS 3ml、Hepes 0.5g。
所述精子上浮液的配方如下：胚胎培养水100ml、MgSO4·7H2O 0.03g、KCl 0.06g、NaHCO3 0.05g、丙酮酸钠0.005g、CaCl2·2H2O 0.02g。
所述受精卵培养杂交囊胚之前进行冷冻-解冻处理步骤，具体条件为：将受精卵从室温20℃以0.5℃/min降温至-15℃，再以0.5℃/min升温至室温20℃，然后进行杂交囊胚培养，该步骤可以淘汰掉质量差的受精卵，提高存活受精卵的低温耐受率，保证存活受精卵具有较好的杂交囊胚成活率。
实验1不同精子活力增强液对精子质量的影响
(1)实验组设置
A组采用实施例1的精子活力增强液配方。
B组的精子活力增强液配方：胚胎培养水97ml、MgSO4·7H2O 0.02g、KCl 0.05g、链霉素0.005g、青霉素0.006g、NaHCO3 0.04g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g、FBS 3ml、Hepes 0.5g。
C组的精子活力增强液配方：胚胎培养水100ml。
D组的精子活力增强液配方：精子稀释液(温州市康泰生物科技有限公司，批准文号：浙温食药监械(准)字2012第1400034号，产品编号：59400356855)。
(2)实验过程及结果：将同一只离体的金堂黑山羊精液分为4份，分别将A-D组精子活力增强液与等体积的山羊精液混合均匀后浸泡30min，测试精子质量，结果如表1所示。由表1可知，A组和B组处理后，山羊精子活力高、畸形率低，具有较高的受精潜力。
表1不同精子活力增强液对山羊精子质量的影响
实验2不同精子上浮液对精子质量的影响
(1)实验组设置
a组采用实施例1的精子上浮液配方。
b组的上浮液配方：胚胎培养水100ml。
c组的上浮液配方：精子稀释液(温州市康泰生物科技有限公司，批准文号：浙温食药监械(准)字2012第1400034号，产品编号：59400356855)。
(2)实验过程及结果：将同一只离体的金堂黑山羊精液分为3份，分别将a-c组的精子上浮液与等体积的羊精液混合均匀，2000rpm离心10min，沉淀用各组对应的精子上浮液500μL悬浮，得到的精子悬液用于测试精子质量，结果如表2所示。由表2可知，a组处理后，山羊精子活力高、畸形率低，具有较高的受精潜力。
表2不同精子上浮液对山羊精子质量的影响
实验3受精卵培养杂交囊胚之前的冷冻-解冻处理步骤对受精卵、囊胚质量的影响
我们选择健康状况良好的母山羊和公山羊品种，以实施例1方法获得的受精卵为实验对象，然后分别设置对照组和实验组。对照组直接采用实施例1的方法将受精卵培养为杂交囊胚。实验组将受精卵从室温(20℃)以0.5℃/min降温至-15℃，再以0.5℃/min升温至室温(20℃)，然后采用实施例1的方法将受精卵培养为杂交囊胚。对照组和实验组均将杂交囊胚植入母山羊体内比较对照组与实验组的杂交囊胚养成率和杂交囊胚成活率。需要说明的是，对照组和实验组选择的待移植的两个母本为同品种且健康状况、生理状况基本相同母山羊。实验结果如表3所示。实验组虽然形成的杂交囊胚数量较少，但是其成活率高，说明受精卵培养杂交囊胚之前的冷冻-解冻处理步骤可以淘汰掉质量差的受精卵，提高存活受精卵的低温耐受率，保证存活受精卵形成的杂交囊胚具有较好的杂交囊胚成活率。
表3不同处理方式下杂交囊胚养成率和杂交囊胚成活率
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，选择肉用性能良好的山羊品种作为母本，选择体格大的山羊品种作为父本；
S2，将离体的母本卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；
将父本离体的精液采用精子活力增强液浸泡30-40min后，2000rpm离心10-15min，精子活力增强液清洗精子沉淀后再次2000rpm离心10-15min，最后将沉淀用精子上浮液悬浮，制成精子悬液；
所述精子活力增强液的配方如下：胚胎培养水97ml、MgSO4·7H2O 0.02～0.03g、KCl0.05～0.06g、链霉素0.005g、青霉素0.006g、NaHCO3 0.04～0.05g、丙酮酸钠0.004g、CaCl2·2H2O 0.02g、FBS 3ml；
S3，将成熟卵母细胞与精子悬液进行体外受精，并将受精卵体外培养至杂交囊胚形态，最后将杂交囊胚移植入母本体内，使杂交囊胚在母本体内发育至自然分娩，获得杂种F1代；
S4，从杂种F1代中选择综合性状优良的个体作为父本，与母本回交，回交步骤参照S2-S3，获得回交一代；
S5，重复S4的步骤，即回交后代与母本多次回交，直至满足育种目标时，横交固定，得到具有优良性状的新品种/系。
2.根据权利要求1所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，S1中选择的母本为吕梁黑山羊、太行黑山羊或者灵丘青背山羊；选择的父本为金堂黑山羊、沧山黑山羊或者云岭黑山羊。
3.根据权利要求2所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，所述精子活力增强液还包含0.5g的Hepes。
4.根据权利要求2所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，所述精子上浮液的配方如下：胚胎培养水100ml、MgSO4·7H2O 0.02～0.03g、KCl 0.05～0.06g、NaHCO3 0.04～0.05g、丙酮酸钠0.004～0.005g、CaCl2·2H2O 0.02g。
5.根据权利要求1所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，体外受精方式为自然受精方式或者胞浆单精子注射ICSI方式。
6.根据权利要求1所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，所述受精卵培养杂交囊胚之前进行冷冻-解冻处理步骤，具体条件为：将受精卵从室温以0.5℃/min降温至-15℃，再以0.5℃/min升温至室温，然后进行杂交囊胚培养。
7.根据权利要求1所述的肉用山羊的人工繁殖-杂交联合育种方法，其特征在于，S2中，对母本进行促排卵处理后收集卵母细胞，然后将卵母细胞体外培养至含有第一极体的成熟卵母细胞，备用。
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